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摘要[目的]建立用HPLC测定加米霉素含量的方法。[方法]采用高效液相色谱法，色谱柱为XBridge C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为磷酸盐缓冲液（取0.05 mol/L磷酸氢二钾溶液，用稀磷酸调节pH至8.0）-乙腈（30∶70），流速为1.0 mL/min，柱温为30 ℃;检测波长为205 nm。[结果]加米霉素在0.498 4～1.993 6 mg/mL（r=0.999 9）峰面积与浓度呈良好的线性关系，平均加样回收率为99.2%，RSD=0.6%。[结论]该方法重复性良好，能准确测定加米霉素的含量。
关键词加米霉素;含量测定;HPLC法
中图分类号S859.79文献标识码A
文章编号0517-6611（2019）03-0199-03
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.03.062
加米霉素是法国梅里亚公司开发研制的新一代半合成十五元氮杂环大环内酯类抗菌药物，其注射液分别于2007、2010和2011年被欧洲药品局（EMA）、加拿大保健产品与食品管理局（HPFB）和美国食品与药品管理局（FDA）批准上市[1]，在中国，加米霉素注射液于2017年通过农业农村部进口兽药注册在国内上市销售，用于治疗和预防由溶血性曼氏杆菌、多杀性巴氏杆菌、睡眠嗜组织菌等主要病原菌引起的牛呼吸系统疾病[2-3]。
國内目前已有多家单位在开展加米霉素的仿制研究[4-6]，由于加米霉素的质量标准并未收载于国内外兽药典或各类质量标准汇编，因此在加米霉素及其注射液的仿制过程中，需要建立其质量控制方法。笔者建立了高效液相色谱法测定加米霉素的含量，为其质量控制提供依据。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1研究对象。加米霉素原料，批号20140901、20140902、20140903，由洛阳惠中兽药有限公司生产。加米霉素对照品，含量98.8%，批号HZD140801;6-N-丙基-N-去甲基阿奇霉素对照品，含量95.0%，批号20170724，均由洛阳惠中兽药有限公司制备。
1.1.2主要仪器。高效液相色谱系统（Waters e2695型HPLC;2489型紫外检测器;Empower 2色谱工作站软件），美国Waters公司;XBridge C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），美国Waters公司;AB265-S电子分析天平，梅特勒托利多公司;Seven easy型酸度计，梅特勒托利多公司。
1.1.3主要试剂。磷酸氢二钾、磷酸为分析纯;乙腈为色谱纯;水为超纯水。
1.2方法
1.2.1系统适用性溶液的制备。称取加米霉素与6-N-丙基-N-去甲基阿奇霉素对照品适量，加流动相溶解并稀释制成每1 mL中约含加米霉素1 mg与6-N-丙基-N-去甲基阿奇霉素0.5 mg的混合溶液，即得。
1.2.2对照品溶液的制备。称取加米霉素对照适量，精密称定，加流动相溶解并稀释制成每1 mL中约含加米霉素1 mg的溶液，即得。
1.2.3供试品溶液的制备。称取供试品适量，精密称定，加流动相溶解并稀释制成每1 mL中约含加米霉素1 mg的溶液，即得。
1.2.4色谱条件。色谱柱为Waters XBridge C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流动相为磷酸盐缓冲液（取0.05 mol/L磷酸氢二钾溶液，用稀磷酸调节pH至8.0）-乙腈（30∶70）;流速为1.0 mL/min;检测波长为205 nm;柱温为30 ℃。
1.2.5方法学考察。
1.2.5.1系统适用性试验。分别精密吸取空白溶剂、系统适用性溶液、对照品溶液和供试品溶液20 μL，在“1.2.4”色谱条件下，注入高效液相色谱仪进行测定，记录色谱图，考察系统适用性。
1.2.5.2线性关系考察。精密称取加米霉素对照品，加流动相溶解制成浓度为4.984 0 mg/mL的溶液，作为对照品储备液。精密吸取储备液1.0、1.5、2.0、3.0、4.0 mL，分别置10 mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为不同浓度的对照品溶液。精密吸取上述系列浓度的对照品溶液各20 μL，从低浓度到高浓度依次进样分析，记录色谱图，以浓度（mg/mL）为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线，计算线性回归方程。
1.2.5.3进样精密度试验。取按“1.2.2”方法制备的对照品溶液，精密吸取20 μL，在“1.2.4”色谱条件下，注入高效液相色谱仪进行测定，连续进样6次，计算峰面积的RSD。
1.2.5.4重复性试验。取同一批号的供试品（批号20140901），按“1.2.3”方法平行制备6份供试品溶液，精密吸取20 μL，在“1.2.4”色谱条件下，注入高效液相色谱仪进行测定，计算平均含量和RSD。
1.2.5.5中间精密度试验。取同一批号的供试品（批号20140901），按“1.2.3”方法制备6份供试品溶液，在不同日期由不同人员在不同的高效液相色谱仪上，按“1.2.4”色谱条件进行测定，计算平均含量和RSD。
1.2.5.6稳定性试验。取同一份供试品溶液，按“1.2.4”色谱条件分别于0、2、4、6、8、12 h进样，测定峰面积，计算RSD。
1.2.5.7回收率试验。取同一批号的供试品（批号20140901）约10 mg，精密称定，置20 mL容量瓶中，分别按照测定浓度的80%、100%、120% 3个水平添加加米霉素对照品，按“1.2.3”方法制备供试品溶液，每个浓度水平平行制备3份，按“1.2.4”色谱条件测定，计算平均回收率和RSD。 1.2.6样品测定。取3批供试品，按“1.2.3”方法制备供试品溶液并测定，计算加米霉素的含量。
2结果与分析
2.1方法学考察
2.1.1系统适用性试验。图1表明，在“1.2.4”色谱条件下，加米霉素与6-N-丙基-N-去甲基阿奇霉素的分离度符合要求，空白溶剂在加米霉素对照品相应的保留时间处无干扰。
2.1.2线性关系考察。按“1.2.5.2”方法操作，以浓度（mg/mL）为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线如图2所示，计算得出线性回归方程为y=2.64×106x+26 344（r=0.999 9），表明加米霉素浓度在0.498 4～1.993 6 mg/mL与峰面积呈良好的线性关系。
2.1.3进样精密度试验。按“1.2.5.3”方法操作，计算得出峰面积的RSD为0.3%，表明仪器精密度良好。
2.1.4重复性试验。按“1.2.5.4”方法操作，计算得出平均含量为99.8%，RSD为0.1%，表明该方法重复性良好。
2.1.5中间精密度试验。按“1.2.5.5”方法操作，计算得出平均含量为99.8%，RSD为0.1%，表明该方法中间精密度良好。
2.1.6稳定性试验。按“1.2.5.6”方法操作，计算峰面积的RSD为1.2%，表明供试品溶液在12 h内稳定。
2.1.7回收率试验。由表1可见，平均回收率为99.2%，RSD为0.6%，表明該方法准确度良好。
2.2样品测定按“1.2.6”方法操作，计算得出3批样品中加米霉素含量分别为99.8%、99.7%和99.6%。
3讨论
3.1色谱条件的选择加米霉素结构与阿奇霉素、泰拉霉素类似，均属于十五元大环内酯类抗生素，因此在其含量测定方法的建立过程中，参考并比较了《兽药质量标准汇编（2006—2011年）》[7]泰拉霉素含量测定色谱条件（KH2PO4-甲醇-乙腈系统）及《欧洲药典》8.0[8]和《中国药典》2010年版[9]阿奇霉素含量测定色谱条件（K2HPO4-乙腈系统），最终以《中国药典》2010年版[9]阿奇霉素含量测定色谱条件为基础，以加米霉素峰的保留时间和分离度为指标，通过对K2HPO4溶液的pH及其与乙腈的比例进行优化，确定了加米霉素的含量测定条件。
3.2系统适用性考察方法的确定加米霉素为红霉素A肟（E型）经异构化反应，再经重排、还原、丙基化反应制备生成[10]。由于红霉素A肟（E型）在相同反应条件下经重排、还原、丙基化可生成6-N-丙基-N去甲基阿奇霉素，其结构与加米霉素的差别仅在于十五元环上N位置的不同，2种产物结构相似，易于混淆。高效液相色谱法可以通过保留时间的不同对两者进行鉴别，但对色谱条件要求较高，否则两者不能良好分离导致色谱峰重叠，因此在系统适用性考察中规定6-N-丙基-N-去甲基阿奇霉素和加米霉素的分离度应符合要求，以求可以有效鉴别并测定加米霉素含量。
3.3耐用性试验分别考察柱温±5 ℃、流速±0.2 mL/min、流动相比例±2%、磷酸盐缓冲液pH±0.2及色谱柱型号的变化对含量测定的影响，以系统适用性及加米霉素含量为考察指标，考察色谱条件的耐用性。结果表明，柱温、流速、流动相比例、流动相pH发生微小变化时，系统适用性均符合要求，对含量测定结果的影响较小;对色谱柱的型号进行了考察，分别使用Waters XBridge C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）和Waters XTerra C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）进行系统适用性考察，使用Waters XTerra C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）时加米霉素峰与6-N-丙基-N-去甲基阿奇霉素峰完全重叠，而使用Waters XBridge C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）时，系统适用性考察分离度大于1.5，因此方法规定采用Waters XBridge C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）。
4结论
该研究建立了高效液相色谱法测定加米霉素的含量，该方法可对加米霉素及其异构体6-N-丙基-N-去甲基阿奇霉素进行有效的鉴别，方法学考察表明该方法专属性、精密度、重复性良好，可准确测定加米霉素的含量，为其质量控制了良好的方法。
47卷3期张 聪等加米霉素含量测定方法的建立
参考文献
[1] 杨新艳，侯林，周德刚.加米霉素的研究进展[J].安徽农业科学，2016，44（31）：150-152，168.
[2] 康彦，王艳艳，邓菲.加米霉素注射液对奶牛安全性的试验研究[J].中国奶牛，2018（7）：55-58.
[3] 马晓玲.加米霉素注射液对犊牛安全性评价及Ⅱ期临床试验[D].石河子：石河子大学，2018.
[4] 于丽佳.加米霉素的合成与工艺路线研究[D].北京：中国农业科学院，2012.
[5] 江志尧.加米霉素及中间体的合成与抑菌活性研究[D].重庆：重庆大学，2010.
[6] 邓菲，孙进，王红霄.加米霉素注射液治疗牛呼吸系统疾病（BRD）的田间试验[J].中国兽医杂志，2018，54（1）：105-108.
[7] 农业部兽药评审中心.兽药质量标准汇编（2006-2011）[M].北京：中国农业出版社，2013：21-23.
[8] 欧洲药典委员会.欧洲药典[S].8.0版.欧洲药品质量管理局，2013：1610-1612.
[9] 国家药典委员会.中华人民共和国药典（2010年版二部.）[S].北京：中国医药科技出版社，2010：395.
[10] Z·门德斯，A·C·S·汉黎奎斯，W·赫吉.合成大环内酯化合物的方法：CN102239174A[P].2011-11-09.
关键词加米霉素;含量测定;HPLC法
中图分类号S859.79文献标识码A
文章编号0517-6611（2019）03-0199-03
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.03.062
加米霉素是法国梅里亚公司开发研制的新一代半合成十五元氮杂环大环内酯类抗菌药物，其注射液分别于2007、2010和2011年被欧洲药品局（EMA）、加拿大保健产品与食品管理局（HPFB）和美国食品与药品管理局（FDA）批准上市[1]，在中国，加米霉素注射液于2017年通过农业农村部进口兽药注册在国内上市销售，用于治疗和预防由溶血性曼氏杆菌、多杀性巴氏杆菌、睡眠嗜组织菌等主要病原菌引起的牛呼吸系统疾病[2-3]。
國内目前已有多家单位在开展加米霉素的仿制研究[4-6]，由于加米霉素的质量标准并未收载于国内外兽药典或各类质量标准汇编，因此在加米霉素及其注射液的仿制过程中，需要建立其质量控制方法。笔者建立了高效液相色谱法测定加米霉素的含量，为其质量控制提供依据。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1研究对象。加米霉素原料，批号20140901、20140902、20140903，由洛阳惠中兽药有限公司生产。加米霉素对照品，含量98.8%，批号HZD140801;6-N-丙基-N-去甲基阿奇霉素对照品，含量95.0%，批号20170724，均由洛阳惠中兽药有限公司制备。
1.1.2主要仪器。高效液相色谱系统（Waters e2695型HPLC;2489型紫外检测器;Empower 2色谱工作站软件），美国Waters公司;XBridge C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），美国Waters公司;AB265-S电子分析天平，梅特勒托利多公司;Seven easy型酸度计，梅特勒托利多公司。
1.1.3主要试剂。磷酸氢二钾、磷酸为分析纯;乙腈为色谱纯;水为超纯水。
1.2方法
1.2.1系统适用性溶液的制备。称取加米霉素与6-N-丙基-N-去甲基阿奇霉素对照品适量，加流动相溶解并稀释制成每1 mL中约含加米霉素1 mg与6-N-丙基-N-去甲基阿奇霉素0.5 mg的混合溶液，即得。
1.2.2对照品溶液的制备。称取加米霉素对照适量，精密称定，加流动相溶解并稀释制成每1 mL中约含加米霉素1 mg的溶液，即得。
1.2.3供试品溶液的制备。称取供试品适量，精密称定，加流动相溶解并稀释制成每1 mL中约含加米霉素1 mg的溶液，即得。
1.2.4色谱条件。色谱柱为Waters XBridge C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流动相为磷酸盐缓冲液（取0.05 mol/L磷酸氢二钾溶液，用稀磷酸调节pH至8.0）-乙腈（30∶70）;流速为1.0 mL/min;检测波长为205 nm;柱温为30 ℃。
1.2.5方法学考察。
1.2.5.1系统适用性试验。分别精密吸取空白溶剂、系统适用性溶液、对照品溶液和供试品溶液20 μL，在“1.2.4”色谱条件下，注入高效液相色谱仪进行测定，记录色谱图，考察系统适用性。
1.2.5.2线性关系考察。精密称取加米霉素对照品，加流动相溶解制成浓度为4.984 0 mg/mL的溶液，作为对照品储备液。精密吸取储备液1.0、1.5、2.0、3.0、4.0 mL，分别置10 mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为不同浓度的对照品溶液。精密吸取上述系列浓度的对照品溶液各20 μL，从低浓度到高浓度依次进样分析，记录色谱图，以浓度（mg/mL）为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线，计算线性回归方程。
1.2.5.3进样精密度试验。取按“1.2.2”方法制备的对照品溶液，精密吸取20 μL，在“1.2.4”色谱条件下，注入高效液相色谱仪进行测定，连续进样6次，计算峰面积的RSD。
1.2.5.4重复性试验。取同一批号的供试品（批号20140901），按“1.2.3”方法平行制备6份供试品溶液，精密吸取20 μL，在“1.2.4”色谱条件下，注入高效液相色谱仪进行测定，计算平均含量和RSD。
1.2.5.5中间精密度试验。取同一批号的供试品（批号20140901），按“1.2.3”方法制备6份供试品溶液，在不同日期由不同人员在不同的高效液相色谱仪上，按“1.2.4”色谱条件进行测定，计算平均含量和RSD。
1.2.5.6稳定性试验。取同一份供试品溶液，按“1.2.4”色谱条件分别于0、2、4、6、8、12 h进样，测定峰面积，计算RSD。
1.2.5.7回收率试验。取同一批号的供试品（批号20140901）约10 mg，精密称定，置20 mL容量瓶中，分别按照测定浓度的80%、100%、120% 3个水平添加加米霉素对照品，按“1.2.3”方法制备供试品溶液，每个浓度水平平行制备3份，按“1.2.4”色谱条件测定，计算平均回收率和RSD。 1.2.6样品测定。取3批供试品，按“1.2.3”方法制备供试品溶液并测定，计算加米霉素的含量。
2结果与分析
2.1方法学考察
2.1.1系统适用性试验。图1表明，在“1.2.4”色谱条件下，加米霉素与6-N-丙基-N-去甲基阿奇霉素的分离度符合要求，空白溶剂在加米霉素对照品相应的保留时间处无干扰。
2.1.2线性关系考察。按“1.2.5.2”方法操作，以浓度（mg/mL）为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线如图2所示，计算得出线性回归方程为y=2.64×106x+26 344（r=0.999 9），表明加米霉素浓度在0.498 4～1.993 6 mg/mL与峰面积呈良好的线性关系。
2.1.3进样精密度试验。按“1.2.5.3”方法操作，计算得出峰面积的RSD为0.3%，表明仪器精密度良好。
2.1.4重复性试验。按“1.2.5.4”方法操作，计算得出平均含量为99.8%，RSD为0.1%，表明该方法重复性良好。
2.1.5中间精密度试验。按“1.2.5.5”方法操作，计算得出平均含量为99.8%，RSD为0.1%，表明该方法中间精密度良好。
2.1.6稳定性试验。按“1.2.5.6”方法操作，计算峰面积的RSD为1.2%，表明供试品溶液在12 h内稳定。
2.1.7回收率试验。由表1可见，平均回收率为99.2%，RSD为0.6%，表明該方法准确度良好。
2.2样品测定按“1.2.6”方法操作，计算得出3批样品中加米霉素含量分别为99.8%、99.7%和99.6%。
3讨论
3.1色谱条件的选择加米霉素结构与阿奇霉素、泰拉霉素类似，均属于十五元大环内酯类抗生素，因此在其含量测定方法的建立过程中，参考并比较了《兽药质量标准汇编（2006—2011年）》[7]泰拉霉素含量测定色谱条件（KH2PO4-甲醇-乙腈系统）及《欧洲药典》8.0[8]和《中国药典》2010年版[9]阿奇霉素含量测定色谱条件（K2HPO4-乙腈系统），最终以《中国药典》2010年版[9]阿奇霉素含量测定色谱条件为基础，以加米霉素峰的保留时间和分离度为指标，通过对K2HPO4溶液的pH及其与乙腈的比例进行优化，确定了加米霉素的含量测定条件。
3.2系统适用性考察方法的确定加米霉素为红霉素A肟（E型）经异构化反应，再经重排、还原、丙基化反应制备生成[10]。由于红霉素A肟（E型）在相同反应条件下经重排、还原、丙基化可生成6-N-丙基-N去甲基阿奇霉素，其结构与加米霉素的差别仅在于十五元环上N位置的不同，2种产物结构相似，易于混淆。高效液相色谱法可以通过保留时间的不同对两者进行鉴别，但对色谱条件要求较高，否则两者不能良好分离导致色谱峰重叠，因此在系统适用性考察中规定6-N-丙基-N-去甲基阿奇霉素和加米霉素的分离度应符合要求，以求可以有效鉴别并测定加米霉素含量。
3.3耐用性试验分别考察柱温±5 ℃、流速±0.2 mL/min、流动相比例±2%、磷酸盐缓冲液pH±0.2及色谱柱型号的变化对含量测定的影响，以系统适用性及加米霉素含量为考察指标，考察色谱条件的耐用性。结果表明，柱温、流速、流动相比例、流动相pH发生微小变化时，系统适用性均符合要求，对含量测定结果的影响较小;对色谱柱的型号进行了考察，分别使用Waters XBridge C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）和Waters XTerra C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）进行系统适用性考察，使用Waters XTerra C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）时加米霉素峰与6-N-丙基-N-去甲基阿奇霉素峰完全重叠，而使用Waters XBridge C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）时，系统适用性考察分离度大于1.5，因此方法规定采用Waters XBridge C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）。
4结论
该研究建立了高效液相色谱法测定加米霉素的含量，该方法可对加米霉素及其异构体6-N-丙基-N-去甲基阿奇霉素进行有效的鉴别，方法学考察表明该方法专属性、精密度、重复性良好，可准确测定加米霉素的含量，为其质量控制了良好的方法。
47卷3期张 聪等加米霉素含量测定方法的建立
参考文献
[1] 杨新艳，侯林，周德刚.加米霉素的研究进展[J].安徽农业科学，2016，44（31）：150-152，168.
[2] 康彦，王艳艳，邓菲.加米霉素注射液对奶牛安全性的试验研究[J].中国奶牛，2018（7）：55-58.
[3] 马晓玲.加米霉素注射液对犊牛安全性评价及Ⅱ期临床试验[D].石河子：石河子大学，2018.
[4] 于丽佳.加米霉素的合成与工艺路线研究[D].北京：中国农业科学院，2012.
[5] 江志尧.加米霉素及中间体的合成与抑菌活性研究[D].重庆：重庆大学，2010.
[6] 邓菲，孙进，王红霄.加米霉素注射液治疗牛呼吸系统疾病（BRD）的田间试验[J].中国兽医杂志，2018，54（1）：105-108.
[7] 农业部兽药评审中心.兽药质量标准汇编（2006-2011）[M].北京：中国农业出版社，2013：21-23.
[8] 欧洲药典委员会.欧洲药典[S].8.0版.欧洲药品质量管理局，2013：1610-1612.
[9] 国家药典委员会.中华人民共和国药典（2010年版二部.）[S].北京：中国医药科技出版社，2010：395.
[10] Z·门德斯，A·C·S·汉黎奎斯，W·赫吉.合成大环内酯化合物的方法：CN102239174A[P].2011-11-09.