论文部分内容阅读
【摘要】 目的：研究齐墩果酸（oleanolic acid，OA）对白血病HL-60细胞窖蛋白-1（Caveolin-1，CAV-1）表达的影响。方法：OA作用HL-60细胞后，倒置显电镜观察细胞形态；RT-PCR检测HL-60细胞cav-1的mRNA表达；Western blot检测CAV-1蛋白水平。结果：OA作用HL-60细胞后，RT-PCR检测cav-1 mRNA表达上调（P<0.01）；Western blot检测CAV-1蛋白水平升高（P<0.01）。结论：OA通过上调CAV-1的表达，抑制HL-60细胞增殖。
【关键词】 白血病； 齐墩果酸； CAV-1； HL-60细胞
白血病是一类造血干细胞的恶性克隆性疾病，是由于造血干细胞、祖细胞分化受阻，反分化和克隆性无限增殖，使细胞停滞在不同的造血阶段，不能形成正常的血细胞，从而导致的一组异质性造血系统恶性肿瘤。齐墩果酸，又名庆四素，五环三萜类化合物。本课题组前期体外实验研究发现：OA作用于HL-60、K562细胞诱导凋亡作用具有时间、剂量依赖性；OA使HL-60细胞阻滞于G1期[1]，并引起HL-60细胞bcl-2、bcl-xL mRNA表达下调、而bid和bax mRNA表达增加[2]，OA从转录和翻译水平降低HL-60、K562细胞中VEGF表达，VEGF作为PI3K/Akt途径下游基因[3]。本课题以OA对白血病HL-60细胞CAV-1的表达进行研究，为深入揭示白血病发病分子机制、寻找白血病治疗的有效靶点作出一点点的贡献。
1 材料与方法
1.1 主要试剂 RPMI-1640培养基购自Hyclone公司；胎牛血清购自杭州四季青生物科技有限公司；齐墩果酸标准品购自中国药品生物制品检定所；RNAiso Plus（Total RNA提取试剂）、RT-PCR试剂盒及DL2000 Marker购自TaKaRa公司；CAV-1一抗（兔抗人）购自santa cruz；ACTIN抗体购自博士德生物工程有限公司；辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG购自北京中杉金桥生物制品有限公司；引物均由TaKaRa公司合成 ，序列见表1。
1.2 药品的配制 称取36.5386 mg的OA标准品，溶于1.0 ml的DMSO中，制成800 μmol/L的贮存液备用。
1.3 细胞株及细胞培养 急性早幼粒细胞白血病系HL-60细胞株购自中科院上海生命科学研究院。用含10%胎牛血清RPMI-1640培养基，37 ℃，5% CO2培养箱中常规培养，每2～3天传代一次。
1.4 RT-PCR检测PI3K、AKT的mRNA表达 按试剂盒说明书操作。
1.5 Westem blot检测CAV-1蛋白水平 制备HL-60细胞蛋白样品后采用BCA法检测蛋白浓度（按试剂说明操作），检测蛋白表达[4]。
1.6 统计学处理 采用SPSS17.0软件对数据进行分析，实验结果采用（x±s）表示，两组间的比较采用q检验，指标之间的关系采用相关分析。
2 结果
2.1 倒置显微镜观察 倒置显微镜下观察，空白对照组细胞数多、生长旺盛、细胞大小均一、近似圆形透亮、细胞轮廓清楚。OA组细胞数少，体积缩小、细胞中颗粒增多、细胞失去了光滑圆润的外表发生皱缩。细胞间连接消失，细胞失去集落生长状态。见图1。
3 讨论
Caveolae是细胞各种信号分子和信号通路的整合器，而CAV-1是Caveolae上最重要的结构蛋白[5-6]。人CAV-1基因定位于染色体7q31.1，该区域（FRA7G）因在恶性肿瘤中常常缺失而被认为含有肿瘤抑制基因[7-9]。CAV-1位于该染色体距D7S522与D7S2460位点之间，由于这个位点在人类各种肿瘤中常常缺失或断裂，如乳房、结肠、肾脏、前列腺、卵巢、头颈部肿瘤等，因此被认为是该区域的肿瘤抑制基因的遗传标志[10]。近年来对Caveolae和cav-1的研究很多，尤其是关于cav-1的抑癌机制研究。程荣辉等[6]采用流式细胞技术与Ross等[7]采用cDNA微阵列技术检测白血病细胞株，发现cav-1mRNA的表达明显下降，提示急性白血病中cav-1 mRNA和蛋白的表达均呈低水平。另外，各个亚型的急性白血病细胞中CAV-1的表达无明显差异，提示cav-1基因可能为泛基因，而非某一类型的特异性基因[8-12]。有研究表明，cav-1基因可能为PI3K/AKT信号转导通路上游的一个重要的靶基因，与该通路关系密切[13-17]。实验中以80μM OA作用细胞发现HL-60细胞的cav-1 mRNA和CAV-1蛋白表达升高，提示OA 可能通过CAV-1抑制白血病HL-60细胞的增殖，促进其凋亡。
参考文献
[1] Zhang P， Li H， Chen D， et al. Oleanolic Acid Induces Apoptosis in Human Leukemia Cells through Caspase Activatio and Poly （ADP-ribose） Polymerase Cleavage[J].Acta Biochim Biop hys-Sin，2007， 39（10）：803-809.
[2]张鹏霞，薛芳喜，王迪迪.齐墩果酸对K562细胞bax、bcl-xL mRNA表达的影响[J].中国老年学杂志，2009， 29（21）：2751-2752.
[3]汤华成，赵蕾，张鹏霞，等.齐墩果酸对K562细胞系VEGF表达影响的实验研究[J]. 中国老年学杂志，2007，27（24）：2371-2373.
[4]魏晓东.医学分子生物学[M].北京：北京大学医学出版社，2010：260-265. [5]谢晓艳，刘澎，李建勇.窖蛋白-1与肿瘤.国际病理科学与临床杂志[J].2009，26（5）：372-375.
[6]程荣辉，张荣艳.Caveolin-1蛋白在急性白血病中表达的研究[J].江西医药，2009，4（44）： 306-309.
[7] Ross D T，Scherf U，Eisen M B，et al.Systematic variation in gene expression patterns in human cancer cell lines[J].Nat Genet，2000，24（12）：227.
[8]张鹏霞，刘淼，陈东，等.齐墩果酸对HL60细胞周期调控因子影响的实验研究[J].中国老年学杂志， 2007，27（9）：825-827.
[9]于亚平.自然杀伤细胞恶性肿瘤的研究进展[J].现代肿瘤医学，2009，13（1）：45-46.
[10]江向红，许国强. Caveolin的生物学功能及其在疾病中的作用[J]. 国际内科学杂志，2007，23（3）：231-233.
[11]杨志明，王迪迪，李丽， 等.Bcl-2参与SCID小鼠体内齐墩果酸诱导HL-60细胞凋亡的调控作用[J].吉林大学学报（医学版） ，2011，37（1）：11-14.
[12]李慧，田黎明，徐玥玥， 等.MMP-7和HGF在白血病中的表达及其相关性研究[J].黑龙江医药科学，2011，34（6）：36-37.
[13] Jacky G.Goetz， Patrick Lajoie，Sam M. Wiseman et al.Caveolin-1 in tumor progression： the good， the bad and the ugly[J].Cancer and Metastasis Reviews，2008，24（4）： 715.
[14]张伟，杨志明，张鹏霞.齐墩果酸对人白血病HL-60细胞端粒酶活性的影响[J].黑龙江医药科学，2009，32（6）：40.
[15]张洁，付云，千新来.齐墩果酸诱导Kasumi-1细胞凋亡及对AML1-ETO表达的影响[J].中国临床药理学杂志， 2013，29（5）：367-369.
[16]李旸，廖爱军，潘梦瑶，等.齐墩果酸诱导Jurkat细胞凋亡及对ROS和细胞内Ca2+含量的影响[J].中国医科大学学报，2012， 41（10）：921-925.
[17]杨玉，刘莉，商宇，等.ROS在齐墩果酸诱导HL-60细胞凋亡中的作用[J].中国老年学杂志，2011，31（11）： 1997-1999.
（收稿日期：2013-06-10） （本文编辑：陈丹云）
【关键词】 白血病； 齐墩果酸； CAV-1； HL-60细胞
白血病是一类造血干细胞的恶性克隆性疾病，是由于造血干细胞、祖细胞分化受阻，反分化和克隆性无限增殖，使细胞停滞在不同的造血阶段，不能形成正常的血细胞，从而导致的一组异质性造血系统恶性肿瘤。齐墩果酸，又名庆四素，五环三萜类化合物。本课题组前期体外实验研究发现：OA作用于HL-60、K562细胞诱导凋亡作用具有时间、剂量依赖性；OA使HL-60细胞阻滞于G1期[1]，并引起HL-60细胞bcl-2、bcl-xL mRNA表达下调、而bid和bax mRNA表达增加[2]，OA从转录和翻译水平降低HL-60、K562细胞中VEGF表达，VEGF作为PI3K/Akt途径下游基因[3]。本课题以OA对白血病HL-60细胞CAV-1的表达进行研究，为深入揭示白血病发病分子机制、寻找白血病治疗的有效靶点作出一点点的贡献。
1 材料与方法
1.1 主要试剂 RPMI-1640培养基购自Hyclone公司；胎牛血清购自杭州四季青生物科技有限公司；齐墩果酸标准品购自中国药品生物制品检定所；RNAiso Plus（Total RNA提取试剂）、RT-PCR试剂盒及DL2000 Marker购自TaKaRa公司；CAV-1一抗（兔抗人）购自santa cruz；ACTIN抗体购自博士德生物工程有限公司；辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG购自北京中杉金桥生物制品有限公司；引物均由TaKaRa公司合成 ，序列见表1。
1.2 药品的配制 称取36.5386 mg的OA标准品，溶于1.0 ml的DMSO中，制成800 μmol/L的贮存液备用。
1.3 细胞株及细胞培养 急性早幼粒细胞白血病系HL-60细胞株购自中科院上海生命科学研究院。用含10%胎牛血清RPMI-1640培养基，37 ℃，5% CO2培养箱中常规培养，每2～3天传代一次。
1.4 RT-PCR检测PI3K、AKT的mRNA表达 按试剂盒说明书操作。
1.5 Westem blot检测CAV-1蛋白水平 制备HL-60细胞蛋白样品后采用BCA法检测蛋白浓度（按试剂说明操作），检测蛋白表达[4]。
1.6 统计学处理 采用SPSS17.0软件对数据进行分析，实验结果采用（x±s）表示，两组间的比较采用q检验，指标之间的关系采用相关分析。
2 结果
2.1 倒置显微镜观察 倒置显微镜下观察，空白对照组细胞数多、生长旺盛、细胞大小均一、近似圆形透亮、细胞轮廓清楚。OA组细胞数少，体积缩小、细胞中颗粒增多、细胞失去了光滑圆润的外表发生皱缩。细胞间连接消失，细胞失去集落生长状态。见图1。
3 讨论
Caveolae是细胞各种信号分子和信号通路的整合器，而CAV-1是Caveolae上最重要的结构蛋白[5-6]。人CAV-1基因定位于染色体7q31.1，该区域（FRA7G）因在恶性肿瘤中常常缺失而被认为含有肿瘤抑制基因[7-9]。CAV-1位于该染色体距D7S522与D7S2460位点之间，由于这个位点在人类各种肿瘤中常常缺失或断裂，如乳房、结肠、肾脏、前列腺、卵巢、头颈部肿瘤等，因此被认为是该区域的肿瘤抑制基因的遗传标志[10]。近年来对Caveolae和cav-1的研究很多，尤其是关于cav-1的抑癌机制研究。程荣辉等[6]采用流式细胞技术与Ross等[7]采用cDNA微阵列技术检测白血病细胞株，发现cav-1mRNA的表达明显下降，提示急性白血病中cav-1 mRNA和蛋白的表达均呈低水平。另外，各个亚型的急性白血病细胞中CAV-1的表达无明显差异，提示cav-1基因可能为泛基因，而非某一类型的特异性基因[8-12]。有研究表明，cav-1基因可能为PI3K/AKT信号转导通路上游的一个重要的靶基因，与该通路关系密切[13-17]。实验中以80μM OA作用细胞发现HL-60细胞的cav-1 mRNA和CAV-1蛋白表达升高，提示OA 可能通过CAV-1抑制白血病HL-60细胞的增殖，促进其凋亡。
参考文献
[1] Zhang P， Li H， Chen D， et al. Oleanolic Acid Induces Apoptosis in Human Leukemia Cells through Caspase Activatio and Poly （ADP-ribose） Polymerase Cleavage[J].Acta Biochim Biop hys-Sin，2007， 39（10）：803-809.
[2]张鹏霞，薛芳喜，王迪迪.齐墩果酸对K562细胞bax、bcl-xL mRNA表达的影响[J].中国老年学杂志，2009， 29（21）：2751-2752.
[3]汤华成，赵蕾，张鹏霞，等.齐墩果酸对K562细胞系VEGF表达影响的实验研究[J]. 中国老年学杂志，2007，27（24）：2371-2373.
[4]魏晓东.医学分子生物学[M].北京：北京大学医学出版社，2010：260-265. [5]谢晓艳，刘澎，李建勇.窖蛋白-1与肿瘤.国际病理科学与临床杂志[J].2009，26（5）：372-375.
[6]程荣辉，张荣艳.Caveolin-1蛋白在急性白血病中表达的研究[J].江西医药，2009，4（44）： 306-309.
[7] Ross D T，Scherf U，Eisen M B，et al.Systematic variation in gene expression patterns in human cancer cell lines[J].Nat Genet，2000，24（12）：227.
[8]张鹏霞，刘淼，陈东，等.齐墩果酸对HL60细胞周期调控因子影响的实验研究[J].中国老年学杂志， 2007，27（9）：825-827.
[9]于亚平.自然杀伤细胞恶性肿瘤的研究进展[J].现代肿瘤医学，2009，13（1）：45-46.
[10]江向红，许国强. Caveolin的生物学功能及其在疾病中的作用[J]. 国际内科学杂志，2007，23（3）：231-233.
[11]杨志明，王迪迪，李丽， 等.Bcl-2参与SCID小鼠体内齐墩果酸诱导HL-60细胞凋亡的调控作用[J].吉林大学学报（医学版） ，2011，37（1）：11-14.
[12]李慧，田黎明，徐玥玥， 等.MMP-7和HGF在白血病中的表达及其相关性研究[J].黑龙江医药科学，2011，34（6）：36-37.
[13] Jacky G.Goetz， Patrick Lajoie，Sam M. Wiseman et al.Caveolin-1 in tumor progression： the good， the bad and the ugly[J].Cancer and Metastasis Reviews，2008，24（4）： 715.
[14]张伟，杨志明，张鹏霞.齐墩果酸对人白血病HL-60细胞端粒酶活性的影响[J].黑龙江医药科学，2009，32（6）：40.
[15]张洁，付云，千新来.齐墩果酸诱导Kasumi-1细胞凋亡及对AML1-ETO表达的影响[J].中国临床药理学杂志， 2013，29（5）：367-369.
[16]李旸，廖爱军，潘梦瑶，等.齐墩果酸诱导Jurkat细胞凋亡及对ROS和细胞内Ca2+含量的影响[J].中国医科大学学报，2012， 41（10）：921-925.
[17]杨玉，刘莉，商宇，等.ROS在齐墩果酸诱导HL-60细胞凋亡中的作用[J].中国老年学杂志，2011，31（11）： 1997-1999.
（收稿日期：2013-06-10） （本文编辑：陈丹云）