【摘 要】
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将分离的牛骨骼肌卫星细胞(BSMSCs)进行体外培养,首先检测泛素结合酶UBE2L3在BSMSCs增殖分化过程中mRNA以及蛋白表达水平的变化.设计UBE2L3的3个干扰RNA(si-UBE2 L3-1、si-UBE2L3-2、si-UBE2L3-3),对干扰效果进行筛选.构建UBE2L3过表达质粒载体pcDNA3.1-UBE2L3(pcDNA-UBE2L3),观察3个不同si-RNA中效果最好以及测序正确的过表达质粒转染BSMSCs.进行EdU检测干扰以及过表达UBE2L3后对细胞增殖的影响;诱导BSM
【机 构】
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天津农学院动物科学与动物医学学院天津市农业动物繁育与健康养殖重点实验室,天津300384
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将分离的牛骨骼肌卫星细胞(BSMSCs)进行体外培养,首先检测泛素结合酶UBE2L3在BSMSCs增殖分化过程中mRNA以及蛋白表达水平的变化.设计UBE2L3的3个干扰RNA(si-UBE2 L3-1、si-UBE2L3-2、si-UBE2L3-3),对干扰效果进行筛选.构建UBE2L3过表达质粒载体pcDNA3.1-UBE2L3(pcDNA-UBE2L3),观察3个不同si-RNA中效果最好以及测序正确的过表达质粒转染BSMSCs.进行EdU检测干扰以及过表达UBE2L3后对细胞增殖的影响;诱导BSMSCs进行分化,用显微镜观察细胞在生长过程中的情况,并且观察分化过程中形成肌管数量以及直径大小.利用qRT-PCR以及Western blot技术分别从mRNA和蛋白表达水平检测BSMSCs的分化标志因子MyoG以及MyHC表达情况.综合分析泛素结合酶UBE2L3对BSMSCs增殖分化的影响.结果 显示:干扰以及过表达UBE2L3后,EdU染色的阳性细胞数与对照组相比差异不显著;将BSMSCs诱导分化,干扰UBE2L3后,肌管的直径与对照组相比显著升高,2个分化标志因子的蛋白表达水平极显著升高(P＜0.01);过表达UBE2L3后,肌管的直径以及数量显著小于对照组,2个分化标志因子的蛋白表达水平显著降低.此试验探明干扰或者过表达UBE2L3蛋白对BSMSCs的增殖没有影响,但对其成肌分化过程具有显著影响.干扰UBE2L3的表达会促进BSMSCs在体外成肌分化过程,过表达UBE2L3会抑制BSMSCs在体外的分化过程.研究结果为进一步探究泛素化途径在牛成肌分化中调控机制研究奠定了基础.
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