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摘要：滑菇子实体多糖（fruiting body polysaccharide，FPS）在抗氧化、增强机体免疫力等方面有重要作用。通过Plackett- Burman试验和响应面方法得到FPS的最佳提取条件：提取次数255，乙醇浓度95%，乙醇倍数322倍，其理论预测值为2488%；对提取参数取整后，其实验值为2453%。在FPS浓度为500 mg/L时，对羟基自由基、超氧阴离子和DPPH的自由基清除率分别为1151%、2337%和2019%，其还原力为011，表明滑菇子实体多糖具有一定抗氧化能力。
关键词：滑菇；子实体多糖；提取；抗氧化
中图分类号：TS244文献标识号：A文章编号：1001-4942（2013）01-0117-05
滑菇（Pholiota nameko）又名光帽鳞伞、光帽黄伞，是一种冬、春季发生的菌盖粘滑的木腐菌，属球盖菇科鳞伞属。在自然界多生长于壳斗科等阔叶树的倒木或树桩上，松木或未完全死亡的阔叶树干上也能生长[1]。子实体含丰富的多糖，能提高机体的免疫力[2，3]。
多糖是自然界中含量最丰富的一种生物聚合物，具有能量储存、结构支持、防御和抗原决定性等功能。多糖是来自于高等动植物细胞膜、微生物细胞壁的天然大分子物质，是所有生命体的重要组成成分与维持生命所必须的结构材料[4]。
提取滑菇子实体多糖的方法应用较多的有常规水提法[2]、酶提取法[5，6]以及超声波辅助法[7]。本研究利用水提法对滑菇子实体多糖进行提取优化，以提高多糖得率，并对其体外抗氧化活性进行检测。
1材料与方法
11材料、试剂与仪器
111材料滑菇（泰安某超市购买）。
112 试剂盐酸，氢氧化钠，无水乙醇，乙醇（75%、85%、95%），苯酚，浓硫酸，去离子水，DPPH，磷酸缓冲液（pH 66、pH 74），磷酸氢二钠，磷酸二氢钠，Tris-HCl，邻苯三酚，Vc（5%），邻二氮菲，硫酸亚铁，氯化铁，铁氰化钾，过氧化氢。
113 仪器752-N 紫外可见分光光度计，DZF-6021 型真空干燥箱，DK-S24 型恒温水浴锅，TGL–16B 型离心机，电子天平，粉碎机。
12试验方法
121粗多糖提取滑菇子实体经烘干、粉碎得滑菇粉末。称取1 g滑菇粉末，放入烧杯中加入去离子水，在不同温度和时间下浸提，浸提过程中要不断搅拌。提取液中加入不同浓度乙醇，在不同温度和时间条件下醇沉，得沉淀即为粗多糖，保存于冰箱中待用。
122多糖含量测定苯酚硫酸法[8]。准确称取01 g干燥至恒重的标准葡萄糖，加蒸馏水定容至100 ml容量瓶，从中吸取10 ml 再定容至100 ml容量瓶，即得100 mg/L的标准葡萄糖溶液。精密吸取标准溶液02、04、06、08、10、12 ml，各以水补充至20 ml，加入6%苯酚（6%，新蒸）10 ml及浓硫酸50 ml，静止10 min，摇匀，室温放置20 min，另精密量取20 ml蒸馏水同法操作，作为空白对照。在可见分光光度计测OD490nm值，以OD值（Y）对葡萄糖含量（X）回归，得回归曲线方程：
Y=00147X – 00137 （R2 =0998） （1）
123Plackett–Burman（PB）试验采用9因素3水平的PB试验设计，PB试验因素水平及编码见表1。利用 Microsoft Excel对试验数据进行回归分析。
124响应面优化根据PB试验结果以及Box-Behnken的中心组合试验设计原理，选择对响应值（子实体多糖提取量）影响显著的提取次数、乙醇浓度、乙醇倍数进行下一步试验。每一自变量的低、中、高试验水平分别以–1、0、1进行编码。该模型通过最小二乘法拟合二次多项方程可以表达为：
YFPS=A0+∑Ai Xi+∑AiiXi2+∑AijXiXj（2）
式中：YFPS为响应值（多糖得率），A0、Ai、Aii、Aij为方程系数，Xi、Xj（i≠j）为自变量编码值。
125抗氧化活性测定
①清除羟自由基（·OH）：采用邻二氮菲-Fe2+氧化法[9]。吸取15 ml邻二氮菲溶液（5 mmol/L），加入pH 74（075 mol/L）磷酸钠缓冲液4 ml ，充分混匀。再加入 FeSO4溶液（75 mmol/L） 1 ml ，立即混匀。分别加入不同浓度的样品溶液4 ml ，立即混匀。加入15 ml去离子水，以补充体积。最后加入H2O2溶液（1%）1 ml，以去离子水代替H2O2溶液作为空白对照，轻轻混匀，37℃保温90 min，于536 nm测定吸光度，BHT作阳性对照。
羟基自由基清除率计算公式：
·OH清除率（%）=（A加药-AH2O2）/（A未损-AH2O2）×100 （3）
式中：吸光度A加药为加入样品（抗氧化剂）及H2O2，AH2O2为加H2O2而不加抗氧化剂，A未损为两者都不加。
②清除超氧阴离子自由基（O-·2）[10]：反应的终体积是10 ml，各试剂是：邻苯三酚（3 mmol/L）05 ml ，多糖溶液（200、400、600、800、1000 mg/L）05 ml，Tris-HCl溶液（005 mmol/L，pH 82）9 ml。混合液在25℃下保持5 min，然后用分光光度计测定其OD420nm值。BHT作阳性对照。
O-·2清除率（%）=[（A0-A1）/A0]×100（4）
式中：A0为未加清除剂的吸光值； A1为加清除剂后的吸光值。
③清除DPPH自由基[11]：将不同浓度的多糖溶液2 ml与DPPH溶液（0 2 mmol/L ）2 ml 均匀混合，30 min后在525 nm处测定其吸光度Ai，同时按照该方法测定2 ml DPPH溶液（02 mmol/L ）与2 ml蒸馏水混合后的吸光度Ac，以及2 ml不同浓度多糖溶液与2 ml蒸馏水混合后的吸光度Aj。BHT作阳性对照。 清除率（%）=[1-（Ai -Aj）/Ac]×100（5）
④总还原力能力（T-AOC）：采用普鲁士兰法[12]。取试样1 ml，加磷酸缓冲液（02 mol/L，pH 66）25 ml和铁氰化钾溶液（质量分数1%）25 ml，混合后50℃放置20 min，取出后流水冷却，加入三氯乙酸溶液（质量分数10%）25 ml混合，3 000 r/min离心10 min后取混合液25 ml，加入蒸馏水25 ml和氯化铁25 ml（质量分数01%），混匀，静置10 min，以蒸馏水作为无还原能力的样品对照调零，在700 nm处测定吸光度。吸光度越高，抗氧化性越好，还原力越强。BHT作阳性对照。
2结果与分析
21滑菇子实体多糖的提取优化
211PB 单因子试验PB试验结果见表3，分析结果见表4。从表4可以看出，乙醇浓度、乙醇倍数、提取次数的P值分别为00021、00432和00001，表明该模型极显著，即回归偏差平方和所反映的波动明显比剩余偏差平方和所反映的波动大，说明线型模型能够很好地反映变量与自变量之间的变化规律。P值反映出各因素对多糖得率的影响，从中选出乙醇浓度、乙醇倍数和提取次数3个因素进行下一步的响应面试验。
212响应面优化[13]在响应面试验中，利用Response surface methodology（RSM）对提取次数、乙醇浓度和乙醇倍数3个因素进行优化（表5）。方差分析显示，模型极显著（P=00014），失拟值不显著（P=00548），R2=09429，说明模型和现实的拟合程度很好。X1X2、X2X3、X1X3三个二次项不显著，说明因素之间的影响不明显，X32二次项极显著，说明此因素影响显著。X22不显著，说明此因素影响不明显。R-adj2=08695，说明该模型与实际试验拟合程度不高，自变量和响应值之间线性关系不明显（表6）。
22滑菇子实体多糖的抗氧化活性
221清除羟基自由基（·OH）由图1可见，滑菇多糖对·OH具有一定的清除作用，清除率随着浓度的增加而缓慢上升。当滑菇多糖浓度为500 mg/L时，其清除率为1151%，相当于BHT浓度为125 mg/L时的清除率。而BHT在0～500 mg/L之间清除率随着浓度的增加而快速上升，到达500 mg/L时，清除率达到6083%。
222清除超氧阴离子（O-·2） 由图2可见，滑菇子实体多糖对O-·2的清除作用比较好，当滑菇多糖在0～300 mg/L之间时其清除率上升较缓慢，300～500 mg/L之间的清除率上升较快，到达500 mg/L时，清除率到达2337%。而BHT在0～300 mg/L之间时其清除率上升较快，之后上升较缓，到达500 mg/L时，清除率到达601%。
223清除DPPH自由基由图3可见，随着浓度的升高，清除率持续平稳上升，达到500 mg/L时，清除率达2019%。而BHT对DPPH自由基的清除作用强于多糖，在0～300 mg/L之间时其清除率上升较快，之后随着浓度升高清除率呈波动上升，到达500 mg/L时，清除率达5955%。
224还原力还原力是表示抗氧化物质提供电子能力的重要指标，抗氧化物质通过提供电子可使自由基变为稳定的分子，从而失去活性。抗氧化活性同还原力是密切相关的，在700 nm下比色，以吸光值表示还原力的大小，吸光度值越大，表明样品的还原力越强。
由图4可见，滑菇子实体多糖的还原力随浓度增加而增强，浓度在0～300 mg/L时，还原力增长缓慢，浓度在300～500 mg/L时，还原力增长开始变快，到达500 mg/L时吸光度值为011。相同浓度下BHT还原力明显高于滑菇子实体多糖。
多糖的最佳提取条件：提取温度80℃，提取次数3次，提取时间70 min，pH 9，加水倍数40，醇沉温度常温，醇沉乙醇浓度95%，醇沉时间16 h，醇沉乙醇倍数3倍。由响应面方法得到FPS的最佳提取条件：提取次数255，乙醇浓度95%，乙醇倍数322倍，其理论预测值为2488%，对提取参数取整后，其实验值为2453%。
以BHT为对照，测定了滑菇子实体多糖对羟基自由基（·OH）、超氧阴离子（O-·2）和DPPH自由基的清除能力，同时用普鲁士蓝法测定总抗氧化能力。结果表明，多糖对·OH、O-·2、DPPH·均具有清除作用，在FPS浓度为500 mg/L时，对羟基自由基、超氧阴离子和DPPH自由基的清除率分别为1151%、2337%和2019%，其还原力为011，表明滑菇子实体多糖具有一定抗氧化能力。参考文献：
[1]黄年来.中国食用菌百科[M].北京：中国农业出版社，1997，141-142.
[2]宁书年，张桂.生物多糖类物质对人体的作用[J].食品科学，2005，613.
[3]臧玉红，牛桂玲，李丽娟，等.滑子菇水溶性多糖提取工艺的研究[J].食品科技，2006，11：116-118.
[4]李海平，王硕.滑菇多糖制备的研究[J].食品科学，2005，26（1）：161-164.
[5]刘立新，张羽男. 滑菇多糖的提取与分析[J]. 黑龙江医药科学，2005，28（4）： 50-51.
[6]宋玉光，李庆章，高学军.滑菇多糖的制备工艺[J].中国生化药物杂志，2002， 23（4）：178-180.
[7]王萍，李德海，孙莉洁，等.超声波辅助法提取滑菇多糖的工艺研究[J].中国食品学报，2008，8（2）： 84-88.
[8]张惟杰.糖复合物生化研究技术[M].杭州：浙江大学出版社，1994，6-7.
[9]赵艳红，李建科，李国秀.天然抗氧化物体外活性评价方法的优选与优化[J].食品科学，2008，29（6）：64-69.
[10]肖华山，何文锡，傅文庆，等.一种用分光光度法检测氧自由基新方法[J].生物化学与生物物理进展，1999，26（2）：180.
[11]王锐，周云，何嵋，等.玫瑰茄粗多糖清除DPPH自由基活性研究[J].中国农学通报，2011，27（8）：128-131.
[12]刘存芳，田光辉.抱茎蓼挥发油成分及其抗菌活性的研究[J].天然产物研究与开发，2007，19（3）： 447-451.山 东 农 业 科 学2013，45（1）：122～125Shandong Agricultural Sciences
关键词：滑菇；子实体多糖；提取；抗氧化
中图分类号：TS244文献标识号：A文章编号：1001-4942（2013）01-0117-05
滑菇（Pholiota nameko）又名光帽鳞伞、光帽黄伞，是一种冬、春季发生的菌盖粘滑的木腐菌，属球盖菇科鳞伞属。在自然界多生长于壳斗科等阔叶树的倒木或树桩上，松木或未完全死亡的阔叶树干上也能生长[1]。子实体含丰富的多糖，能提高机体的免疫力[2，3]。
多糖是自然界中含量最丰富的一种生物聚合物，具有能量储存、结构支持、防御和抗原决定性等功能。多糖是来自于高等动植物细胞膜、微生物细胞壁的天然大分子物质，是所有生命体的重要组成成分与维持生命所必须的结构材料[4]。
提取滑菇子实体多糖的方法应用较多的有常规水提法[2]、酶提取法[5，6]以及超声波辅助法[7]。本研究利用水提法对滑菇子实体多糖进行提取优化，以提高多糖得率，并对其体外抗氧化活性进行检测。
1材料与方法
11材料、试剂与仪器
111材料滑菇（泰安某超市购买）。
112 试剂盐酸，氢氧化钠，无水乙醇，乙醇（75%、85%、95%），苯酚，浓硫酸，去离子水，DPPH，磷酸缓冲液（pH 66、pH 74），磷酸氢二钠，磷酸二氢钠，Tris-HCl，邻苯三酚，Vc（5%），邻二氮菲，硫酸亚铁，氯化铁，铁氰化钾，过氧化氢。
113 仪器752-N 紫外可见分光光度计，DZF-6021 型真空干燥箱，DK-S24 型恒温水浴锅，TGL–16B 型离心机，电子天平，粉碎机。
12试验方法
121粗多糖提取滑菇子实体经烘干、粉碎得滑菇粉末。称取1 g滑菇粉末，放入烧杯中加入去离子水，在不同温度和时间下浸提，浸提过程中要不断搅拌。提取液中加入不同浓度乙醇，在不同温度和时间条件下醇沉，得沉淀即为粗多糖，保存于冰箱中待用。
122多糖含量测定苯酚硫酸法[8]。准确称取01 g干燥至恒重的标准葡萄糖，加蒸馏水定容至100 ml容量瓶，从中吸取10 ml 再定容至100 ml容量瓶，即得100 mg/L的标准葡萄糖溶液。精密吸取标准溶液02、04、06、08、10、12 ml，各以水补充至20 ml，加入6%苯酚（6%，新蒸）10 ml及浓硫酸50 ml，静止10 min，摇匀，室温放置20 min，另精密量取20 ml蒸馏水同法操作，作为空白对照。在可见分光光度计测OD490nm值，以OD值（Y）对葡萄糖含量（X）回归，得回归曲线方程：
Y=00147X – 00137 （R2 =0998） （1）
123Plackett–Burman（PB）试验采用9因素3水平的PB试验设计，PB试验因素水平及编码见表1。利用 Microsoft Excel对试验数据进行回归分析。
124响应面优化根据PB试验结果以及Box-Behnken的中心组合试验设计原理，选择对响应值（子实体多糖提取量）影响显著的提取次数、乙醇浓度、乙醇倍数进行下一步试验。每一自变量的低、中、高试验水平分别以–1、0、1进行编码。该模型通过最小二乘法拟合二次多项方程可以表达为：
YFPS=A0+∑Ai Xi+∑AiiXi2+∑AijXiXj（2）
式中：YFPS为响应值（多糖得率），A0、Ai、Aii、Aij为方程系数，Xi、Xj（i≠j）为自变量编码值。
125抗氧化活性测定
①清除羟自由基（·OH）：采用邻二氮菲-Fe2+氧化法[9]。吸取15 ml邻二氮菲溶液（5 mmol/L），加入pH 74（075 mol/L）磷酸钠缓冲液4 ml ，充分混匀。再加入 FeSO4溶液（75 mmol/L） 1 ml ，立即混匀。分别加入不同浓度的样品溶液4 ml ，立即混匀。加入15 ml去离子水，以补充体积。最后加入H2O2溶液（1%）1 ml，以去离子水代替H2O2溶液作为空白对照，轻轻混匀，37℃保温90 min，于536 nm测定吸光度，BHT作阳性对照。
羟基自由基清除率计算公式：
·OH清除率（%）=（A加药-AH2O2）/（A未损-AH2O2）×100 （3）
式中：吸光度A加药为加入样品（抗氧化剂）及H2O2，AH2O2为加H2O2而不加抗氧化剂，A未损为两者都不加。
②清除超氧阴离子自由基（O-·2）[10]：反应的终体积是10 ml，各试剂是：邻苯三酚（3 mmol/L）05 ml ，多糖溶液（200、400、600、800、1000 mg/L）05 ml，Tris-HCl溶液（005 mmol/L，pH 82）9 ml。混合液在25℃下保持5 min，然后用分光光度计测定其OD420nm值。BHT作阳性对照。
O-·2清除率（%）=[（A0-A1）/A0]×100（4）
式中：A0为未加清除剂的吸光值； A1为加清除剂后的吸光值。
③清除DPPH自由基[11]：将不同浓度的多糖溶液2 ml与DPPH溶液（0 2 mmol/L ）2 ml 均匀混合，30 min后在525 nm处测定其吸光度Ai，同时按照该方法测定2 ml DPPH溶液（02 mmol/L ）与2 ml蒸馏水混合后的吸光度Ac，以及2 ml不同浓度多糖溶液与2 ml蒸馏水混合后的吸光度Aj。BHT作阳性对照。 清除率（%）=[1-（Ai -Aj）/Ac]×100（5）
④总还原力能力（T-AOC）：采用普鲁士兰法[12]。取试样1 ml，加磷酸缓冲液（02 mol/L，pH 66）25 ml和铁氰化钾溶液（质量分数1%）25 ml，混合后50℃放置20 min，取出后流水冷却，加入三氯乙酸溶液（质量分数10%）25 ml混合，3 000 r/min离心10 min后取混合液25 ml，加入蒸馏水25 ml和氯化铁25 ml（质量分数01%），混匀，静置10 min，以蒸馏水作为无还原能力的样品对照调零，在700 nm处测定吸光度。吸光度越高，抗氧化性越好，还原力越强。BHT作阳性对照。
2结果与分析
21滑菇子实体多糖的提取优化
211PB 单因子试验PB试验结果见表3，分析结果见表4。从表4可以看出，乙醇浓度、乙醇倍数、提取次数的P值分别为00021、00432和00001，表明该模型极显著，即回归偏差平方和所反映的波动明显比剩余偏差平方和所反映的波动大，说明线型模型能够很好地反映变量与自变量之间的变化规律。P值反映出各因素对多糖得率的影响，从中选出乙醇浓度、乙醇倍数和提取次数3个因素进行下一步的响应面试验。
212响应面优化[13]在响应面试验中，利用Response surface methodology（RSM）对提取次数、乙醇浓度和乙醇倍数3个因素进行优化（表5）。方差分析显示，模型极显著（P=00014），失拟值不显著（P=00548），R2=09429，说明模型和现实的拟合程度很好。X1X2、X2X3、X1X3三个二次项不显著，说明因素之间的影响不明显，X32二次项极显著，说明此因素影响显著。X22不显著，说明此因素影响不明显。R-adj2=08695，说明该模型与实际试验拟合程度不高，自变量和响应值之间线性关系不明显（表6）。
22滑菇子实体多糖的抗氧化活性
221清除羟基自由基（·OH）由图1可见，滑菇多糖对·OH具有一定的清除作用，清除率随着浓度的增加而缓慢上升。当滑菇多糖浓度为500 mg/L时，其清除率为1151%，相当于BHT浓度为125 mg/L时的清除率。而BHT在0～500 mg/L之间清除率随着浓度的增加而快速上升，到达500 mg/L时，清除率达到6083%。
222清除超氧阴离子（O-·2） 由图2可见，滑菇子实体多糖对O-·2的清除作用比较好，当滑菇多糖在0～300 mg/L之间时其清除率上升较缓慢，300～500 mg/L之间的清除率上升较快，到达500 mg/L时，清除率到达2337%。而BHT在0～300 mg/L之间时其清除率上升较快，之后上升较缓，到达500 mg/L时，清除率到达601%。
223清除DPPH自由基由图3可见，随着浓度的升高，清除率持续平稳上升，达到500 mg/L时，清除率达2019%。而BHT对DPPH自由基的清除作用强于多糖，在0～300 mg/L之间时其清除率上升较快，之后随着浓度升高清除率呈波动上升，到达500 mg/L时，清除率达5955%。
224还原力还原力是表示抗氧化物质提供电子能力的重要指标，抗氧化物质通过提供电子可使自由基变为稳定的分子，从而失去活性。抗氧化活性同还原力是密切相关的，在700 nm下比色，以吸光值表示还原力的大小，吸光度值越大，表明样品的还原力越强。
由图4可见，滑菇子实体多糖的还原力随浓度增加而增强，浓度在0～300 mg/L时，还原力增长缓慢，浓度在300～500 mg/L时，还原力增长开始变快，到达500 mg/L时吸光度值为011。相同浓度下BHT还原力明显高于滑菇子实体多糖。
多糖的最佳提取条件：提取温度80℃，提取次数3次，提取时间70 min，pH 9，加水倍数40，醇沉温度常温，醇沉乙醇浓度95%，醇沉时间16 h，醇沉乙醇倍数3倍。由响应面方法得到FPS的最佳提取条件：提取次数255，乙醇浓度95%，乙醇倍数322倍，其理论预测值为2488%，对提取参数取整后，其实验值为2453%。
以BHT为对照，测定了滑菇子实体多糖对羟基自由基（·OH）、超氧阴离子（O-·2）和DPPH自由基的清除能力，同时用普鲁士蓝法测定总抗氧化能力。结果表明，多糖对·OH、O-·2、DPPH·均具有清除作用，在FPS浓度为500 mg/L时，对羟基自由基、超氧阴离子和DPPH自由基的清除率分别为1151%、2337%和2019%，其还原力为011，表明滑菇子实体多糖具有一定抗氧化能力。参考文献：
[1]黄年来.中国食用菌百科[M].北京：中国农业出版社，1997，141-142.
[2]宁书年，张桂.生物多糖类物质对人体的作用[J].食品科学，2005，613.
[3]臧玉红，牛桂玲，李丽娟，等.滑子菇水溶性多糖提取工艺的研究[J].食品科技，2006，11：116-118.
[4]李海平，王硕.滑菇多糖制备的研究[J].食品科学，2005，26（1）：161-164.
[5]刘立新，张羽男. 滑菇多糖的提取与分析[J]. 黑龙江医药科学，2005，28（4）： 50-51.
[6]宋玉光，李庆章，高学军.滑菇多糖的制备工艺[J].中国生化药物杂志，2002， 23（4）：178-180.
[7]王萍，李德海，孙莉洁，等.超声波辅助法提取滑菇多糖的工艺研究[J].中国食品学报，2008，8（2）： 84-88.
[8]张惟杰.糖复合物生化研究技术[M].杭州：浙江大学出版社，1994，6-7.
[9]赵艳红，李建科，李国秀.天然抗氧化物体外活性评价方法的优选与优化[J].食品科学，2008，29（6）：64-69.
[10]肖华山，何文锡，傅文庆，等.一种用分光光度法检测氧自由基新方法[J].生物化学与生物物理进展，1999，26（2）：180.
[11]王锐，周云，何嵋，等.玫瑰茄粗多糖清除DPPH自由基活性研究[J].中国农学通报，2011，27（8）：128-131.
[12]刘存芳，田光辉.抱茎蓼挥发油成分及其抗菌活性的研究[J].天然产物研究与开发，2007，19（3）： 447-451.山 东 农 业 科 学2013，45（1）：122～125Shandong Agricultural Sciences