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摘要：牛病毒性腹泻病毒是危害养牛业健康发展的瘟病毒属成员。文章对图们市长安镇畜牧兽医站接待病例的诊断过程进行了描述，通过猪瘟胶体金快速检测试纸卡检测患病牛体内“牛病毒性腹泻抗体”水平，从而为诊断牛病毒性腹泻病例提供了一种有意义的检测手段。
关键词：牛病毒性腹泻病毒；胶体金快速检测试纸卡；临床诊断
中图分类号：S85 文献标识码：A 文章编号：1674-0432（2011）-11-0200-1
牛病毒性腹泻病毒（bovine viral diarrhea virus, BVDV）属于黄病毒科，瘟病毒属成员，主要引起牛病毒性腹泻-黏膜病，造成患牛免疫耐受、持续性感染、母牛流产、死胎和畸形胎。20世纪40年代，在加拿大首次发现该病，之后向其他国产蔓延，目前该病呈世界性分布，给养牛业健康发展带来了巨大障碍。为控制牛病毒性腹泻病毒的传播与蔓延，早期诊断是关键，本研究采用猪瘟胶体金快速检测试纸卡检测牛病毒性腹泻抗体水平。
1 材料
30份疑似感染牛病毒性腹泻病毒患牛的抗凝血。猪瘟病毒快速检测试纸卡（货号：M371328）购自克格仪器有限公司；牛病毒性腹泻抗原ELISA检测(血清) 试剂盒（货号：99-43810）购自北京祥龙环宇生物技术有限公司。
2 方法
2.1 应用猪瘟胶体金快速检测试纸卡检测牛病毒性腹泻抗体(血清)
2.1.1 操作步骤 从30份患牛抗凝血中分离血清，将分离的血清加入到猪瘟胶体金快速检测试纸卡的检测孔内，50ul/孔，放置于室温中15min后，观察反应结果。
2.1.2 判定方法 猪瘟胶体金快速检测试纸卡T区（检测线）呈现紫红色，并且C区（对照线）也呈现紫红色时，判定为阳性。当T区不变色，而C区呈现紫红色，则判定为阴性。如果C区不呈现紫红色时，此卡不能使用，为失效检测卡。
2.2 应用牛病毒性腹泻抗原ELISA检测试剂盒检测抗体(血清)
2.2.1 操作步骤
2.2.1.1 编号 将样品对应微孔按序编号，每板应设阴性对照2孔、阳性对照2孔、空白对照1孔，空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同。
2.2.1.2 加样 分别在阴、阳性对照孔中加入阴性对照、阳性对照50μl。然后在待测样品孔先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
2.2.1.3 孵育 用封板膜封板后置37℃孵育30min。
2.2.1.4 洗涤 小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30s后弃去，如此重复5次，拍干。
2.2.1.5 加酶 每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。孵育同2.2.1.3，洗涤同2.2.1.4。
2.2.1.6 显色 每孔先加入显色剂A 50μl，再加入显色剂B 50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15min。
2.2.1.7 终止 每孔加终止液50μl，终止反应(此时蓝色立转黄色)。
2.2.1.8 测定结果 以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。 测定应在加终止液后15min以内进行。
2.2.2 判定方法
2.2.2.1 试验有效性 阳性对照孔平均值≥1.00；阴性对照平均值≤0.10。
2.2.2.2 临界值(CUT OFF)计算 临界值=阴性对照孔平均值+0.15。
2.2.2.3 阴性判定 样品OD值< 临界值(CUT OFF)者为牛病毒性腹泻病毒(BVDV)阴性。
2.2.2.4 阳性判定 样品OD值≥ 临界值(CUT OFF)者为牛病毒性腹泻病毒(BVDV)阳性。
3 结果
用猪瘟胶体金快速检测试纸卡和牛病毒性腹泻抗原ELISA检测试剂盒检测30份患牛血清，牛病毒性腹泻阳性数分别为12份和15份，阳性率分别为40%和50%。两种检测方法对牛病毒性腹泻的检测结果较为相近，但还是略有差异。
4 讨论
牛病毒性腹泻病毒属于黄病毒科，瘟病毒属成员，是无节段的单一的RNA病毒。因此，如果要开展分子方面检测，也就是RT-PCR检测，在操作过程中需要对基因组RNA进行操作，这就要求整个实验过程中不能混入RNA酶，对检测环境的要求较为严格，导致不能对农村散户进行推广。而牛病毒性腹泻抗原ELISA检测(血清) 试剂盒也需要操作者具备相关的专业技能，除此之外，还需要专业的移液枪和吸头，以及昂贵的酶标仪等仪器，这使基层的养殖户不能直接使用，某种程度会延误对疫病的早期诊断，从而错过对牛病毒性腹泻的最佳治疗时机，最终导致不必要的经济损失，使牛病毒性腹泻病毒的进一步蔓延，不利于对该传染病的防控与净化。
虽然，免疫胶体金试纸检测卡使用上特别方便，但截止目前，在牛病毒性腹泻的检测试剂盒中未见有免疫胶体金试纸检测卡的报道，为给基层农村养牛户寻找一种行之有效，并且方便操作的检测手段。本研究根据猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒同属黄病毒科，瘟病毒属成员，并且两者在血清学上存在交叉反应，基于此考虑，我们尝试用猪瘟病毒快速检测试纸卡检测疑似感染牛病毒性腹泻病毒血清，结果显示，猪瘟病毒快速检测试纸卡完全可以用于牛病毒性腹泻的检测，只是检测结果与牛病毒性腹泻抗原ELISA检测(血清) 试剂盒略有差异。至于哪种方法更准确，这需要进行RT-PCR等分子生物学方法来验证。
参考文献
[1] 李兆华.RT-PCR技术在BVDV检测中的应用研究进展[J].山东畜牧兽医,2010,(31):50-51.
[2] 崔保安,朱沙,陈圣先.牛病毒性腹泻病毒蛋白特性的研究进展[J].中国畜牧兽医,2003,30(2):32-34．
[3] 王新平,涂长春,李红卫,等.从疑似猪瘟病料中检出牛病毒性腹泻病毒[J].巾同兽医学报,1996,16(4):341-345．
作者简介：朴炯宇（1979-），男，吉林图们人，图们市长安镇畜牧兽医站站长。
关键词：牛病毒性腹泻病毒；胶体金快速检测试纸卡；临床诊断
中图分类号：S85 文献标识码：A 文章编号：1674-0432（2011）-11-0200-1
牛病毒性腹泻病毒（bovine viral diarrhea virus, BVDV）属于黄病毒科，瘟病毒属成员，主要引起牛病毒性腹泻-黏膜病，造成患牛免疫耐受、持续性感染、母牛流产、死胎和畸形胎。20世纪40年代，在加拿大首次发现该病，之后向其他国产蔓延，目前该病呈世界性分布，给养牛业健康发展带来了巨大障碍。为控制牛病毒性腹泻病毒的传播与蔓延，早期诊断是关键，本研究采用猪瘟胶体金快速检测试纸卡检测牛病毒性腹泻抗体水平。
1 材料
30份疑似感染牛病毒性腹泻病毒患牛的抗凝血。猪瘟病毒快速检测试纸卡（货号：M371328）购自克格仪器有限公司；牛病毒性腹泻抗原ELISA检测(血清) 试剂盒（货号：99-43810）购自北京祥龙环宇生物技术有限公司。
2 方法
2.1 应用猪瘟胶体金快速检测试纸卡检测牛病毒性腹泻抗体(血清)
2.1.1 操作步骤 从30份患牛抗凝血中分离血清，将分离的血清加入到猪瘟胶体金快速检测试纸卡的检测孔内，50ul/孔，放置于室温中15min后，观察反应结果。
2.1.2 判定方法 猪瘟胶体金快速检测试纸卡T区（检测线）呈现紫红色，并且C区（对照线）也呈现紫红色时，判定为阳性。当T区不变色，而C区呈现紫红色，则判定为阴性。如果C区不呈现紫红色时，此卡不能使用，为失效检测卡。
2.2 应用牛病毒性腹泻抗原ELISA检测试剂盒检测抗体(血清)
2.2.1 操作步骤
2.2.1.1 编号 将样品对应微孔按序编号，每板应设阴性对照2孔、阳性对照2孔、空白对照1孔，空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同。
2.2.1.2 加样 分别在阴、阳性对照孔中加入阴性对照、阳性对照50μl。然后在待测样品孔先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
2.2.1.3 孵育 用封板膜封板后置37℃孵育30min。
2.2.1.4 洗涤 小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30s后弃去，如此重复5次，拍干。
2.2.1.5 加酶 每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。孵育同2.2.1.3，洗涤同2.2.1.4。
2.2.1.6 显色 每孔先加入显色剂A 50μl，再加入显色剂B 50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15min。
2.2.1.7 终止 每孔加终止液50μl，终止反应(此时蓝色立转黄色)。
2.2.1.8 测定结果 以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。 测定应在加终止液后15min以内进行。
2.2.2 判定方法
2.2.2.1 试验有效性 阳性对照孔平均值≥1.00；阴性对照平均值≤0.10。
2.2.2.2 临界值(CUT OFF)计算 临界值=阴性对照孔平均值+0.15。
2.2.2.3 阴性判定 样品OD值< 临界值(CUT OFF)者为牛病毒性腹泻病毒(BVDV)阴性。
2.2.2.4 阳性判定 样品OD值≥ 临界值(CUT OFF)者为牛病毒性腹泻病毒(BVDV)阳性。
3 结果
用猪瘟胶体金快速检测试纸卡和牛病毒性腹泻抗原ELISA检测试剂盒检测30份患牛血清，牛病毒性腹泻阳性数分别为12份和15份，阳性率分别为40%和50%。两种检测方法对牛病毒性腹泻的检测结果较为相近，但还是略有差异。
4 讨论
牛病毒性腹泻病毒属于黄病毒科，瘟病毒属成员，是无节段的单一的RNA病毒。因此，如果要开展分子方面检测，也就是RT-PCR检测，在操作过程中需要对基因组RNA进行操作，这就要求整个实验过程中不能混入RNA酶，对检测环境的要求较为严格，导致不能对农村散户进行推广。而牛病毒性腹泻抗原ELISA检测(血清) 试剂盒也需要操作者具备相关的专业技能，除此之外，还需要专业的移液枪和吸头，以及昂贵的酶标仪等仪器，这使基层的养殖户不能直接使用，某种程度会延误对疫病的早期诊断，从而错过对牛病毒性腹泻的最佳治疗时机，最终导致不必要的经济损失，使牛病毒性腹泻病毒的进一步蔓延，不利于对该传染病的防控与净化。
虽然，免疫胶体金试纸检测卡使用上特别方便，但截止目前，在牛病毒性腹泻的检测试剂盒中未见有免疫胶体金试纸检测卡的报道，为给基层农村养牛户寻找一种行之有效，并且方便操作的检测手段。本研究根据猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒同属黄病毒科，瘟病毒属成员，并且两者在血清学上存在交叉反应，基于此考虑，我们尝试用猪瘟病毒快速检测试纸卡检测疑似感染牛病毒性腹泻病毒血清，结果显示，猪瘟病毒快速检测试纸卡完全可以用于牛病毒性腹泻的检测，只是检测结果与牛病毒性腹泻抗原ELISA检测(血清) 试剂盒略有差异。至于哪种方法更准确，这需要进行RT-PCR等分子生物学方法来验证。
参考文献
[1] 李兆华.RT-PCR技术在BVDV检测中的应用研究进展[J].山东畜牧兽医,2010,(31):50-51.
[2] 崔保安,朱沙,陈圣先.牛病毒性腹泻病毒蛋白特性的研究进展[J].中国畜牧兽医,2003,30(2):32-34．
[3] 王新平,涂长春,李红卫,等.从疑似猪瘟病料中检出牛病毒性腹泻病毒[J].巾同兽医学报,1996,16(4):341-345．
作者简介：朴炯宇（1979-），男，吉林图们人，图们市长安镇畜牧兽医站站长。