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摘要 [目的] 研究大鲵皮肤分泌物的气味成分及其除臭方法。[方法] 采用静态顶空法从大鲵皮肤分泌物中收集气体，经气质联用色谱分析挥发性成分，并利用乙醇溶解、蛋白酶解、活性炭吸附的方法对其进行脱臭。[结果] 大鲵皮肤分泌物气味成分共有9种挥发性物质，包括二甲基二硫醚（C2H6S2）和8种脂类化合物；大鲵分泌物中臭味成分为二甲基二硫醚。不同方法对大鲵皮肤分泌物的脱臭效果由高到低依次为乙醇>复合酶解>活性炭。大鲵皮肤分泌物经过乙醇脱臭和酶解脱臭后，无臭味，均未检出二甲基二硫醚。[结论]该研究可为大鲵资源的开发和利用奠定基础。
关键词 大鲵；分泌物；气体；静态顶空法；GC/MS；脱臭
中图分类号 S865.3+9 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）35-12537-02
大鲵（Andrias davidianus）属于大型两栖纲、有尾目、隐鳃鲵科[1]。大鲵皮肤分布有颗粒腺和粘液腺，当机体受到外界不良刺激时，能分泌白色粘稠状液体，并带有一定特殊性臭味[2]。自然界中，生物体经常通过自身分泌的气味来进行生物信息传递和交换，特别是在避敌、引诱、觅食、导航以及维持群居的动物社会等方面气味的作用尤为突出[3]。动物气味主要源于气味腺、唾液、尿和粪便等，其成分包括烷烃类、烯烃类、酯类、醛类、酮类、醇类、有机酸、脂肪族胺类及芳香化合物等[4-5]，其中己醛、己醇、硬脂醇、十六烷酸和脂肪族胺类成分在动物气味中较为常见[6-7]。目前，检测挥发性气味最常用的方法有气相色谱法（GC）、气-质联用法（GC-MS）和气体光谱分析法，在分析测定前常常采用固相微萃取法、吹扫捕集法及顶空气体捕集法等的对气味进行采集[8-9]。动物气味大多都有毒性，其中还有一些挥发性有机酸、脂肪族胺类以及含硫挥发性成分，具有特殊的气味特征[5]。动物气味中呈现臭味是通过发臭基团（如硫基、羰基等）刺激嗅觉细胞， 使人感到厌恶和不愉快[10-11]。臭味物质主要成分有硫醇类、硫醚类、硫化氢、氨、胺类和吲哚类等，如甲硫醇、甲硫醚、二甲基二硫醚、二硫化碳和碳基硫等[12-13]。
大鲵皮肤分泌物具有抗菌、抗氧化和抗肿瘤等活性作用[14-15]，是天然药物资源开发的丰富来源，可通过活体人工采集进行开发利用。但是大鲵皮肤分泌物中的特殊性臭味物质及其毒性，目前尚未见报道，这对于其利用受到限制。因此，要合理利用大鲵皮肤分泌物资源，有效脱去分泌物中的臭味是非常必要的。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
1.1.1
材料与试剂。活体大鲵，由陕西汉源生物科技有限公司提供；酸性蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶，购自宁夏和氏璧生物技术有限公司；胃蛋白酶、胰蛋白酶，购自西安-沃尔森生物技术有限公司；其他试剂均为分析纯。
1.1.2
仪器。
GC6890N/MSD5973N联用仪（Agilent公司）；DZF-6050型真空干燥箱（上海-恒科技有限公司）；LC-800低速离心机（科大创新股份有限公司）；FA2004N电子天平；KQ-100DA超声清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）；601超级水浴（江苏-瑞华仪有限公司）。
1.2 试验方法
1.2.1 大鲵皮肤分泌物气体成分分析。
1.2.1.1 机械刺激分泌物。
采用机械刺激法收集大鲵皮肤分泌物。用软毛刷轻轻拍打或按摩大鲵背部、尾部等皮肤分泌腺较多部位，对其进行温和刺激，使大鲵分泌产生白色分泌物，并刮取分泌物，装入大鲵分泌物收集瓶中。
1.2.1.2 静态顶空法收集气体。
将气体采集瓶松开瓶盖，用热风机加热，排除内部瓶中空气，迅速放入5 g分泌液于收集瓶中，旋紧瓶盖，在-20 ℃冷冻条件下保存。检测时，将样品瓶置于恒温水浴锅内平衡一段时间，使其上部顶空的气体与样品中的组分达到相平衡，然后用采样器抽取瓶顶空的气体，迅速注入色谱仪的进样室中进行色谱分析[16]。
1.2.1.3 气体检测方法[17-18]。
（1）色谱条件。
色谱柱：HP-5（30.00 m×0.32 mm×0.25 μm）弹性石英毛细管柱；程序升温：以4 ℃/min的升温速率由80 ℃程序升温至290 ℃，恒温30 min；进样口温度为250 ℃；载气（He）流量为1.0 ml/min。
（2）质谱条件。
传输线温度：280 ℃；MSD 离子源为EI源，离子源温度为230 ℃；四极杆温度为150 ℃；电子能量：70 eV；质量扫描范围（m/z）为35～350。
（3）气体检测。将气体采样器注入气质联用仪中，进行分析检测，然后将检测结果与美国NIST05谱库进行比对，确定气质联用仪分析的气体成分。
1.2.2 大鲵皮肤分泌物脱臭处理方法研究。
1.2.2.1 乙醇脱臭。取5 g大鲵皮肤分泌分泌物于三角瓶中，加入20 ml 95%乙醇震荡洗涤30 min，过滤，将分泌物烘干，真空浓缩乙醇回收，真空干燥上清液和不溶物，感官评价气味，采用GC-MS方法检测气体成分。
1.2.2.2 酶法脱臭。
分别取5 g大鲵皮肤分泌分泌物加入5个50 ml三角瓶中，并加入50 ml去离子水，超声30 min溶解，分别加入0.5%碱性蛋白酶，pH 9；0.5%酸性蛋白酶，pH 3；0.5%胰蛋白酶，pH 8，0.5%胃蛋白酶，pH 5，水浴温度35 ℃，2 h。酶解物经过85 ℃ 30 min灭酶，离心分离，分别对上清和不溶物真空干燥，感官评价气味，采用GC-MS方法检测气体成分。
1.2.2.3 活性炭脱臭。
取5 g大鲵皮肤分泌物加入含50 ml去离子水的三角瓶中，分别取活性炭与绿茶各1 g，包裹于纱布中，放入三角瓶内密封保持48 h，真空干燥，感官评价气味，采用GC-MS方法检测气体成分。 2 结果与分析
2.1 大鲵皮肤分泌物气体成分的检测结果
大鲵皮肤分泌物挥发性成分的GC-MS色谱图如图1所示。
与美国NIST05谱库比对，大鲵分泌物中挥发性气体成分见表1。由表1可知，共检测出10种挥发性物质，其中包括二甲基二硫醚（C2H6S2）、CO2和8种脂类化合物。CO2可能为气体收集时捕集的空气中成分；二甲基二硫醚是一种有机硫化物，有恶臭，不溶于水，易溶于乙醇、乙醚和烃类，易分解，毒性较低，仅为乙硫醇毒性的0.1%[19]。其余8种成分为脂类化合物，无臭味，无毒性。
2.2 大鲵皮肤分泌物脱臭处理结果
由表2可知，通过对乙醇脱臭、酶解脱臭、活性炭脱臭方法进行比较，大鲵皮肤分泌物经乙醇脱臭后真空干燥后无异味，GC-MS未检出二甲基二硫醚；胃蛋白酶酶解皮肤分泌物真空干燥后，无臭味而有鲜香味，GC-MS未检出二甲基二硫醚，其他几种酶水解后有臭味，未做二甲基二硫醚的GC-MS检测；活性炭脱臭后仍有臭味，GC-MS检出二甲基二硫醚。
3 讨论
大鲵皮肤分泌物具有特殊性臭味和较强的粘性，是用于驱逐天敌的自我保护的机制。目前，对生物样品的脱臭方法少见报道，一般对臭味的脱臭方法主要有物理脱臭、化学脱臭和生物脱臭法等[11，20]。但是，加入化学物质脱臭和生物过滤脱臭及土壤脱臭方法，不仅影响分泌物的结构和活性，且还会造成除去这些物质的困难而使工艺复杂化，因此并不适用该试验中大鲵分泌物的除臭操作。此外，欧阳昌荣等[21]报道通过碱性乙醇洗涤和减压脱臭的方法能较好地脱去鱼油中的臭味。对分泌物的气质联用色谱分析表明，臭味气体成分为二甲基二硫醚，具有低毒性，易溶于乙醇、乙醚，易分解的性质。因此，根据大鲵分泌物的性质，采用乙醇脱臭、活性炭脱臭及酶解脱臭的方法，并利用真空干燥辅助脱臭，能简单有效地脱去分泌物中的臭味成分，并保持分泌物的营养成分不会损失，有利于分泌物的充分利用。分泌物脱臭方法比较结果表明，乙醇脱臭效果最佳，二甲基二硫醚溶解乙醇，真空浓缩及干燥时被抽出，无臭味，并经GC-MS未检出二甲基二硫醚。胃蛋白酶水解分泌物脱臭，使分泌物蛋白在酶的作用下，水解产生多肽等小分子鲜味物质，有利于臭味成分的去除并增加其鲜香味。在活性炭脱臭过程中，为避免活性炭与分泌物接触后不易分离，从而使活性炭并不能充分吸附分泌物内部臭味成分，脱臭效果略差。
大鲵皮肤分泌物挥发气味成分为二甲基二硫醚和8种脂肪酸。大鲵皮肤分泌物经过乙醇脱臭和酶解脱臭后，无臭味，2种脱臭方法均未检出二甲基二硫醚，能够有效除去其中二甲基二硫醚有毒成分，有利于大鲵食用时去除其中的有害成分，并为大鲵资源的开发和利用奠定基础。
参考文献
[1]
雒林通，万红玲，兰小平，等.中国大鲵资源现状及保护遗传学研究进展[J].广东农业科学，2011（17）：100-103.
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[3] ZINI C A，AUGUSTO F，CHRISTENSEN T E，et al.Monitoring biogenic volatile compounds emitted by Eucalyptus citriodora using SPME[J].Analytical Chemistry，2001，73（19）：4729-4735.
[4] 王建礼，安书成，邰发道.哺乳动物个体气味的形成[J].生物学通报，2005，40（7）：18-19.
[5] 张卓旻，朱丽，李攻科.生物“气味”研究进展[J].大学化学，2011，26（4）：1-6.
[6] 刘佳.两种海洋节肢动物风味物质的分析与评价[J].食品科技，2008（2）：98-100.
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[10] 付钟，何品晶，李国建.恶臭的治理方法──生物脱臭法[J].环境卫生工程，1997（1）：3-7.
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[15] 郭文韬.大鲵遗传多样性及皮肤附属物特性研究[D].武汉：华中科技大学，2013：1007-1010.
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[18] 陈俊卿，王锡昌.固相微萃取与气质联用法分析鱼肉中气味成分[J].广州食品工业科技，2004，20（3）：117-118.
[19] 曹国强，郑辉东，邹文虎，等.活性炭液相吸附脱除二甲基二硫醚[J].化工进展，2012，31（6）：1357-1361.
[20] 林利忠，林亲录，梁盈.植物油脱臭馏出物中生物活性成分提取方法研究进展[J].食品与机械，2012，28（6）：256-271.
[21] 欧阳昌荣，林洪，薛长湖.鱼油异味成分分析与脱除方法研究进展[J].海洋科学，2000（1）：29-32.
关键词 大鲵；分泌物；气体；静态顶空法；GC/MS；脱臭
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大鲵（Andrias davidianus）属于大型两栖纲、有尾目、隐鳃鲵科[1]。大鲵皮肤分布有颗粒腺和粘液腺，当机体受到外界不良刺激时，能分泌白色粘稠状液体，并带有一定特殊性臭味[2]。自然界中，生物体经常通过自身分泌的气味来进行生物信息传递和交换，特别是在避敌、引诱、觅食、导航以及维持群居的动物社会等方面气味的作用尤为突出[3]。动物气味主要源于气味腺、唾液、尿和粪便等，其成分包括烷烃类、烯烃类、酯类、醛类、酮类、醇类、有机酸、脂肪族胺类及芳香化合物等[4-5]，其中己醛、己醇、硬脂醇、十六烷酸和脂肪族胺类成分在动物气味中较为常见[6-7]。目前，检测挥发性气味最常用的方法有气相色谱法（GC）、气-质联用法（GC-MS）和气体光谱分析法，在分析测定前常常采用固相微萃取法、吹扫捕集法及顶空气体捕集法等的对气味进行采集[8-9]。动物气味大多都有毒性，其中还有一些挥发性有机酸、脂肪族胺类以及含硫挥发性成分，具有特殊的气味特征[5]。动物气味中呈现臭味是通过发臭基团（如硫基、羰基等）刺激嗅觉细胞， 使人感到厌恶和不愉快[10-11]。臭味物质主要成分有硫醇类、硫醚类、硫化氢、氨、胺类和吲哚类等，如甲硫醇、甲硫醚、二甲基二硫醚、二硫化碳和碳基硫等[12-13]。
大鲵皮肤分泌物具有抗菌、抗氧化和抗肿瘤等活性作用[14-15]，是天然药物资源开发的丰富来源，可通过活体人工采集进行开发利用。但是大鲵皮肤分泌物中的特殊性臭味物质及其毒性，目前尚未见报道，这对于其利用受到限制。因此，要合理利用大鲵皮肤分泌物资源，有效脱去分泌物中的臭味是非常必要的。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
1.1.1
材料与试剂。活体大鲵，由陕西汉源生物科技有限公司提供；酸性蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶，购自宁夏和氏璧生物技术有限公司；胃蛋白酶、胰蛋白酶，购自西安-沃尔森生物技术有限公司；其他试剂均为分析纯。
1.1.2
仪器。
GC6890N/MSD5973N联用仪（Agilent公司）；DZF-6050型真空干燥箱（上海-恒科技有限公司）；LC-800低速离心机（科大创新股份有限公司）；FA2004N电子天平；KQ-100DA超声清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）；601超级水浴（江苏-瑞华仪有限公司）。
1.2 试验方法
1.2.1 大鲵皮肤分泌物气体成分分析。
1.2.1.1 机械刺激分泌物。
采用机械刺激法收集大鲵皮肤分泌物。用软毛刷轻轻拍打或按摩大鲵背部、尾部等皮肤分泌腺较多部位，对其进行温和刺激，使大鲵分泌产生白色分泌物，并刮取分泌物，装入大鲵分泌物收集瓶中。
1.2.1.2 静态顶空法收集气体。
将气体采集瓶松开瓶盖，用热风机加热，排除内部瓶中空气，迅速放入5 g分泌液于收集瓶中，旋紧瓶盖，在-20 ℃冷冻条件下保存。检测时，将样品瓶置于恒温水浴锅内平衡一段时间，使其上部顶空的气体与样品中的组分达到相平衡，然后用采样器抽取瓶顶空的气体，迅速注入色谱仪的进样室中进行色谱分析[16]。
1.2.1.3 气体检测方法[17-18]。
（1）色谱条件。
色谱柱：HP-5（30.00 m×0.32 mm×0.25 μm）弹性石英毛细管柱；程序升温：以4 ℃/min的升温速率由80 ℃程序升温至290 ℃，恒温30 min；进样口温度为250 ℃；载气（He）流量为1.0 ml/min。
（2）质谱条件。
传输线温度：280 ℃；MSD 离子源为EI源，离子源温度为230 ℃；四极杆温度为150 ℃；电子能量：70 eV；质量扫描范围（m/z）为35～350。
（3）气体检测。将气体采样器注入气质联用仪中，进行分析检测，然后将检测结果与美国NIST05谱库进行比对，确定气质联用仪分析的气体成分。
1.2.2 大鲵皮肤分泌物脱臭处理方法研究。
1.2.2.1 乙醇脱臭。取5 g大鲵皮肤分泌分泌物于三角瓶中，加入20 ml 95%乙醇震荡洗涤30 min，过滤，将分泌物烘干，真空浓缩乙醇回收，真空干燥上清液和不溶物，感官评价气味，采用GC-MS方法检测气体成分。
1.2.2.2 酶法脱臭。
分别取5 g大鲵皮肤分泌分泌物加入5个50 ml三角瓶中，并加入50 ml去离子水，超声30 min溶解，分别加入0.5%碱性蛋白酶，pH 9；0.5%酸性蛋白酶，pH 3；0.5%胰蛋白酶，pH 8，0.5%胃蛋白酶，pH 5，水浴温度35 ℃，2 h。酶解物经过85 ℃ 30 min灭酶，离心分离，分别对上清和不溶物真空干燥，感官评价气味，采用GC-MS方法检测气体成分。
1.2.2.3 活性炭脱臭。
取5 g大鲵皮肤分泌物加入含50 ml去离子水的三角瓶中，分别取活性炭与绿茶各1 g，包裹于纱布中，放入三角瓶内密封保持48 h，真空干燥，感官评价气味，采用GC-MS方法检测气体成分。 2 结果与分析
2.1 大鲵皮肤分泌物气体成分的检测结果
大鲵皮肤分泌物挥发性成分的GC-MS色谱图如图1所示。
与美国NIST05谱库比对，大鲵分泌物中挥发性气体成分见表1。由表1可知，共检测出10种挥发性物质，其中包括二甲基二硫醚（C2H6S2）、CO2和8种脂类化合物。CO2可能为气体收集时捕集的空气中成分；二甲基二硫醚是一种有机硫化物，有恶臭，不溶于水，易溶于乙醇、乙醚和烃类，易分解，毒性较低，仅为乙硫醇毒性的0.1%[19]。其余8种成分为脂类化合物，无臭味，无毒性。
2.2 大鲵皮肤分泌物脱臭处理结果
由表2可知，通过对乙醇脱臭、酶解脱臭、活性炭脱臭方法进行比较，大鲵皮肤分泌物经乙醇脱臭后真空干燥后无异味，GC-MS未检出二甲基二硫醚；胃蛋白酶酶解皮肤分泌物真空干燥后，无臭味而有鲜香味，GC-MS未检出二甲基二硫醚，其他几种酶水解后有臭味，未做二甲基二硫醚的GC-MS检测；活性炭脱臭后仍有臭味，GC-MS检出二甲基二硫醚。
3 讨论
大鲵皮肤分泌物具有特殊性臭味和较强的粘性，是用于驱逐天敌的自我保护的机制。目前，对生物样品的脱臭方法少见报道，一般对臭味的脱臭方法主要有物理脱臭、化学脱臭和生物脱臭法等[11，20]。但是，加入化学物质脱臭和生物过滤脱臭及土壤脱臭方法，不仅影响分泌物的结构和活性，且还会造成除去这些物质的困难而使工艺复杂化，因此并不适用该试验中大鲵分泌物的除臭操作。此外，欧阳昌荣等[21]报道通过碱性乙醇洗涤和减压脱臭的方法能较好地脱去鱼油中的臭味。对分泌物的气质联用色谱分析表明，臭味气体成分为二甲基二硫醚，具有低毒性，易溶于乙醇、乙醚，易分解的性质。因此，根据大鲵分泌物的性质，采用乙醇脱臭、活性炭脱臭及酶解脱臭的方法，并利用真空干燥辅助脱臭，能简单有效地脱去分泌物中的臭味成分，并保持分泌物的营养成分不会损失，有利于分泌物的充分利用。分泌物脱臭方法比较结果表明，乙醇脱臭效果最佳，二甲基二硫醚溶解乙醇，真空浓缩及干燥时被抽出，无臭味，并经GC-MS未检出二甲基二硫醚。胃蛋白酶水解分泌物脱臭，使分泌物蛋白在酶的作用下，水解产生多肽等小分子鲜味物质，有利于臭味成分的去除并增加其鲜香味。在活性炭脱臭过程中，为避免活性炭与分泌物接触后不易分离，从而使活性炭并不能充分吸附分泌物内部臭味成分，脱臭效果略差。
大鲵皮肤分泌物挥发气味成分为二甲基二硫醚和8种脂肪酸。大鲵皮肤分泌物经过乙醇脱臭和酶解脱臭后，无臭味，2种脱臭方法均未检出二甲基二硫醚，能够有效除去其中二甲基二硫醚有毒成分，有利于大鲵食用时去除其中的有害成分，并为大鲵资源的开发和利用奠定基础。
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[8] 陈海旭.气体样品收集和测试方法研究与应用[D].西安：西北大学，2010.
[9] KELLY T J，BEEKMAN M.Applicability of canisters for sample storage in the Determination of hazardous air Pollution[J].Atmospheric Environment，1995，29（9）：1007-1010.
[10] 付钟，何品晶，李国建.恶臭的治理方法──生物脱臭法[J].环境卫生工程，1997（1）：3-7.
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[13] AYSEN MUEZZINOGLU.A study of volatile organic sulfur emissions causing urban odors[J].Chemosphere，2003，14（51）：245-252.
[14] 王利锋，李学英，王大忠.大鲵皮肤分泌液中抗菌肽的鉴定及生物活性研究[J].中国生化药物杂志，2011，32（4）：269-272.
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[18] 陈俊卿，王锡昌.固相微萃取与气质联用法分析鱼肉中气味成分[J].广州食品工业科技，2004，20（3）：117-118.
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