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[摘要]目的 探討ErbB2基因沉默介导PI3K/Akt/eNOS信号通路对卵巢癌细胞生物学特性的影响及机制。方法 选取对数生长期人卵巢癌细胞株HO8910细胞分为5组：空白对照组（不转染任何序列）、阴性对照组（转染空载体质粒）、siErbB2组（转染siRNA序列）、wortmannin组（转染PI3K/Akt/eNOS信号通路抑制剂wortmannin）、siErbB2+IGF-1组（转染siRNA序列+PI3K/Akt/eNOS信号通路激动剂IGF-1）。采用实时定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）和Western blot检测ErbB2、Akt、PI3K、eNOS、Caspase-3、Bax和Bcl-2的mRNA和蛋白表达水平，同时检测细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的变化。结果 与空白对照组比较，siErbB2组和wortmannin组卵巢癌细胞中Akt、PI3K、eNOS和Bcl-2的mRNA和蛋白表达量显著下降，而Caspase-3、Bax的mRNA和蛋白表达量则显著增加（F=3.58～8.69，P均<0.05），细胞增殖能力、侵袭能力、迁移能力均显著下降（F=8.84～15.67，P均<0.05），细胞凋亡率上升（F=9.46，P<0.05）;siErbB2组ErbB2表达明显下降（P<0.05）。与siErbB2组相比，siErbB2+IGF-1组ErbB2、Akt、PI3K、eNOS和Bcl-2的mRNA和蛋白表达量显著下降（P均<0.05），Caspase-3、Bax的mRNA和蛋白表达量显著增加（P均<0.05），细胞增殖能力、侵袭能力、迁移能力均明显下降（P均<0.05），细胞凋亡率上升（P<0.05）。结论 ErbB2基因沉默可抑制PI3K/Akt/eNOS信号通路，从而抑制卵巢癌细胞增殖，促进细胞凋亡。而PI3K/Akt/eNOS信号通路激活可逆转ErbB2基因沉默作用，促进卵巢癌细胞增殖并抑制细胞凋亡。
[关键词]基因，erbB-2;基因沉默;PI3K/Akt/eNOS信号通路;卵巢肿瘤;细胞增殖;细胞凋亡;细胞运动;肿瘤侵润
[中图分类号]R737.31;R394.3
[文献标志码]A
[文章编号]2096-5532（2021）02-0222-06
[ABSTRACT]Objective To investigate the effect of ErbB2 gene silencing on the biological characteristics of ovarian cancer cells by mediating the PI3K/Akt/eNOS signaling pathway and its mechanism.
Methods Human ovarian cancer HO8910 cells in the logarithmic growth phase were divided into blank control group （without transfection of any sequence）， negative control group （transfected with empty vector plasmid）， siErbB2 group （transfected with siRNA sequence）， wortmannin group （transfected with the PI3K/Akt/eNOS signaling pathway inhibitor wortmannin）， and siErbB2+IGF-1 group （transfected with siRNA sequence and the PI3K/Akt/eNOS signaling pathway agonist IGF-1）. Quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction and Western blot were used to measure the mRNA and protein expression levels of ErbB2， Akt， PI3K， eNOS， Caspase-3， Bax， and Bcl-2， and the changes in cell proliferation， apoptosis， migration， and invasion were observed. Results Compared with the blank control group， the siErbB2 group and the wortmannin group had significant reductions in the mRNA and protein expression levels of Akt， PI3K， eNOS， and Bcl-2 and significant increases in the mRNA and protein expression levels of Caspase-3 and Bax in ova-rian cancer cells （F=3.58-8.69，P<0.05）， as well as significant reductions in cell proliferation， invasion， and migration abilities （F=8.84-15.67， all P<0.05） and a significant increase in cell apoptotic rate （F=9.46，P<0.05）; the siErbB2 group had a significant reduction in the expression of ErbB2 （P<0.05）. Compared with the siErbB2 group， the siErbB2+IGF-1 group had signi-ficant reductions in the mRNA and protein expression levels of ErbB2， Akt， PI3K， eNOS， and Bcl-2 （all P<0.05）， significant increases in the mRNA and protein expression of Caspase-3 and Bax （all P<0.05）， significant reductions in cell proliferation， invasion， and migration abilities （all P<0.05）， and a significant increase in cell apoptotic rate （P<0.05）. Conclusion ErbB2 gene silencingcan inhibit the PI3K/Akt/eNOS signaling pathway， thereby inhibiting the proliferation of ovarian cancer cells and promoting cell apoptosis. The activation of the PI3K/Akt/eNOS signaling pathway can reverse the effect of ErbB2 gene silencing， promote the proli-feration of ovarian cancer cells， and inhibit cell apoptosis. [KEY WORDS]genes， erbB2; gene silencing; PI3K/Akt/eNOS signaling pathway; ovarian neoplasms; cell proliferation; apoptosis; cell movement; neoplasm invasiveness
卵巢癌作为一种常见女性恶性肿瘤，发病隐匿，病死率高[1]。而卵巢癌以化疗为主的治疗手段因耐药性其效果不容乐观[2]。故有必要通过对卵巢癌发病机制的探究，寻找新型的肿瘤治疗方法。ErbB2基因又称HER2，隶属于表皮生长因子受体家族[3]。ErbB2基因常高表达于肿瘤细胞中[4]，而且PI3K/Akt信号转导途径活性较高[5]，导致肿瘤细胞恶性程度极高，提示肿瘤病人转移率高、存活期缩短。而PI3K/Akt/eNOS信号通路是一种经典的抗细胞凋亡的信号转导途径，该通路异常已被证实在众多恶性肿瘤的发生、转移及放化疗抵抗中发挥关键作用[6-7]。PI3K抑制剂可有效抑制癌细胞增殖从而促进细胞凋亡，进而发挥肿瘤治疗作用[8]。然而，目前关于ErbB2基因是否影响卵巢癌细胞生物学特性以及其与PI3K/Akt/eNOS信号通路相关的机制的研究未见报道。因此，本研究期望通过基因沉默技术，探究ErbB2基因沉默介导PI3K/Akt/eNOS信号通路对卵巢癌细胞生物学特性的影响及可能机制，以期为卵巢癌分子靶向治疗提供潜在证据。
1 材料与方法
1.1 实验材料
人卵巢癌细胞株HO8910细胞（上海生物工程研究所提供）;RPMI-1640和DMEM（Gibco公司，美国）;RNA提取试剂盒（北京康润诚业生物科技有限公司）;紫外线分光光度仪（上海奥析科学仪器有限公司）;ABI PRISM7300系统（ABI，USA）;BCA试剂盒（上海翊圣生物科技有限公司）;Wes-tern blot蛋白检测的兔多克隆一抗和山羊抗兔IgG二抗（Abcam公司，Cambridge，MA，USA）;噻唑蓝（MTT）溶液（Sigma公司，USA）;自动酶标读数仪（BIO-RAD公司，USA）;ECL化学发光检测试剂盒（Sigma公司，USA）;Annexin V-FITC/PI双标染色试剂盒（BestBio公司，上海）;流式细胞仪（BD公司，USA）;Matrigel基质胶（BD公司，USA）;Transwell小室（康宁公司，USA）。
1.2 实验方法
1.2.1 细胞培养及其分组处理 人卵巢癌细胞株HO8910细胞培养于含有体积分数0.1胎牛血清的RPMI-1640培养基中。以每孔1×105个细胞接种于6孔培养板，置于37 ℃、含体积分数0.05 CO2、饱和湿度的孵箱中培养。待细胞铺满培养板80%～90%做传代培养。弃培养液，PBS洗2次，以2.5 g/L胰蛋白酶消化，用含体积分数0.10胎牛血清的DMEM培养基重悬细胞，传代培养。
本实验siRNA序列设计参照Genbank中报道的ErbB2的mRNA全序列，并由上海生工生物工程技术服务有限公司对所有片段进行合成。选取对数生长期的HO8910细胞分为5组：空白对照组（A组：不转染任何序列）、阴性对照组（B组：转染空载体质粒）、siErbB2组（C组：转染siRNA序列）、wortmannin组（D组：转染PI3K/Akt/eNOS信号通路抑制剂wortmannin）、siErbB2+IGF-1组（E组：转染siRNA序列+PI3K/Akt/eNOS信号通路激动剂IGF-1）。
1.2.2 实时定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）检测 采用RNA提取试剂盒抽提总RNA。采用紫外线分光光度法检测组织和细胞中RNA的纯度及浓度。设计ErbB2、Akt、PI3K、eNOS、Caspase-3、Bcl-2、Bax和GAPDH引物，交由TaKaRa公司合成。逆轉录参照TaqMan MicroRNA Assays Reverse Transcription Primer说明书进行。取反应液进行荧光定量PCR操作。在ABI PRISM7300系统中进行荧光定量PCR。以2-ΔCt表示实验组与对照组目的基因表达的倍比关系。其计算公式如下：ΔCt=Ct miRNA-CtU6，分别计算细胞中ErbB2、Akt、PI3K、eNOS、Caspase-3、Bax和Bcl-2的mRNA表达量。
1.2.3 Western blot检测 在细胞中加入蛋白裂解液，4 ℃裂解30 min;4 ℃下12 000 r/min离心20 min。取上清液采用BCA试剂盒测定每个样品的蛋白浓度。本实验所用一抗为兔多克隆抗体ErbB2、Akt、PI3K、eNOS、Caspase-3、Bax和Bcl-2，二抗为辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG。孵育后，室温下PBS缓冲液洗涤3次，每次5 min。在暗室环境中用线片曝光，显影、定影之后观察结果。以GAPDH作内参照，以目标条带与内参照条带的灰度值之比作为蛋白质的相对表达水平。
1.2.4 MTT法检测 转染24 h后，取对数生长期的细胞，调整细胞密度制备细胞悬液后，接种到96孔培养板，根据实验分组，每组各设3个复孔，置于37 ℃、体积分数0.05 CO2细胞培养箱中培养，分别于培养24、48、72、96 h时取出培养板，每孔加入5 g/L的MTT溶液20 μL继续培养4 h终止培养，弃上清液，每孔加150 μL 二甲基亚砜（DMSO），振荡15 min，使紫结晶充分溶解。采用自动酶标读数仪于570 nm波长处测定各孔吸光度（A）值。最后根据所采集值，计算HO8910细胞的生长抑制率，绘制生长曲线。
1.2.5 流式细胞术检测 细胞转染48 h后，收集细胞，以2.5 g/L胰蛋白酶消化，调整细胞的密度。检测前先离心10 min，弃上清后加入预冷的体积分数0.70乙醇溶液固定细胞，4 ℃过夜。用100目的尼龙网过滤。离心弃上清，加入100 μL的RNA酶溶液。然后加入10 μL的Annexin V-FITC和5 μL 的PI轻轻混匀，避光室温反应15 min，加入300 μL结合缓冲液，用流式细胞仪以激发波长488 nm检测细胞凋亡情况。 1.2.6 Transwell实验 取Transwell小室及实验所需试剂温育后，制备细胞悬液，调整细胞密度。首先于24孔板底部加入含体积分数0.10胎牛血清的培养基平衡，取配制细胞悬液加入Transwell小室，孵育过夜。培养24 h后，取出Transwell小室，吸干上室固定液，行甲紫染色。轻擦去上室内面未穿膜的细胞，光镜下计算细胞穿膜数。细胞侵袭实验用Matrigel稀释液模拟细胞外基质，观察细胞穿透向外浸润的能力。
1.3 统计学分析
所有数据均采用SPSS 21.0统计软件进行处理，计量资料采用x2±s的形式表示，多组间均数的比较用单因素方差分析，两两比较采用Tukey’s方法。多组间A值随时间的变化比较采用2因素析因设计的方差分析。以P<0.05表示差异具有统计学意义。
2 结 果
2.1 转染后各组细胞相关信号通路因子mRNA和蛋白表达的变化
单因素方差分析显示，5组间mRAN和蛋白表达量差异具有统计学意义（F=3.58～8.69，P均<0.05）。两两比较显示，与空白对照组比较，siErbB2组和wortmannin组卵巢癌细胞中的Akt、PI3K、eNOS和Bcl-2的mRNA和蛋白表达量均显著下降（P均<0.05），Caspase-3和Bax的mRNA和蛋白表达量显著增加（P均<0.05）;siErbB2组ErbB2的mRNA和蛋白表达量则显著下降（P均<0.05）;与siErbB2组相比较，siErbB2+IGF-1组细胞Akt、PI3K、eNOS和Bcl-2的mRNA和蛋白表达量显著上升，Caspase-3和Bax的mRNA和蛋白表达量则显著下降（P均<0.05）。见图1。
2.2 转染后各组细胞的增殖变化
MTT法检测结果的单因素方差分析显示，5组间的细胞增殖差异有统计学意义（F=8.84，P<0.05）。两两比较的结果显示，与空白对照组相比较，siErbB2组和wortmannin组细胞增殖较慢（P均<0.05）;与siErbB2组比较，siErbB2+IGF-1组细胞增殖增加（P<0.05）。析因设计方差分析结果显示，F组别=7.31，P=0.002;F时间=10.49，P<0.001;F组别×时间=5.78，P<0.05。见图2。
2.3 转染后各组细胞凋亡变化
单因素方差分析显示，5组的凋亡率差异有统计学意义（F=9.46，P<0.05）。两两比较显示，与空白对照组相比较，siErbB2组和wortmannin组细胞凋亡率均明显上升（P均<0.05）;对比siErbB2组，siErbB2+IGF-1组凋亡率明显下降（P<0.05）。见图3。
2.4 转染后各组细胞迁移与侵袭的变化
转染后各组细胞的迁移结果单因素方差分析显示，5组的迁移能力差异有统计学意义（F=12.57，P<0.05）。两两比较显示，与阴性对照组相比较，siErbB2组和wortmannin组细胞迁移能力都显著减弱（P均<0.05）;siErbB2+IGF-1组迁移能力明显上升（P<0.05）。转染后各组细胞的侵袭结果单因素方差分析显示，5组的侵袭能力差异有统计学意义（F=15.67，P<0.05）。两两比较显示，与空白对照组相比，siErbB2组和wortmannin组细胞侵袭能力明显降低（P均<0.05）;siErbB2+IGF-1组侵袭能力明显上升（P<0.05）。见图4。
3 讨 论
卵巢癌发病率位居女性生殖系统癌症第三，但其病死率却位居之首[9-12]。其发病隐匿，化疗等综合治疗效果不显著[13-17]。因此，提高卵巢癌早期诊断水平并探究其分子机制，对于提高卵巢癌病人生存率至关重要。而RNA干扰自其发现以来，便成为基因研究领域的热点[18-21]。基因沉默技术高效、方便，且具有极高特异性。ErbB2（HER2）基因在人类多种恶性肿瘤中呈高表达，且伴随恶性程度更高的细胞表型，诱发癌细胞增殖和转移[22-25]。既往研究者推测ErbB2在肿瘤细胞中的过度表达，与相关信号转导途径的异常相关，可诱导肿瘤微环境中良好的细胞生长环境[26]。也有学者报道，PI3K和Akt可以干扰细胞中ErbB2转录，进而影响该因子的致癌性[14]。因此，本研究作出如下假设：ErbB2基因沉默可能通过PI3K/Akt/eNOS信号通路发挥对卵巢癌细胞生物学特性的影响。
本研究采用人卵巢癌细胞系HO8910细胞，进行分组培养及转染，设置空白对照组和阴性对照组，以siErbB2组表示抑制ErbB2表达，以wortmannin组表示对PI3K/Akt/eNOS信号通路的抑制，并进一步构建siErbB2+IGF-1组验证假设推理。采用qRT-PCR和Western blot方法检测各组细胞中ErbB2、Akt、PI3K、eNOS、Caspase-3、Bax和Bcl-2的mRNA和蛋白表达水平。同时，应用MTT法、流式细胞术、Transwell侵袭实验和划痕实验检测各组细胞增殖、凋亡、迁移能力和侵袭能力的变化。本文研究结果显示，siErbB2组和siErbB2+IGF-1组ErbB2表达明显下降，而wortmannin组无明显变化，说明RNA干扰可作为研究ErbB2在卵巢癌中作用的有效工具。
为进一步了解ErbB2对卵巢癌细胞增殖、凋亡的影响及其机制。本研究后续实验应用ErbB2基因沉默技术和通路抑制剂wortmannin处理卵巢癌细胞，检测结果显示，与空白对照组和阴性对照组相比较，siErbB2组和wortmannin组卵巢癌细胞中Akt、PI3K、eNOS和Bcl-2的mRNA和蛋白表达量则显著下降，Caspase-3、Bax的mRNA和蛋白表达量显著增加;而且与siErbB2组和wortmannin组相比，siErbB2+IGF-1组Akt、PI3K、eNOS和Bcl-2的mRNA和蛋白表达量显著上升。我们推测采用wortmannin抑制剂后，PI3K/Akt/eNOS信号通路效应分子PI3K、Akt、eNOS活化状态被抑制，进而抑制肿瘤细胞生长并促進细胞凋亡、抑制肿瘤细胞的低氧耐受和肿瘤微环境中的生存能力。 本文研究結果还表明，siErbB2组、wortmannin组和siErbB2+IGF-1组细胞增殖、侵袭和迁移能力均下降，而细胞凋亡率上升。与siErbB2组和wortmannin组相比较，siErbB2+IGF-1组细胞增殖、侵袭和迁移能力均上升，而细胞凋亡率下降。以上结果从PI3K/Akt/eNOS信号通路和细胞生物学特性两个方面证实，ErbB2基因沉默或许可通过抑制PI3K/Akt/eNOS信号通路，进而抑制细胞增殖并能促进细胞凋亡。而PI3K/Akt/eNOS信号通路激活可发挥逆转作用。提示ErbB2在卵巢癌的生长转移的调控中可能发挥重要作用，且其分子机制与PI3K/Akt/eNOS信号通路密切相关。
PI3K/Akt/eNOS信号通路在细胞增殖、凋亡中的作用，既往有众多报道。例如，LI等[27]报道，FGF21抑制剂可通过eNOS/PI3K/Akt信号通路抑制人脐静脉内皮细胞的增殖和迁移;AHSAN等[28]的结果显示，磷酸肌酸可通过调节PI3K/Akt/eNOS通路保护内皮细胞免受氧化低密度脂蛋白诱导的凋亡的影响。目前针对ErbB2基因沉默通过PI3K/Akt/eNOS信号通路发挥对卵巢癌细胞生物学特性的影响的研究较少，本文借助RNA干扰技术，从基因和蛋白水平证实ErbB2基因沉默可有效影响人卵巢癌细胞株HO8910细胞增殖、凋亡等生物学行为，提示ErbB2与卵巢癌细胞的生物学行为密切相关，且其可能机制与PI3K/Akt/eNOS信号通路的抑制有关。
综上所述，本文的研究结果显示，ErbB2在卵巢癌细胞中呈高表达，RNA干扰技术可有效抑制ErbB2表达;ErbB2基因沉默可抑制PI3K/Akt/eNOS信号通路，从而抑制卵巢癌细胞增殖、促进其凋亡。而PI3K/Akt/eNOS信号通路激活可逆转ErbB2基因沉默作用，促进卵巢癌细胞增殖并抑制细胞凋亡。本研究结果为临床卵巢癌的基因治疗提供了潜在依据。值得注意的是，本研究以细胞实验探究ErbB2在卵巢癌中的作用及其与PI3K/Akt/eNOS信号通路相关的分子机制，有待进一步动物实验和临床验证。同时，抑制ErbB2在卵巢癌中的表达进而发挥抑癌作用是否受到其他信号通路的影响，均为本研究未来探讨的方向。
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（本文編辑 于国艺）
[关键词]基因，erbB-2;基因沉默;PI3K/Akt/eNOS信号通路;卵巢肿瘤;细胞增殖;细胞凋亡;细胞运动;肿瘤侵润
[中图分类号]R737.31;R394.3
[文献标志码]A
[文章编号]2096-5532（2021）02-0222-06
[ABSTRACT]Objective To investigate the effect of ErbB2 gene silencing on the biological characteristics of ovarian cancer cells by mediating the PI3K/Akt/eNOS signaling pathway and its mechanism.
Methods Human ovarian cancer HO8910 cells in the logarithmic growth phase were divided into blank control group （without transfection of any sequence）， negative control group （transfected with empty vector plasmid）， siErbB2 group （transfected with siRNA sequence）， wortmannin group （transfected with the PI3K/Akt/eNOS signaling pathway inhibitor wortmannin）， and siErbB2+IGF-1 group （transfected with siRNA sequence and the PI3K/Akt/eNOS signaling pathway agonist IGF-1）. Quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction and Western blot were used to measure the mRNA and protein expression levels of ErbB2， Akt， PI3K， eNOS， Caspase-3， Bax， and Bcl-2， and the changes in cell proliferation， apoptosis， migration， and invasion were observed. Results Compared with the blank control group， the siErbB2 group and the wortmannin group had significant reductions in the mRNA and protein expression levels of Akt， PI3K， eNOS， and Bcl-2 and significant increases in the mRNA and protein expression levels of Caspase-3 and Bax in ova-rian cancer cells （F=3.58-8.69，P<0.05）， as well as significant reductions in cell proliferation， invasion， and migration abilities （F=8.84-15.67， all P<0.05） and a significant increase in cell apoptotic rate （F=9.46，P<0.05）; the siErbB2 group had a significant reduction in the expression of ErbB2 （P<0.05）. Compared with the siErbB2 group， the siErbB2+IGF-1 group had signi-ficant reductions in the mRNA and protein expression levels of ErbB2， Akt， PI3K， eNOS， and Bcl-2 （all P<0.05）， significant increases in the mRNA and protein expression of Caspase-3 and Bax （all P<0.05）， significant reductions in cell proliferation， invasion， and migration abilities （all P<0.05）， and a significant increase in cell apoptotic rate （P<0.05）. Conclusion ErbB2 gene silencingcan inhibit the PI3K/Akt/eNOS signaling pathway， thereby inhibiting the proliferation of ovarian cancer cells and promoting cell apoptosis. The activation of the PI3K/Akt/eNOS signaling pathway can reverse the effect of ErbB2 gene silencing， promote the proli-feration of ovarian cancer cells， and inhibit cell apoptosis. [KEY WORDS]genes， erbB2; gene silencing; PI3K/Akt/eNOS signaling pathway; ovarian neoplasms; cell proliferation; apoptosis; cell movement; neoplasm invasiveness
卵巢癌作为一种常见女性恶性肿瘤，发病隐匿，病死率高[1]。而卵巢癌以化疗为主的治疗手段因耐药性其效果不容乐观[2]。故有必要通过对卵巢癌发病机制的探究，寻找新型的肿瘤治疗方法。ErbB2基因又称HER2，隶属于表皮生长因子受体家族[3]。ErbB2基因常高表达于肿瘤细胞中[4]，而且PI3K/Akt信号转导途径活性较高[5]，导致肿瘤细胞恶性程度极高，提示肿瘤病人转移率高、存活期缩短。而PI3K/Akt/eNOS信号通路是一种经典的抗细胞凋亡的信号转导途径，该通路异常已被证实在众多恶性肿瘤的发生、转移及放化疗抵抗中发挥关键作用[6-7]。PI3K抑制剂可有效抑制癌细胞增殖从而促进细胞凋亡，进而发挥肿瘤治疗作用[8]。然而，目前关于ErbB2基因是否影响卵巢癌细胞生物学特性以及其与PI3K/Akt/eNOS信号通路相关的机制的研究未见报道。因此，本研究期望通过基因沉默技术，探究ErbB2基因沉默介导PI3K/Akt/eNOS信号通路对卵巢癌细胞生物学特性的影响及可能机制，以期为卵巢癌分子靶向治疗提供潜在证据。
1 材料与方法
1.1 实验材料
人卵巢癌细胞株HO8910细胞（上海生物工程研究所提供）;RPMI-1640和DMEM（Gibco公司，美国）;RNA提取试剂盒（北京康润诚业生物科技有限公司）;紫外线分光光度仪（上海奥析科学仪器有限公司）;ABI PRISM7300系统（ABI，USA）;BCA试剂盒（上海翊圣生物科技有限公司）;Wes-tern blot蛋白检测的兔多克隆一抗和山羊抗兔IgG二抗（Abcam公司，Cambridge，MA，USA）;噻唑蓝（MTT）溶液（Sigma公司，USA）;自动酶标读数仪（BIO-RAD公司，USA）;ECL化学发光检测试剂盒（Sigma公司，USA）;Annexin V-FITC/PI双标染色试剂盒（BestBio公司，上海）;流式细胞仪（BD公司，USA）;Matrigel基质胶（BD公司，USA）;Transwell小室（康宁公司，USA）。
1.2 实验方法
1.2.1 细胞培养及其分组处理 人卵巢癌细胞株HO8910细胞培养于含有体积分数0.1胎牛血清的RPMI-1640培养基中。以每孔1×105个细胞接种于6孔培养板，置于37 ℃、含体积分数0.05 CO2、饱和湿度的孵箱中培养。待细胞铺满培养板80%～90%做传代培养。弃培养液，PBS洗2次，以2.5 g/L胰蛋白酶消化，用含体积分数0.10胎牛血清的DMEM培养基重悬细胞，传代培养。
本实验siRNA序列设计参照Genbank中报道的ErbB2的mRNA全序列，并由上海生工生物工程技术服务有限公司对所有片段进行合成。选取对数生长期的HO8910细胞分为5组：空白对照组（A组：不转染任何序列）、阴性对照组（B组：转染空载体质粒）、siErbB2组（C组：转染siRNA序列）、wortmannin组（D组：转染PI3K/Akt/eNOS信号通路抑制剂wortmannin）、siErbB2+IGF-1组（E组：转染siRNA序列+PI3K/Akt/eNOS信号通路激动剂IGF-1）。
1.2.2 实时定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）检测 采用RNA提取试剂盒抽提总RNA。采用紫外线分光光度法检测组织和细胞中RNA的纯度及浓度。设计ErbB2、Akt、PI3K、eNOS、Caspase-3、Bcl-2、Bax和GAPDH引物，交由TaKaRa公司合成。逆轉录参照TaqMan MicroRNA Assays Reverse Transcription Primer说明书进行。取反应液进行荧光定量PCR操作。在ABI PRISM7300系统中进行荧光定量PCR。以2-ΔCt表示实验组与对照组目的基因表达的倍比关系。其计算公式如下：ΔCt=Ct miRNA-CtU6，分别计算细胞中ErbB2、Akt、PI3K、eNOS、Caspase-3、Bax和Bcl-2的mRNA表达量。
1.2.3 Western blot检测 在细胞中加入蛋白裂解液，4 ℃裂解30 min;4 ℃下12 000 r/min离心20 min。取上清液采用BCA试剂盒测定每个样品的蛋白浓度。本实验所用一抗为兔多克隆抗体ErbB2、Akt、PI3K、eNOS、Caspase-3、Bax和Bcl-2，二抗为辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG。孵育后，室温下PBS缓冲液洗涤3次，每次5 min。在暗室环境中用线片曝光，显影、定影之后观察结果。以GAPDH作内参照，以目标条带与内参照条带的灰度值之比作为蛋白质的相对表达水平。
1.2.4 MTT法检测 转染24 h后，取对数生长期的细胞，调整细胞密度制备细胞悬液后，接种到96孔培养板，根据实验分组，每组各设3个复孔，置于37 ℃、体积分数0.05 CO2细胞培养箱中培养，分别于培养24、48、72、96 h时取出培养板，每孔加入5 g/L的MTT溶液20 μL继续培养4 h终止培养，弃上清液，每孔加150 μL 二甲基亚砜（DMSO），振荡15 min，使紫结晶充分溶解。采用自动酶标读数仪于570 nm波长处测定各孔吸光度（A）值。最后根据所采集值，计算HO8910细胞的生长抑制率，绘制生长曲线。
1.2.5 流式细胞术检测 细胞转染48 h后，收集细胞，以2.5 g/L胰蛋白酶消化，调整细胞的密度。检测前先离心10 min，弃上清后加入预冷的体积分数0.70乙醇溶液固定细胞，4 ℃过夜。用100目的尼龙网过滤。离心弃上清，加入100 μL的RNA酶溶液。然后加入10 μL的Annexin V-FITC和5 μL 的PI轻轻混匀，避光室温反应15 min，加入300 μL结合缓冲液，用流式细胞仪以激发波长488 nm检测细胞凋亡情况。 1.2.6 Transwell实验 取Transwell小室及实验所需试剂温育后，制备细胞悬液，调整细胞密度。首先于24孔板底部加入含体积分数0.10胎牛血清的培养基平衡，取配制细胞悬液加入Transwell小室，孵育过夜。培养24 h后，取出Transwell小室，吸干上室固定液，行甲紫染色。轻擦去上室内面未穿膜的细胞，光镜下计算细胞穿膜数。细胞侵袭实验用Matrigel稀释液模拟细胞外基质，观察细胞穿透向外浸润的能力。
1.3 统计学分析
所有数据均采用SPSS 21.0统计软件进行处理，计量资料采用x2±s的形式表示，多组间均数的比较用单因素方差分析，两两比较采用Tukey’s方法。多组间A值随时间的变化比较采用2因素析因设计的方差分析。以P<0.05表示差异具有统计学意义。
2 结 果
2.1 转染后各组细胞相关信号通路因子mRNA和蛋白表达的变化
单因素方差分析显示，5组间mRAN和蛋白表达量差异具有统计学意义（F=3.58～8.69，P均<0.05）。两两比较显示，与空白对照组比较，siErbB2组和wortmannin组卵巢癌细胞中的Akt、PI3K、eNOS和Bcl-2的mRNA和蛋白表达量均显著下降（P均<0.05），Caspase-3和Bax的mRNA和蛋白表达量显著增加（P均<0.05）;siErbB2组ErbB2的mRNA和蛋白表达量则显著下降（P均<0.05）;与siErbB2组相比较，siErbB2+IGF-1组细胞Akt、PI3K、eNOS和Bcl-2的mRNA和蛋白表达量显著上升，Caspase-3和Bax的mRNA和蛋白表达量则显著下降（P均<0.05）。见图1。
2.2 转染后各组细胞的增殖变化
MTT法检测结果的单因素方差分析显示，5组间的细胞增殖差异有统计学意义（F=8.84，P<0.05）。两两比较的结果显示，与空白对照组相比较，siErbB2组和wortmannin组细胞增殖较慢（P均<0.05）;与siErbB2组比较，siErbB2+IGF-1组细胞增殖增加（P<0.05）。析因设计方差分析结果显示，F组别=7.31，P=0.002;F时间=10.49，P<0.001;F组别×时间=5.78，P<0.05。见图2。
2.3 转染后各组细胞凋亡变化
单因素方差分析显示，5组的凋亡率差异有统计学意义（F=9.46，P<0.05）。两两比较显示，与空白对照组相比较，siErbB2组和wortmannin组细胞凋亡率均明显上升（P均<0.05）;对比siErbB2组，siErbB2+IGF-1组凋亡率明显下降（P<0.05）。见图3。
2.4 转染后各组细胞迁移与侵袭的变化
转染后各组细胞的迁移结果单因素方差分析显示，5组的迁移能力差异有统计学意义（F=12.57，P<0.05）。两两比较显示，与阴性对照组相比较，siErbB2组和wortmannin组细胞迁移能力都显著减弱（P均<0.05）;siErbB2+IGF-1组迁移能力明显上升（P<0.05）。转染后各组细胞的侵袭结果单因素方差分析显示，5组的侵袭能力差异有统计学意义（F=15.67，P<0.05）。两两比较显示，与空白对照组相比，siErbB2组和wortmannin组细胞侵袭能力明显降低（P均<0.05）;siErbB2+IGF-1组侵袭能力明显上升（P<0.05）。见图4。
3 讨 论
卵巢癌发病率位居女性生殖系统癌症第三，但其病死率却位居之首[9-12]。其发病隐匿，化疗等综合治疗效果不显著[13-17]。因此，提高卵巢癌早期诊断水平并探究其分子机制，对于提高卵巢癌病人生存率至关重要。而RNA干扰自其发现以来，便成为基因研究领域的热点[18-21]。基因沉默技术高效、方便，且具有极高特异性。ErbB2（HER2）基因在人类多种恶性肿瘤中呈高表达，且伴随恶性程度更高的细胞表型，诱发癌细胞增殖和转移[22-25]。既往研究者推测ErbB2在肿瘤细胞中的过度表达，与相关信号转导途径的异常相关，可诱导肿瘤微环境中良好的细胞生长环境[26]。也有学者报道，PI3K和Akt可以干扰细胞中ErbB2转录，进而影响该因子的致癌性[14]。因此，本研究作出如下假设：ErbB2基因沉默可能通过PI3K/Akt/eNOS信号通路发挥对卵巢癌细胞生物学特性的影响。
本研究采用人卵巢癌细胞系HO8910细胞，进行分组培养及转染，设置空白对照组和阴性对照组，以siErbB2组表示抑制ErbB2表达，以wortmannin组表示对PI3K/Akt/eNOS信号通路的抑制，并进一步构建siErbB2+IGF-1组验证假设推理。采用qRT-PCR和Western blot方法检测各组细胞中ErbB2、Akt、PI3K、eNOS、Caspase-3、Bax和Bcl-2的mRNA和蛋白表达水平。同时，应用MTT法、流式细胞术、Transwell侵袭实验和划痕实验检测各组细胞增殖、凋亡、迁移能力和侵袭能力的变化。本文研究结果显示，siErbB2组和siErbB2+IGF-1组ErbB2表达明显下降，而wortmannin组无明显变化，说明RNA干扰可作为研究ErbB2在卵巢癌中作用的有效工具。
为进一步了解ErbB2对卵巢癌细胞增殖、凋亡的影响及其机制。本研究后续实验应用ErbB2基因沉默技术和通路抑制剂wortmannin处理卵巢癌细胞，检测结果显示，与空白对照组和阴性对照组相比较，siErbB2组和wortmannin组卵巢癌细胞中Akt、PI3K、eNOS和Bcl-2的mRNA和蛋白表达量则显著下降，Caspase-3、Bax的mRNA和蛋白表达量显著增加;而且与siErbB2组和wortmannin组相比，siErbB2+IGF-1组Akt、PI3K、eNOS和Bcl-2的mRNA和蛋白表达量显著上升。我们推测采用wortmannin抑制剂后，PI3K/Akt/eNOS信号通路效应分子PI3K、Akt、eNOS活化状态被抑制，进而抑制肿瘤细胞生长并促進细胞凋亡、抑制肿瘤细胞的低氧耐受和肿瘤微环境中的生存能力。 本文研究結果还表明，siErbB2组、wortmannin组和siErbB2+IGF-1组细胞增殖、侵袭和迁移能力均下降，而细胞凋亡率上升。与siErbB2组和wortmannin组相比较，siErbB2+IGF-1组细胞增殖、侵袭和迁移能力均上升，而细胞凋亡率下降。以上结果从PI3K/Akt/eNOS信号通路和细胞生物学特性两个方面证实，ErbB2基因沉默或许可通过抑制PI3K/Akt/eNOS信号通路，进而抑制细胞增殖并能促进细胞凋亡。而PI3K/Akt/eNOS信号通路激活可发挥逆转作用。提示ErbB2在卵巢癌的生长转移的调控中可能发挥重要作用，且其分子机制与PI3K/Akt/eNOS信号通路密切相关。
PI3K/Akt/eNOS信号通路在细胞增殖、凋亡中的作用，既往有众多报道。例如，LI等[27]报道，FGF21抑制剂可通过eNOS/PI3K/Akt信号通路抑制人脐静脉内皮细胞的增殖和迁移;AHSAN等[28]的结果显示，磷酸肌酸可通过调节PI3K/Akt/eNOS通路保护内皮细胞免受氧化低密度脂蛋白诱导的凋亡的影响。目前针对ErbB2基因沉默通过PI3K/Akt/eNOS信号通路发挥对卵巢癌细胞生物学特性的影响的研究较少，本文借助RNA干扰技术，从基因和蛋白水平证实ErbB2基因沉默可有效影响人卵巢癌细胞株HO8910细胞增殖、凋亡等生物学行为，提示ErbB2与卵巢癌细胞的生物学行为密切相关，且其可能机制与PI3K/Akt/eNOS信号通路的抑制有关。
综上所述，本文的研究结果显示，ErbB2在卵巢癌细胞中呈高表达，RNA干扰技术可有效抑制ErbB2表达;ErbB2基因沉默可抑制PI3K/Akt/eNOS信号通路，从而抑制卵巢癌细胞增殖、促进其凋亡。而PI3K/Akt/eNOS信号通路激活可逆转ErbB2基因沉默作用，促进卵巢癌细胞增殖并抑制细胞凋亡。本研究结果为临床卵巢癌的基因治疗提供了潜在依据。值得注意的是，本研究以细胞实验探究ErbB2在卵巢癌中的作用及其与PI3K/Akt/eNOS信号通路相关的分子机制，有待进一步动物实验和临床验证。同时，抑制ErbB2在卵巢癌中的表达进而发挥抑癌作用是否受到其他信号通路的影响，均为本研究未来探讨的方向。
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（本文編辑 于国艺）