观察雌激素在小鼠表皮发育和KC(人表皮细胞株HaCaT)增殖中的作用并探讨其机制。
方法(1)通过阴道脱落细胞检查法选取5只处于动情期成年C57BL/6小鼠设为动情期组，另将性发育前行卵巢切除的5只成年C57BL/6小鼠设为卵巢切除组。取2组小鼠尾根部全层皮肤，HE染色观测表皮厚度，免疫组织化学染色观察表皮中增殖细胞核抗原(PCNA)阳性细胞分布并计数。(2)取对数生长期HaCaT细胞，用含体积分数10%FBS的RPMI 1640培养液培养，按随机数字表法分为阴性对照组、单纯雌二醇组、蛋白激酶B(Akt)抑制剂组、细胞外信号调节激酶(ERK)抑制剂组，每组20孔。各组培养液中，阴性对照组加入1 μL二甲基亚砜；单纯雌二醇组加入100 nmol/L 17β-雌二醇1 μL；Akt抑制剂组和ERK抑制剂组均加入同前剂量与体积17β-雌二醇，另分别加入10 μmol/L LY294002和30 μmol/L PD98059各1 μL。分别于培养0(即刻)、24、48、72 h，每组取5孔细胞，用细胞计数试剂盒8与酶标仪检测细胞增殖活性。(3)取对数生长期HaCaT细胞，同前分组处理，每组3孔。培养72 h，用流式细胞仪检测细胞周期分布，计算细胞增殖指数(PI)。(4)取对数生长期HaCaT细胞，同前分组处理，每组3皿。培养72 h，蛋白质印迹法检测细胞中磷酸化Akt(p-Akt)、磷酸化ERK(p-ERK)和PCNA蛋白水平。细胞实验均重复3次。对数据行t检验、单因素方差分析、析因设计方差分析、LSD检验。
结果(1)卵巢切除组小鼠表皮厚度为(33.5±3.0)μm，明显薄于动情期组的(51.4±3.1)μm(t＝20.7，P<0.01)。2组小鼠PCNA阳性细胞主要集中于表皮基底层；卵巢切除组小鼠表皮中PCNA阳性细胞数为每200倍视野下(37±12)个，明显少于动情期组的每200倍视野下(96±15)个(t＝15.3，P<0.01)。(2)培养0～48 h，单纯雌二醇组与阴性对照组细胞增殖活性差异不明显(P值均大于0.05)。培养72 h，与阴性对照组比较，单纯雌二醇组细胞增殖活性明显增高(P<0.01)；Akt抑制剂组、ERK抑制剂组细胞增殖活性均明显低于前2组(P值均小于0.01)。(3)与阴性对照组的(51.6±1.1)%比较，单纯雌二醇组细胞PI明显升高[(58.5±0.8)%，P<0.05]；Akt抑制剂组、ERK抑制剂组细胞PI分别为(34.9±0.8)%、(48.2±0.4)%，均明显低于前2组(P值均小于0.01)。(4)与阴性对照组的0.566±0.034比较，单纯雌二醇组细胞p-Akt蛋白水平明显升高(1.048±0.077，P<0.01)；Akt抑制剂组和ERK抑制剂组细胞p-Akt蛋白水平分别为0.682±0.095、0.672±0.019，明显低于单纯雌二醇组(P值均小于0.01)。与阴性对照组的0.469±0.013比较，单纯雌二醇组、Akt抑制剂组、ERK抑制剂组细胞p-ERK蛋白水平均明显升高(1.064±0.089、1.010±0.038、0.778±0.065，P值均小于0.01)。与单纯雌二醇组比较，ERK抑制剂组细胞p-ERK蛋白水平明显降低(P<0.01)。与阴性对照组的0.386±0.053比较，单纯雌二醇组细胞的PCNA蛋白水平明显升高(0.743±0.043，P<0.01)；Akt抑制剂组和ERK抑制剂组细胞PCNA蛋白水平分别为0.264±0.019、0.223±0.065，明显低于前2组(P值均小于0.01)。
结论雌激素缺乏时，小鼠表皮发育能力减弱。雌激素(17β-雌二醇)可通过激活ERK/Akt信号通路上调PCNA表达，以促进HaCaT细胞的增殖。