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[摘要] 目的 检测基质金属蛋白酶-9（MMP-9）和血管内皮生长因子（VEGF）在非小细胞肺癌组织中的表达，并评估其预后价值。 方法 应用免疫组织化学技术检测86例非小细胞肺癌和60例正常肺组织中MMP-9和VEGF的表达，分析其在不同临床特征中的价值，关注其表达对判断预后的意义。 结果 非小细胞肺癌中MMP-9和VEGF表达的阳性率明显高于正常肺组织，MMP-9和VEGF的表达与非小细胞肺癌肿瘤的直径、胸膜侵犯、分化程度及淋巴结转移有关，非小细胞肺癌中MMP-9和VEGF的表达呈正相关，生存分析显示MMP-9和VEGF的表达与患者的预后有关。 结论 非小细胞肺癌中MMP-9和VEGF高表达，MMP-9可能对肿瘤的血管形成有促进作用，联合检测MMP-9和VEGF的表达可能与非小细胞肺癌患者的预后有关。
[关键词] 非小细胞肺癌；血管内皮生长因子；基质金属蛋白酶-9；预后；免疫组织化学
[中图分类号] R734.2 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2012）16-0058-02
Expression and significance of MMP-9 and VEGF in non-small cell lung carcinoma
LI Jie
Department of Thoracic Surgery, the Second Hospital of Ningbo City, Ningbo 315000, China
[Abstract] Objective To investigate the protein expressions of MMP-9 and VEGF, observe their relationship and clinical significance on development and metastasis of non-small cell lung carcinoma. Methods We detected the protein expressions of MMP-9 and VEGF by IHC in the non-small cell lung carcinoma (86 cases) and normal lung tissues (60 cases). Their expression relationship and different pathological characters in the non-small cell lung carcinoma were analyzed. Results The protein expressions of MMP-9 and VEGF were higher in the neoplasm than in normal lung tissues. Their expressions were correlated with diameter, pleura invasion, differentiation and lymph node metastasis. Positive correlation between MMP-9 and VEGF protein were found in neoplasm. The expressions of MMP-9 and VEGF were correlated with prognosis. Conclusion The higher expressions of MMP-9 and VEGF are found in non-small cell lung carcinoma. The combined detection of MMP-9 and VEGF may be helpful for prognosis of neoplasm.
[Key words] Non-small cell lung carcinoma; VEGF; MMP-9; Prognosis; Immunohistochemistry
非小细胞肺癌在发生发展过程中，常存在着旺盛的血管生成。基质金属蛋白酶家族在肿瘤的发生发展中具有重要的生物学作用，而且其相关成员对肿瘤的血管生成有一定促进作用。本实验应用免疫组织化学技术检测非小细胞肺癌中基质金属蛋白酶-9（MMP-9）和血管内皮生长因子（VEGF）的表达，探讨肿瘤中MMP-9和VEGF表达的关系及对判断预后的意义，旨在为临床探讨肿瘤的发生发展及治疗提供理论帮助。
1 材料与方法
1.1 材料
收集我院2007年1月～2008年10月非小细胞肺癌手术后预留的蜡块组织。纳入均符合WHO关于肺肿瘤的诊断标准。排除标准[1]：术前行放疗、化疗的患者；临床资料不完整的患者。观察组共86例，其中男46例，女40例，年龄34～76岁，平均55.9岁。同时选取手术切缘经病理证实为正常的肺组织60例作为对照组，其中男30例，女30例，年龄35～74岁，平均55.1岁。两组患者的一般临床特征比较差异无统计学意义，具有可比性。
1.2 免疫组织化学方法
MMP-9和VEGF免疫组化试剂的浓缩液均购自北京中杉金桥生物技术有限公司，在进行实验前进行预实验，选择最佳稀释比例，所有标本均应用免疫组化SP法进行。具体步聚：脱蜡，水化组织切片，3%H2O2去离子水孵育10 min，以阻断内源性过氧化物酶；抗原修复后分别滴加一抗，室温37℃孵育1～2 h或过夜，PBS冲洗，5 min×3次；滴加生物素标记的二抗，室温37℃孵育20 min，PBS冲洗，5 min×3次；滴加辣根酶标记链霉卵白素，室温37℃孵育20～30 min，PBS冲洗，5 min×3次；应用DAB显色剂显色；自来水充分冲洗、复染、脱水、透明、封片。实验中的检测均由同一病理技师完成，并在显微镜下显色观察，严格质控。 1.3 结果判定标准[2]
MMP-9和VEGF免疫组化染色结果均由两位病理科主治医师得出。将MMP-9和VEGF蛋白在细胞浆出现棕黄色定为阳性。切片中找5个典型的高倍视野，计算阳性细胞的百分比。
1.4 统计学方法
数据均应用SAS6.12进行统计学分析，两组间资料的比较采用t检验，并行相关性检验及生存分析，P ＜ 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 观察组与对照组中MMP-9和VEGF表达量的比较
观察组与对照组中MMP-9（58.14±5.42 vs 38.33±5.25，t = 5.434 6，P = 0.015 5）和VEGF（65.12±7.26 vs 30.00±6.74，t = 11.326 3，P = 0.000 3）的表达量差异有统计学意义。
2.2 观察组MMP-9和VEGF的表达在不同临床病理特征中的关系
观察组中MMP-9和VEGF的表达与肿瘤的直径（55.46±6.53 vs 60.53±6.03；60.53±7.64 vs 68.54±6.59）、胸膜侵犯（56.52±5.93 vs 62.32±6.57；62.32±5.39 vs 71.64±6.48）、淋巴结转移（56.94±6.52 vs 63.25±5.49；62.41±6.49 vs 72.19±5.86）及分化程度（55.14±6.05 vs 61.14±7.64；63.42±7.54 vs 69.75±6.94）密切相关。见表1。
2.3 观察组中MMP-9和VEGF表达的相关性
线性相关分析即Pearson法结果显示，观察组中MMP-9和VEGF的表达呈正相关（r = 0.42，P = 0.015 4），而对照组中MMP-9和VEGF的表达未见明显的相关性（P = 0.243 6）。
2.4 观察组中MMP-9和VEGF的表达与预后的关系
本组患者随访时间为6～60个月，平均31.3个月。MMP-9和VEGF阳性患者的生存明显短于MMP-9（25.45±5.46 vs 41.20±6.53）和VEGF（24.36±6.04 vs 41.95±5.93）阴性患者（P ＜ 0.05），即MMP-9和VEGF高表达的患者预后差。
3 讨论
肿瘤的生物学是当今研究的热点，而肿瘤的生长、侵袭和转移是重要的生物学行为。肿瘤的生长依靠血管生成，而在侵袭和转移过程中，肿瘤细胞必须穿过由细胞外基质和基底膜构成的屏障，而在此过程中起作用的是基质金属蛋白酶家族。MMP-9是一种锌离子依赖的蛋白水解酶，也称明胶酶B，可由肿瘤细胞和间质细胞以酶原形式分泌并经水解后激活，具有较强的降解基底膜成份功能，被认为与肿瘤的恶性进程、侵袭和转移密切相关[3，4]。VEGF是由2条相对分子量为23 000的单链组成的蛋白质，是目前公认的研究较为深入的促血管内皮生长因子，对肿瘤基质血管形成及肿瘤生物学行为均有重要影响，其表达与肿瘤的预后有关[5]，并能直接作用于血管内皮细胞，引起内皮细胞的增殖。
本实验应用对照观察的方法，采用免疫组织化学技术，检测非小细胞肺癌及正常肺组织中MMP-9和VEGF的表达，结果显示肿瘤中MMP-9和VEGF的表达阳性率明显高于对照组，提示二者在非小细胞肺癌的发生及进展中具有重要作用。实验结果显示观察组中MMP-9和VEGF的表达均与肿瘤的直径、胸膜侵犯、淋巴结转移及分化程度密切相关，由于肿瘤体积、胸膜侵犯、分化程度及淋巴结转移均与患者的预后有关，因此联合检测肿瘤中MMP-9和VEGF的表达可能对判断预后有一定意义，而且生存分析直接证实了此结论。实验结果显示非小细胞肺癌组织中MMP-9和VEGF的表达呈正相关，提示MMP-9和VEGF在蛋白水平上具有协同正向作用。MMP-9可能作为上游基因，调节VEGF的表达，促进肿瘤中新生血管形成，同时VEGF表达增加，可以增加肿瘤间质毛细血管壁的通透性。观察组中的相关性结论也进一步说明了MMP家族在肿瘤的血管化中发挥重要作用，而对照组中MMP-9和VEGF的表达无明显相关性，即MMP-9和VEGF在肿瘤中的协同作用明显，对促进肿瘤的进展有重要作用。当MMP-9引起VEGF的激活后，通过与细胞膜上特异性受体结合而发挥多种生物学效应：特异性地促进内皮细胞分裂增殖，改变内皮细胞的基因表达方式，增加微血管的新生[6，7]。因此，MMP-9和VEGF的协同作用可能是非小细胞肺癌发生发展中的通路，具体机制尚有待进一步研究明确。因此，设想阻断MMP-9和VEGF通路的治疗，可能成为非小细胞肺癌治疗的新策略。
综上所述，非小细胞肺癌中MMP-9和VEGF高表达，MMP-9和VEGF可能具有协同作用，二者对肿瘤的进展有促进作用，联合检测MMP-9和VEGF的表达可能与患者的预后有关。
[参考文献]
[1] 闫继东，张志勇，任淑华，等. Smad4在非小细胞肺癌中表达的研究[J]. 重庆医学，2011，40（28）：2884-2886.
[2] 王丽萍，李洪亮，刘爱东，等. PPARγ和MMP-9在胃癌中的表达及临床意义[J]. 山东医药，2010，50（32）：50-52.
[3] Hong DY，Lee BJ，Lee JC，et al. Expression of VEGF, HGF, IL-6, IL-8, MMP-9, Telomerase in peripheral blood of patients with head and neck squamous cell carcinoma[J]. Clin Exp Otorhinolaryngol，2009，2（4）：186-192.
[4] 戴磊，陈铭伍，冼磊. MMP-9在非小细胞肺癌组织中的表达及意义[J]. 广西医学，2011，33（1）：8-10.
[5] Zhao R，Liu XQ，Wu XP，et al. Vascular endothelial growth factor (VEGF） enhances gastric carcinoma invasiveness via integrin alpha(v)beta6[J]. Cancer Lett，2010，287（2）：150-156.
[6] Liu CJ，Chang KW，Lin SC，et al. Presurgical serum levels of matrix metalloproteinase-9 and vascular endothelial growth factor in oral squamous cell carcinoma[J]. Oral Oncol，2009，45（10）：920-925.
[7] 刘爱东，庞久玲，刘士生. 胃癌中基质金属蛋白酶-9和CD105表达关系的研究[J]. 中国老年学杂志，2009，29（7）：886-887.
（收稿日期：2012-01-06）
[关键词] 非小细胞肺癌；血管内皮生长因子；基质金属蛋白酶-9；预后；免疫组织化学
[中图分类号] R734.2 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2012）16-0058-02
Expression and significance of MMP-9 and VEGF in non-small cell lung carcinoma
LI Jie
Department of Thoracic Surgery, the Second Hospital of Ningbo City, Ningbo 315000, China
[Abstract] Objective To investigate the protein expressions of MMP-9 and VEGF, observe their relationship and clinical significance on development and metastasis of non-small cell lung carcinoma. Methods We detected the protein expressions of MMP-9 and VEGF by IHC in the non-small cell lung carcinoma (86 cases) and normal lung tissues (60 cases). Their expression relationship and different pathological characters in the non-small cell lung carcinoma were analyzed. Results The protein expressions of MMP-9 and VEGF were higher in the neoplasm than in normal lung tissues. Their expressions were correlated with diameter, pleura invasion, differentiation and lymph node metastasis. Positive correlation between MMP-9 and VEGF protein were found in neoplasm. The expressions of MMP-9 and VEGF were correlated with prognosis. Conclusion The higher expressions of MMP-9 and VEGF are found in non-small cell lung carcinoma. The combined detection of MMP-9 and VEGF may be helpful for prognosis of neoplasm.
[Key words] Non-small cell lung carcinoma; VEGF; MMP-9; Prognosis; Immunohistochemistry
非小细胞肺癌在发生发展过程中，常存在着旺盛的血管生成。基质金属蛋白酶家族在肿瘤的发生发展中具有重要的生物学作用，而且其相关成员对肿瘤的血管生成有一定促进作用。本实验应用免疫组织化学技术检测非小细胞肺癌中基质金属蛋白酶-9（MMP-9）和血管内皮生长因子（VEGF）的表达，探讨肿瘤中MMP-9和VEGF表达的关系及对判断预后的意义，旨在为临床探讨肿瘤的发生发展及治疗提供理论帮助。
1 材料与方法
1.1 材料
收集我院2007年1月～2008年10月非小细胞肺癌手术后预留的蜡块组织。纳入均符合WHO关于肺肿瘤的诊断标准。排除标准[1]：术前行放疗、化疗的患者；临床资料不完整的患者。观察组共86例，其中男46例，女40例，年龄34～76岁，平均55.9岁。同时选取手术切缘经病理证实为正常的肺组织60例作为对照组，其中男30例，女30例，年龄35～74岁，平均55.1岁。两组患者的一般临床特征比较差异无统计学意义，具有可比性。
1.2 免疫组织化学方法
MMP-9和VEGF免疫组化试剂的浓缩液均购自北京中杉金桥生物技术有限公司，在进行实验前进行预实验，选择最佳稀释比例，所有标本均应用免疫组化SP法进行。具体步聚：脱蜡，水化组织切片，3%H2O2去离子水孵育10 min，以阻断内源性过氧化物酶；抗原修复后分别滴加一抗，室温37℃孵育1～2 h或过夜，PBS冲洗，5 min×3次；滴加生物素标记的二抗，室温37℃孵育20 min，PBS冲洗，5 min×3次；滴加辣根酶标记链霉卵白素，室温37℃孵育20～30 min，PBS冲洗，5 min×3次；应用DAB显色剂显色；自来水充分冲洗、复染、脱水、透明、封片。实验中的检测均由同一病理技师完成，并在显微镜下显色观察，严格质控。 1.3 结果判定标准[2]
MMP-9和VEGF免疫组化染色结果均由两位病理科主治医师得出。将MMP-9和VEGF蛋白在细胞浆出现棕黄色定为阳性。切片中找5个典型的高倍视野，计算阳性细胞的百分比。
1.4 统计学方法
数据均应用SAS6.12进行统计学分析，两组间资料的比较采用t检验，并行相关性检验及生存分析，P ＜ 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 观察组与对照组中MMP-9和VEGF表达量的比较
观察组与对照组中MMP-9（58.14±5.42 vs 38.33±5.25，t = 5.434 6，P = 0.015 5）和VEGF（65.12±7.26 vs 30.00±6.74，t = 11.326 3，P = 0.000 3）的表达量差异有统计学意义。
2.2 观察组MMP-9和VEGF的表达在不同临床病理特征中的关系
观察组中MMP-9和VEGF的表达与肿瘤的直径（55.46±6.53 vs 60.53±6.03；60.53±7.64 vs 68.54±6.59）、胸膜侵犯（56.52±5.93 vs 62.32±6.57；62.32±5.39 vs 71.64±6.48）、淋巴结转移（56.94±6.52 vs 63.25±5.49；62.41±6.49 vs 72.19±5.86）及分化程度（55.14±6.05 vs 61.14±7.64；63.42±7.54 vs 69.75±6.94）密切相关。见表1。
2.3 观察组中MMP-9和VEGF表达的相关性
线性相关分析即Pearson法结果显示，观察组中MMP-9和VEGF的表达呈正相关（r = 0.42，P = 0.015 4），而对照组中MMP-9和VEGF的表达未见明显的相关性（P = 0.243 6）。
2.4 观察组中MMP-9和VEGF的表达与预后的关系
本组患者随访时间为6～60个月，平均31.3个月。MMP-9和VEGF阳性患者的生存明显短于MMP-9（25.45±5.46 vs 41.20±6.53）和VEGF（24.36±6.04 vs 41.95±5.93）阴性患者（P ＜ 0.05），即MMP-9和VEGF高表达的患者预后差。
3 讨论
肿瘤的生物学是当今研究的热点，而肿瘤的生长、侵袭和转移是重要的生物学行为。肿瘤的生长依靠血管生成，而在侵袭和转移过程中，肿瘤细胞必须穿过由细胞外基质和基底膜构成的屏障，而在此过程中起作用的是基质金属蛋白酶家族。MMP-9是一种锌离子依赖的蛋白水解酶，也称明胶酶B，可由肿瘤细胞和间质细胞以酶原形式分泌并经水解后激活，具有较强的降解基底膜成份功能，被认为与肿瘤的恶性进程、侵袭和转移密切相关[3，4]。VEGF是由2条相对分子量为23 000的单链组成的蛋白质，是目前公认的研究较为深入的促血管内皮生长因子，对肿瘤基质血管形成及肿瘤生物学行为均有重要影响，其表达与肿瘤的预后有关[5]，并能直接作用于血管内皮细胞，引起内皮细胞的增殖。
本实验应用对照观察的方法，采用免疫组织化学技术，检测非小细胞肺癌及正常肺组织中MMP-9和VEGF的表达，结果显示肿瘤中MMP-9和VEGF的表达阳性率明显高于对照组，提示二者在非小细胞肺癌的发生及进展中具有重要作用。实验结果显示观察组中MMP-9和VEGF的表达均与肿瘤的直径、胸膜侵犯、淋巴结转移及分化程度密切相关，由于肿瘤体积、胸膜侵犯、分化程度及淋巴结转移均与患者的预后有关，因此联合检测肿瘤中MMP-9和VEGF的表达可能对判断预后有一定意义，而且生存分析直接证实了此结论。实验结果显示非小细胞肺癌组织中MMP-9和VEGF的表达呈正相关，提示MMP-9和VEGF在蛋白水平上具有协同正向作用。MMP-9可能作为上游基因，调节VEGF的表达，促进肿瘤中新生血管形成，同时VEGF表达增加，可以增加肿瘤间质毛细血管壁的通透性。观察组中的相关性结论也进一步说明了MMP家族在肿瘤的血管化中发挥重要作用，而对照组中MMP-9和VEGF的表达无明显相关性，即MMP-9和VEGF在肿瘤中的协同作用明显，对促进肿瘤的进展有重要作用。当MMP-9引起VEGF的激活后，通过与细胞膜上特异性受体结合而发挥多种生物学效应：特异性地促进内皮细胞分裂增殖，改变内皮细胞的基因表达方式，增加微血管的新生[6，7]。因此，MMP-9和VEGF的协同作用可能是非小细胞肺癌发生发展中的通路，具体机制尚有待进一步研究明确。因此，设想阻断MMP-9和VEGF通路的治疗，可能成为非小细胞肺癌治疗的新策略。
综上所述，非小细胞肺癌中MMP-9和VEGF高表达，MMP-9和VEGF可能具有协同作用，二者对肿瘤的进展有促进作用，联合检测MMP-9和VEGF的表达可能与患者的预后有关。
[参考文献]
[1] 闫继东，张志勇，任淑华，等. Smad4在非小细胞肺癌中表达的研究[J]. 重庆医学，2011，40（28）：2884-2886.
[2] 王丽萍，李洪亮，刘爱东，等. PPARγ和MMP-9在胃癌中的表达及临床意义[J]. 山东医药，2010，50（32）：50-52.
[3] Hong DY，Lee BJ，Lee JC，et al. Expression of VEGF, HGF, IL-6, IL-8, MMP-9, Telomerase in peripheral blood of patients with head and neck squamous cell carcinoma[J]. Clin Exp Otorhinolaryngol，2009，2（4）：186-192.
[4] 戴磊，陈铭伍，冼磊. MMP-9在非小细胞肺癌组织中的表达及意义[J]. 广西医学，2011，33（1）：8-10.
[5] Zhao R，Liu XQ，Wu XP，et al. Vascular endothelial growth factor (VEGF） enhances gastric carcinoma invasiveness via integrin alpha(v)beta6[J]. Cancer Lett，2010，287（2）：150-156.
[6] Liu CJ，Chang KW，Lin SC，et al. Presurgical serum levels of matrix metalloproteinase-9 and vascular endothelial growth factor in oral squamous cell carcinoma[J]. Oral Oncol，2009，45（10）：920-925.
[7] 刘爱东，庞久玲，刘士生. 胃癌中基质金属蛋白酶-9和CD105表达关系的研究[J]. 中国老年学杂志，2009，29（7）：886-887.
（收稿日期：2012-01-06）