【摘 要】
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[目的]研究T1083替换融合质粒载体pGBKT7-Ts转入酵母的自激活实验,探讨其表达产物是否可作为诱饵进行酵母双杂交筛选.[方法]将T1083 替换突变BD融合质粒载体pGBKT7-TS转入酵
【机 构】
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商丘职业技术学院,河南商丘,476100
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[目的]研究T1083替换融合质粒载体pGBKT7-Ts转入酵母的自激活实验,探讨其表达产物是否可作为诱饵进行酵母双杂交筛选.[方法]将T1083 替换突变BD融合质粒载体pGBKT7-TS转入酵母后,进行自激活和蛋白表达毒性检测试验.pGBKT7-TS对报告基因自主激活的检测.将pGBKT7-TS质粒转染S.cerevisiae strain AH109和S.cerevisiae Y187菌株,同时分别转入pGBKT7作为对照,在SD-Trp平板上挑取转化菌落,悬于适量无菌水中,再分别接种于SD-Trp+ X-α-gal、SD-Trp-His + X-α-gal、SD-Trp-Ade + X-α-gal和SD-Trp-Ade-His + X-α-gal平板.30 ℃培养2～3 d,观察各平板菌落颜色.确定含有pGBKT7-TS质粒的AH109和Y187酵母细胞内HIS、ADE、Mel1、LacZ报告基因的表达情况.pGBKT7-TS对酵母AH109和Y187的毒性检测、挑取大于2 mm的pGBKT7-TS转化的AH109克隆和pGBKT7-TS转化的Y187克隆各1个,分别接种于50 ml SD/-Trp+Kan(20 μg/ml)培养基中,30 ℃、 250 r/min 培养16 h,检测OD600,若OD600<0.8,则DNA-BD可能有毒性;若OD600≥0.8,说明DNA-BD无毒性.[结果]转化pGBKT7-TS的酵母菌AH109 在SD-Trp + X-α-gal平板和SD-Trp-His + X-α-gal平板上均可长出菌落,但在SD-Trp-Ade + X-α-gal平板和SD-Trp-Ade-His+ X-α-gal平板上均无菌落生长,表明转入pGBKT7-TS后His报告基因有泄漏表达,但不能激活ADE 和 MEL I 报告基因.毒性检测试验中,重复2次,其OD600 均大于0.8,说明DNA-BD融合蛋白对酵母AH109和Y187的生长无毒性,可以作为诱饵进行酵母双杂交筛选.[结论]为进一步研究NtKRP尾部T1083替换对NtKRP与靶物质结合的影响奠定了试验基础.
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