【摘 要】
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目的 构建针对人类Polo-like kinase 1(Plk1)基因的短发卡RNA (shRNA)真核表达载体,并进行腺病毒包被.方法 设计并合成含有小发夹结构的Plk1 shRNA对应模板序列,退火并与pYr-
【机 构】
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210029,南京医科大学第二临床医学院普外科
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目的 构建针对人类Polo-like kinase 1(Plk1)基因的短发卡RNA (shRNA)真核表达载体,并进行腺病毒包被.方法 设计并合成含有小发夹结构的Plk1 shRNA对应模板序列,退火并与pYr-1.1载体重组质粒;通过LR体外同源重组将pYr-1.1-Plk1-shRNA表达框构建至pAd-DEST腺病毒表达载体上;包装重组腺病毒;感染人类胰腺癌细胞BxPC-3验证干扰效率.实验分3组:对照组(Control)、空载组[rAd-增强绿色荧光蛋白(rAd-EGFP)]、实验组(rAd-shPlk1),实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)和Western blot检测Plk1基因的表达,流式细胞术检测细胞周期的变化及对细胞凋亡的影响.结果 腺病毒感染BxPC-3细胞后,RT-qPCR检测Plk1 mRNA表达量:对照组1.047±0.315、空载组1.121±0.199、实验组0.119±0.050;Western blot检测Plk1蛋白表达量:对照组0.760±0.088、空载组0.743±0.101、实验组0.050±0.043,实验组较对照组及空载组Plk1mRNA和蛋白水平均明显降低(P＜0.01).流式细胞术检测G2期细胞比例:对照组6.077±0.056、空载组6.533±1.644、实验组33.427±7.774,实验组G2期细胞数比例显著高于空载组和对照组(P＜0.01).感染24h后实验组的细胞凋亡率明显高于空载组和对照组(P＜0.01).结论 成功构建包被有Plk1 shRNA的腺病毒表达载体,且重组腺病毒载体可以抑制Plk1基因的表达,引起细胞周期G2/M期停滞和促进细胞凋亡.
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