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摘要：为了探索安徽白山羊超数排卵方法，比较不同超数排卵（简称超排）方案和促卵泡素（FSH）给药方案对安徽白山羊超数排卵效果的影响。结果表明：以8次递减法注射FSH超排安徽白山羊，在撤栓时注射PG，平均回收卵（12.36±667）枚/只；而在撤栓时、撤栓后12 h注射PMSG，分别平均回收卵（14.83±5.88）、（16.13±6.24）枚/只，可见撤栓后12 h注射PMSG的超排效果优于撤栓时注射PG（P<0.05）；用200 IU FSH分别按8次递减注射、8次等量注射、6次递减注射法使安徽白山羊超排，平均回收卵数分别为（22.3±10.74）、（24.0±4.16）、（16.0±2.65）枚/只，且各组间差异不显著；用Day0方案、传统方案超排，平均排卵数分别为（16.50±0.96）、（13.33±3.32）枚/只，胚胎回收数分别为（13.83±2.54）、（12.00±2.89）枚/只，2组间差异不显著。
关键词：安徽白山羊；超数排卵；胚胎；促卵泡素；撤栓
中图分类号：S814.6；S826.8 93 文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）02-0214-02
收稿日期：2014-03-14
基金项目：安徽省自主创新专项（编号：12z010244）。
作者简介：詹年（1988—），男，安徽明光人，硕士研究生，主要从事哺乳动物胚胎工程研究。E-mail：zhanian@126.com。
通信作者：刘亚，博士，副教授，主要从事动物繁殖生物技术研究。Tel：（0551）65785492；E-mail：liuya@ahau.edu.cn。安徽白山羊是优良的地方品种，具有耐粗饲、适应性强、繁殖率高、肉和板皮质量好的优点[1]，但也存在体型较小、生长发育速度较慢等缺点[2]。转基因技术可在较短时间内培育出常规方法不能或需要较长时期才能育成的品种或种群[3]，原核期胚胎显微注射及体细胞核移植是生产转基因动物的重要手段，而这2种技术都需要获得足够数量的待转动物的卵/胚。因此，研究安徽白山羊超数排卵（简称超排）方法是对其进行转基因育种的必要前提。
1材料与方法
1.1试验材料
1.1.1试验动物从合肥博大牧业科技开发有限公司种羊场及砀山田丰牧业科技有限公司选取体况良好、无繁殖疾病史的健康经产育龄安徽白山羊。在试验前2～3个月单独分群饲养，并对所有供体肌肉注射0.2 mg氯前列烯醇（PG）以确保其处于未孕状态。
1.1.2主要药品注射用垂体促卵泡素（FSH），羊超数排卵专用，购自浙江省宁波市三生药业有限公司；注射用血促性素（HCG），购自宁波第二激素厂；注射用垂体促黄体素（LH）和注射用促性腺激素释放激素（GnRH），均购自宁波三生药业有限公司；氯前列烯醇，购自辽宁省丹东市绿丹和华动物药业有限公司；盐酸赛拉嗪注射液和盐酸苯唑注射液，均购自吉林省华牧动物保健品有限公司；羊炔诺酮阴道缓释装置（孕酮阴道栓），购自西北农林科技大学。
1.2试验设计
1.2.13种传统超排方案效果的比较将51只供体山羊随机分成3组：第1组22只，第2组6只，第3组23只。分别采用以下3种不同的方案进行超排处理，比较其超排效果。
超排方案1：于周期的任意早晨放置孕酮阴道栓（记为0 d），从开始后10 d的早晨开始递减法肌肉注射FSH，2次/d，间隔12 h，连用4 d，剂量分别为32、30、28、26、24、22、20、18 IU/只；在注射FSH的最后1 d（开始后13 d）上午撤栓，同时肌肉注射0.3 mg/只 PG；开始后14 d晚上肌肉注射 100 IU/只 LH；母羊发情12 h后配种，间隔12 h复配1～2次。配种结束后3 d从输卵管回收胚胎。
超排方案2：在撤栓时注射250 IU/只 孕马血清促性腺激素（PMSG），其余同“超排方案1”。
超排方案3：与“超排方案2”相似，但PMSG的注射时间改在撤栓后12 h。
1.2.2不同FSH给药方案超排效果的比较将18只供体母羊随机分成3组，每组6只，分别采用如下3种不同的FSH注射方案进行超排，比较其超排效果。
FSH给药方案1：与“1.2.1”节超排试验设计1中的方案3完全相同。
FSH给药方案2：与“FSH给药方案1”基本相同，将FSH递减注射改为等量注射，即注射FSH 25 IU/（只·次），连续注射8次。
FSH给药方案3：与“FSH给药方案1”相似，将FSH递减注射由8次改为6次，剂量分别为50、50、30、30、20、20 IU/只。
1.2.3Day0超排方案与传统超排方案效果的比较Day0超排方案。供体山羊在任意日放置孕酮阴道栓（记为-9 d），6 d 后撤栓（-3 d），同时注射250 IU/只 PMSG和0.2 mg/只 PG进行同期发情处理。撤栓后1 d注射25 μg/只 GnRH，约2 d后母羊排卵（此时记为0 d）。自0 d早晨开始，按递减法间隔12 h每天早、晚2次注射FSH，连续3 d，剂量分别为40、38、36、34、32、30 IU/只，第5、第6次注射FSH的同时注射02 mg/只 PG。周期第3天下午再次注射25 μg/只 GnRH，第11天回收胚胎。
传统超排方案。与“1.2.1”节中超排方案3相同。
1.3胚胎回收
在最后一次配种后3 d通过腹腔镜检查卵巢反应，并采用手术法从输卵管回收胚胎。
1.4统计分析
试验数据采用SPSS 17.0软件进行方差分析。
2结果与分析
2.1不同传统超排方案超排效果的比较 如表1所示，在撤栓后12 h注射PMSG组的平均回收卵数最多，达（16.13±6.24）枚/只，显著高于撤栓时注射PG组（P<0.05）；其次为撤栓时注射PMSG组，平均回收卵（1483±5.88）枚/头，与其余2组之间的差异均不显著。
2.2不同FSH给药方案超排效果的比较
3种FSH给药方案的平均回收胚胎数分别为 22.3、24.0、16.0枚/只，说明同剂量FSH分4 d进行8次注射优于分 3 d 进行6次注射，但进行8次递减注射与等量注射间超排效果差异不显著（表2）。
3结论
3.1不同常规超排方案对超排效果的影响
岳奎忠等发现，在第1次注射FSH时加注PMSG 200 IU/只可显著提高供体母羊平均排卵数及胚胎回收数[4]。本研究发现，在撤栓后12 h注射PMSG的平均排卵数最高（16.13枚/只），显著高于撤栓时注射PG组（12.36枚/只）（P<005），而在撤栓时注射PMSG的平均回收胚胎数为1483枚/只，与其余2组间差异均不显著，这可能与试验样本量较少有关。但也有研究表明，在撤栓时注射PMSG减少了排卵数，并降低了A、B级胚胎比例[5]，与本试验结果截然相反。因此，有关注射PMSG的时机及其对超排效果的影响还有待进一步扩大试验进行验证。
3.2不同FSH给药方案对山羊超排效果的影响
在应用FSH进行超数排卵时一般都是采用递减注射法，有分为8次注射（2次/d，间隔12 h，连注4 d）的，也有分为6次的（2次/d，间隔12 h，连注3 d）[6-7]。本试验结果显示，同等FSH剂量下，分为8次的递减注射法及等量注射法平均获卵数高于分为6次的递减注射法（三者排卵数分别为22.3、24.0、16.0枚/只），但各组间差异并不显著，这可能是由于样本数过少。
3.3Day0超排方案与传统超排方案效果的比较
Day0方案是近年来出现的一种新的超数排卵方案，即在排卵当日进行超排处理，使周期的第1波卵泡成熟排卵。此时无优势卵泡存在，也就不存在优势卵泡对卵泡募集的抑制作用，从而增加了排卵数及胚胎回收数。本试验中Day0方案与传统方案在黄体数和胚胎数上差异并不显著，验证了Day0方案在安徽白山羊超排上的可行性，进一步可测定安徽白山羊的卵泡波曲线，找到更准确的第1次卵泡波时间，改进超排方案。考虑到Day0方案可减少排卵后异常情况（如未排的大卵泡及早期黄体退化等）的发生[8]，今后可使用此方案。
参考文献：
[1]刘彪. 安徽白山羊品种资源的保护与开发利用[J]. 养殖与饲料，2009（4）：76-78.
[2]任守文，张浩，李赛明，等. 杂交对安徽白山羊生长发育性能的影响[J]. 南京农业大学学报，2002，25（3）：57-60.
[3]童佳，李宁. 转基因技术改良家畜的现状与趋势[J]. 中国农业科技导报，2007，9（4）：26-31.
[4]岳奎忠，于元松，周佳勃，等. 改进山羊超数排卵方法的研究[J]. 东北农业大学学报，2000，31（1）：72-76.
[5]Menchaca A，Vilario M，Pinczak A，et al. Progesterone treatment，FSH plus eCG，GnRH administration，and Day 0 protocol for MOET programs in sheep[J]. Theriogenology，2009，72（4）：477-483.
[6]Ginther O J，Kot K，Wiltbank M C. Associations between emergence of follicular waves and fluctuations in FSH concentrations during the estrous cycle in ewes[J]. Theriogenology，1995，43（3）：689-703.
[7]Cognié Y. State of the art in sheep-goat embryo transfer[J]. Theriogenology，1999，51（1）：105-116.
[8]Rubianes E，Ungerfeld R，Violes C，et al. Ovarian response to gonadotropin treatment initiated relative to wave emergence in ultrasonographically monitored ewes[J]. Theriogenology，1997，47（8）：1479-1488.马超锋. 肉鸭重组禽流感病毒灭活疫苗（H5N1亚型，Re-6株）母源抗体消长规律及免疫程序研究[J]. 江苏农业科学，2015，43（2）：216-217，290.
关键词：安徽白山羊；超数排卵；胚胎；促卵泡素；撤栓
中图分类号：S814.6；S826.8 93 文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）02-0214-02
收稿日期：2014-03-14
基金项目：安徽省自主创新专项（编号：12z010244）。
作者简介：詹年（1988—），男，安徽明光人，硕士研究生，主要从事哺乳动物胚胎工程研究。E-mail：zhanian@126.com。
通信作者：刘亚，博士，副教授，主要从事动物繁殖生物技术研究。Tel：（0551）65785492；E-mail：liuya@ahau.edu.cn。安徽白山羊是优良的地方品种，具有耐粗饲、适应性强、繁殖率高、肉和板皮质量好的优点[1]，但也存在体型较小、生长发育速度较慢等缺点[2]。转基因技术可在较短时间内培育出常规方法不能或需要较长时期才能育成的品种或种群[3]，原核期胚胎显微注射及体细胞核移植是生产转基因动物的重要手段，而这2种技术都需要获得足够数量的待转动物的卵/胚。因此，研究安徽白山羊超数排卵（简称超排）方法是对其进行转基因育种的必要前提。
1材料与方法
1.1试验材料
1.1.1试验动物从合肥博大牧业科技开发有限公司种羊场及砀山田丰牧业科技有限公司选取体况良好、无繁殖疾病史的健康经产育龄安徽白山羊。在试验前2～3个月单独分群饲养，并对所有供体肌肉注射0.2 mg氯前列烯醇（PG）以确保其处于未孕状态。
1.1.2主要药品注射用垂体促卵泡素（FSH），羊超数排卵专用，购自浙江省宁波市三生药业有限公司；注射用血促性素（HCG），购自宁波第二激素厂；注射用垂体促黄体素（LH）和注射用促性腺激素释放激素（GnRH），均购自宁波三生药业有限公司；氯前列烯醇，购自辽宁省丹东市绿丹和华动物药业有限公司；盐酸赛拉嗪注射液和盐酸苯唑注射液，均购自吉林省华牧动物保健品有限公司；羊炔诺酮阴道缓释装置（孕酮阴道栓），购自西北农林科技大学。
1.2试验设计
1.2.13种传统超排方案效果的比较将51只供体山羊随机分成3组：第1组22只，第2组6只，第3组23只。分别采用以下3种不同的方案进行超排处理，比较其超排效果。
超排方案1：于周期的任意早晨放置孕酮阴道栓（记为0 d），从开始后10 d的早晨开始递减法肌肉注射FSH，2次/d，间隔12 h，连用4 d，剂量分别为32、30、28、26、24、22、20、18 IU/只；在注射FSH的最后1 d（开始后13 d）上午撤栓，同时肌肉注射0.3 mg/只 PG；开始后14 d晚上肌肉注射 100 IU/只 LH；母羊发情12 h后配种，间隔12 h复配1～2次。配种结束后3 d从输卵管回收胚胎。
超排方案2：在撤栓时注射250 IU/只 孕马血清促性腺激素（PMSG），其余同“超排方案1”。
超排方案3：与“超排方案2”相似，但PMSG的注射时间改在撤栓后12 h。
1.2.2不同FSH给药方案超排效果的比较将18只供体母羊随机分成3组，每组6只，分别采用如下3种不同的FSH注射方案进行超排，比较其超排效果。
FSH给药方案1：与“1.2.1”节超排试验设计1中的方案3完全相同。
FSH给药方案2：与“FSH给药方案1”基本相同，将FSH递减注射改为等量注射，即注射FSH 25 IU/（只·次），连续注射8次。
FSH给药方案3：与“FSH给药方案1”相似，将FSH递减注射由8次改为6次，剂量分别为50、50、30、30、20、20 IU/只。
1.2.3Day0超排方案与传统超排方案效果的比较Day0超排方案。供体山羊在任意日放置孕酮阴道栓（记为-9 d），6 d 后撤栓（-3 d），同时注射250 IU/只 PMSG和0.2 mg/只 PG进行同期发情处理。撤栓后1 d注射25 μg/只 GnRH，约2 d后母羊排卵（此时记为0 d）。自0 d早晨开始，按递减法间隔12 h每天早、晚2次注射FSH，连续3 d，剂量分别为40、38、36、34、32、30 IU/只，第5、第6次注射FSH的同时注射02 mg/只 PG。周期第3天下午再次注射25 μg/只 GnRH，第11天回收胚胎。
传统超排方案。与“1.2.1”节中超排方案3相同。
1.3胚胎回收
在最后一次配种后3 d通过腹腔镜检查卵巢反应，并采用手术法从输卵管回收胚胎。
1.4统计分析
试验数据采用SPSS 17.0软件进行方差分析。
2结果与分析
2.1不同传统超排方案超排效果的比较 如表1所示，在撤栓后12 h注射PMSG组的平均回收卵数最多，达（16.13±6.24）枚/只，显著高于撤栓时注射PG组（P<0.05）；其次为撤栓时注射PMSG组，平均回收卵（1483±5.88）枚/头，与其余2组之间的差异均不显著。
2.2不同FSH给药方案超排效果的比较
3种FSH给药方案的平均回收胚胎数分别为 22.3、24.0、16.0枚/只，说明同剂量FSH分4 d进行8次注射优于分 3 d 进行6次注射，但进行8次递减注射与等量注射间超排效果差异不显著（表2）。
3结论
3.1不同常规超排方案对超排效果的影响
岳奎忠等发现，在第1次注射FSH时加注PMSG 200 IU/只可显著提高供体母羊平均排卵数及胚胎回收数[4]。本研究发现，在撤栓后12 h注射PMSG的平均排卵数最高（16.13枚/只），显著高于撤栓时注射PG组（12.36枚/只）（P<005），而在撤栓时注射PMSG的平均回收胚胎数为1483枚/只，与其余2组间差异均不显著，这可能与试验样本量较少有关。但也有研究表明，在撤栓时注射PMSG减少了排卵数，并降低了A、B级胚胎比例[5]，与本试验结果截然相反。因此，有关注射PMSG的时机及其对超排效果的影响还有待进一步扩大试验进行验证。
3.2不同FSH给药方案对山羊超排效果的影响
在应用FSH进行超数排卵时一般都是采用递减注射法，有分为8次注射（2次/d，间隔12 h，连注4 d）的，也有分为6次的（2次/d，间隔12 h，连注3 d）[6-7]。本试验结果显示，同等FSH剂量下，分为8次的递减注射法及等量注射法平均获卵数高于分为6次的递减注射法（三者排卵数分别为22.3、24.0、16.0枚/只），但各组间差异并不显著，这可能是由于样本数过少。
3.3Day0超排方案与传统超排方案效果的比较
Day0方案是近年来出现的一种新的超数排卵方案，即在排卵当日进行超排处理，使周期的第1波卵泡成熟排卵。此时无优势卵泡存在，也就不存在优势卵泡对卵泡募集的抑制作用，从而增加了排卵数及胚胎回收数。本试验中Day0方案与传统方案在黄体数和胚胎数上差异并不显著，验证了Day0方案在安徽白山羊超排上的可行性，进一步可测定安徽白山羊的卵泡波曲线，找到更准确的第1次卵泡波时间，改进超排方案。考虑到Day0方案可减少排卵后异常情况（如未排的大卵泡及早期黄体退化等）的发生[8]，今后可使用此方案。
参考文献：
[1]刘彪. 安徽白山羊品种资源的保护与开发利用[J]. 养殖与饲料，2009（4）：76-78.
[2]任守文，张浩，李赛明，等. 杂交对安徽白山羊生长发育性能的影响[J]. 南京农业大学学报，2002，25（3）：57-60.
[3]童佳，李宁. 转基因技术改良家畜的现状与趋势[J]. 中国农业科技导报，2007，9（4）：26-31.
[4]岳奎忠，于元松，周佳勃，等. 改进山羊超数排卵方法的研究[J]. 东北农业大学学报，2000，31（1）：72-76.
[5]Menchaca A，Vilario M，Pinczak A，et al. Progesterone treatment，FSH plus eCG，GnRH administration，and Day 0 protocol for MOET programs in sheep[J]. Theriogenology，2009，72（4）：477-483.
[6]Ginther O J，Kot K，Wiltbank M C. Associations between emergence of follicular waves and fluctuations in FSH concentrations during the estrous cycle in ewes[J]. Theriogenology，1995，43（3）：689-703.
[7]Cognié Y. State of the art in sheep-goat embryo transfer[J]. Theriogenology，1999，51（1）：105-116.
[8]Rubianes E，Ungerfeld R，Violes C，et al. Ovarian response to gonadotropin treatment initiated relative to wave emergence in ultrasonographically monitored ewes[J]. Theriogenology，1997，47（8）：1479-1488.马超锋. 肉鸭重组禽流感病毒灭活疫苗（H5N1亚型，Re-6株）母源抗体消长规律及免疫程序研究[J]. 江苏农业科学，2015，43（2）：216-217，290.