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［摘 要］ 目的 调查中国人群肥厚型心肌病（HCM）患者心肌肌球 蛋白结合蛋白C（MyBPC3）基因突变的发生情况并对基因型与表现型之间的关系进行分析。 方法 对92例肥厚型心肌病患者及100名正常对照的聚合酶链反应(PCR)扩 增产物进行单链构象多态性分析（SSCP）分析，于MyBPC3基因第14-15、17、25、27、33号 外显子范围内寻找突变位点，并了解基因型明确的HCM患者的临床特点。结果 在一例HCM患者的MyBPC3基因的第14-15号外显子上发现了一个新的突变位点T445S。由 于在100名正常对照中未见该错义突变，故我们认为此突变位点为该患者的致病基因位点。结论 心肌肌球蛋白结合蛋白C的C3结构域对于其连接及调节功能起着至关 重要的作用，该区域的基因突变可导致肥厚型心肌病的发生。
［关键词］ 肥厚型心肌病；心肌肌球蛋白结合蛋白C；基因；突变
中图分类号：R542.2 文献标识码：A 文章编号：1009_816X(2008)05_030 1_03
肥厚型心肌病(Hypertrophic cardiomyopathy，HCM)是一种以不明原因的心肌肥厚、心肌纤 维排列紊乱为特征的心肌病。它的发病率为0.04％～0.4％，Sadoul的研究认 为该病的患病基因携带率达到了1/500，是危害人类健康的主要疾病之一［1］，是青 少年患者发生心脏性猝死的最常见的原因。迄今已确定了至少13个基因 上近450种突变与HCM的发病有关［2］，主要位于肌小节收缩蛋白编码基因上。三种 常见的突变基因是β_肌球蛋白重链、心肌肌球结合蛋白C（Cardiac myosin binding prote in_C，MyBPC3）和肌钙蛋白T。MyBPC3基因编码MyBPC3，目前发现15%的肥厚型心肌病由MyBP C3基因突变引起［3］，该基因位于染色体11p11.2，含35个外显子，编码1173个氨 基酸的肽链。目前已发现的60多个该基因的突变中，多为缺失、插入、重复突变，产生羧基 末端截短蛋白， 7个是错义突变，产生突变蛋白，造成肌小节结构和功能损害。本研究将对92例肥厚型心肌 病患者的MyBPC3基因的第14-15、17、25、27、33号外显子的分析，筛查有无相关的突变。
1 对象与方法
1.1 对象：经家族调查无血缘关系的肥厚型心肌病患者92例，均为2002年8月至2005年8月 山东医科大学齐鲁医院门诊及住院患者，其中包括肥厚型心肌病先证者50例，散发病例42例 ，年龄12～70岁，平均年龄（41±15.58）岁。HCM的诊断标准为：室间隔或左室心室壁厚 度≥13mm，除外高血 压等引起继发性心肌肥厚的因素及其他心血管疾病。正常对照组100例，其中男68例、女 32例，平均13～72岁，平均年龄（37.3±13.3）岁，经详细询问病史、系统查体及经心电 图、超声心动图等辅助检查排除了器质性心脏疾病者。
1.2 方法：
1.2.1 在知情同意后采HCM患者及正常人的外周静脉血3ml，用酚：氯仿法提取基因组DNA 。
1.2.2 对这些DNA行聚合酶链反应(PCR)扩增基因组DNA：从基因库中查得MyBPC3基因第1 4-15、17、25、27、33号外显子及其邻近内含子的序列，由邻近的内含子序列设计对外显子 扩增的引物。其中第14-15号外显子序列如下：上游5'_CTC TCC TTT TGT CTC GGG GCT_3 ，下游5'_GGG TGA GCA TGA GGG TTG GC_3，扩增产物片段长度为384bp。PCR试剂盒由 大连宝生物工程公司提供，14-15号外显子反应条件的设置为：94℃初变性5min，94℃变 性1min，62℃退火1min，72℃延伸2min，重复35个循环，最后72℃充分延伸10min。PCR扩增 产物行2%琼脂糖凝胶电泳，用标准参照物标记检测是否产生了相应长度的特异性扩增片段。
1.2.3 单链构象多态性分析：PCR产物3μl加变性上样液［95％甲酰胺，0.03％二甲苯 青，0.05％溴酚兰，20mmol/L EDTA（PH8.0）］15μl，98℃变性10min立即冰浴骤冷，然后取15ul的样品，取微量加样器上样。用8%聚丙酰胺凝胶在110V恒压下电泳18～20h。电 泳结束后将胶剥出，用固 定液(乙醇300ml，冰乙酸100ml，双蒸水600ml)固定1～2h至二甲苯青条带刚好消失；回收 固定液双蒸水 漂洗3遍后用银染液［0.5g硝酸银溶于500ml双蒸水中(现配现用)］染色30min,双蒸水快速 漂洗3遍后用显影液［15g无水碳酸钠，溶于500ml双蒸水中(预冷)］显影10～15min至所有条 形显现满意为止，再用回收的固定液终止显影5min,用双蒸水漂洗2遍。通过与同一块胶上其 他泳道的带型相比较来发现有无迁移位置异常的条带。
1.2.4 测序分析：将经过SSCP分析发现的可疑PCR产物送大连宝生物工程公司再次纯 化后用双脱氧末端终止法进行测序，将测序结果与基因库中的序列相对照，检测是否具有突 变位点。
1.2.5 对检测到突变的患者的直系亲属进行系统查体及心电图、超声心动图等检查以判 断有 无肥厚型心肌病，同时对他们的MyBPC3基因的第14-15号外显子直接测序分析有无相同的突 变。
2 结果
2.1 我们对92例肥厚型心肌病患者的MyBPC3基因的第14-15、17、25、27、33号外显子进 行PC R扩增，在进行SSCP分析时发现1例患者的第14-15号外显子扩增产物在行SSCP分析时，除了 正常位置的三条单链带（图1）外，还有一条异常的单链条带，同时少了一条正常的带。将 其PCR产物送检测序，发现在445位密码子位置发生了ACG→TCG转换，使其编码的氨基酸由苏 氨酸（Thr）转变为丝氨酸（Ser）即T445S，如图2所示(封三)。对照组的100位研究对象在 该位点均未见异常，从而认为该位点为基因突变位点而非多态位点。
2.2 被检测到发生突变的患者为55岁女性，于一年前来我院查体，心电图较前无明显异常 ，超声心动图示室间隔中部异常增厚至17mm，无SAM现象及流出道梗阻的表现。对其直系亲 属逐个检查未再发现其他的HCM患者。同时，对其直系亲属的MyBPC3基因的第14-15号外显子 直接测序分析，在445位密码子位置也未发现突变位点。故认为该患者为一散发型病例。
3 讨论
心肌肌球蛋白结合蛋白C（MyBPC3）是粗肌丝的主要成分之一，是合成具有正常功能的肌小 节的必要成分。已知MyBPC3不仅参与正常心肌肌小节和肌丝的组装，稳定肌小节的结构，而 且通过磷酸化作用等形式调节横桥循环参与肌肉的收缩和舒张。从结构和功能上来解释该基 因突变引起肥厚型心肌病是合理的。
MyBPC3是细胞内免疫球蛋白超家族成员，包含11个结构域，目前具体的结构和功能尚未完全 了解。现有的研究发现MYBPC3在肌小节的A带与肌球蛋白分子连接，与肌钙蛋白的结合可进 一步稳定肌小节的结构［4，5］。有研究推测通过它的N端与肌球蛋白亚片断-2部分 的结合 ，降低肌动蛋白ATP酶的活性，从而参与调解肌肉的收缩；其磷酸化作用则消除这一过程导 致肌桥的舒张。MyBPC3变异导致HCM的机制可能是点突变导致的磷酸化过程的终止或者不完 全［6］：亦可能通过刺激肾上腺素的分泌来调节心脏的收缩性。已发现的60种突变 中，多 数可引起蛋白质羰基端肌球蛋结台区片段缺失。这些突变多发生于拼接区，缺失、插入及无 义突变导致截断蛋白的生成是引起HCM的分子基础。但是研究中也发现具有错义突变的HCM家 族，这些突变可能通过抑制相关结构域的功能来影响肌小节的结构与功能，或者通过结构域 结构的改变，发挥抑制被蛋白磷酸化的作用［7，8］导致发病。本文在心肌肌球蛋白 结合 蛋白C的第14-15外显子上发现了一个新的突变位点T445S，所编码的蛋白位于肌球蛋白结合 蛋白C的C3结构域，发生于此区的错义突变，就可能通过以上机制影响肌小节的结构和收缩 及舒张功能致HCM发生。这一发现反过来提示C3结构域是参与肌小节的结构并调节其收缩及 舒张功能的重要部分。其具体的作用有待于进一步的研究证实。
另外，研究发现HCM患者的基因突变类型与显性表达有一定的对应关系，如MyBPC3基因突变 所致的HCM与β_肌球蛋白重链基因突变所致的HCM相比，大都发病年龄较晚，心肌肥厚进行 性加重，猝死发生率相对较低，多数为中老年发病。本文发现的突变患者无明显的症状体 征，无SAM现象及流出道梗阻的表现，家族中无心源性猝死发作史，属于低危病人，与先前 的研究相吻合。
总之，HCM是一种原发性肌小节疾病。心肌肌球蛋白结合蛋白C的C3结构域对于其连接及调节功能起着至关重要的作用，该区域的基因突变可导致肥厚型心肌病的发生。本 文在一例HCM患者的MyBPC3基因的第14-15号外显子上发现了一个新的突变位点T445S并认为 此突变位点为该患者的致病基因位点。通过基因分析，使HCM症状前诊断及早期预防成为可 能。
参考文献
［1］Kubo T, Gimeno JR, Bahl JR, Bahl A, et al. Prevalence, clinical sig nificance, and genetic basis of hypertrophic cardiomyopathy with restrictive phe notype［J］. J Am Coll Cardiol, 2007, 49(25):2427-2429.
［2］Alcalai R, Seidman JG, Seidman CE. Genetic Basis of Hypertrophic Cardiomyop athy: From Bench to the Clinics［J］. J Cardiovasc Electrophysiol, 2008,19(1):10 4-110.
［3］Lucie Carrier, Gisele Bone, Ellen Bahrend, et al. organization and sequence of human cardiac myosin binding protein C gene (MYBPC3) and ldentification of M utations Predicted to Produce Truncated Proteins in Familial Hypertrophic Cardio myopathy［J］. Circ Res, 1997,80(3):427-434.
［4］Gilbert R, Kelly MG, Mikawa T, et al. The carboxyl terminus of myosin bindi ng protein C(MyBP_C, C_protein) specifies incorporation into the A_band of stria ted muscle［J］. J Cell Sci, 1996,109(1):101-111.
［5］Kulikovskaya l, McClellan G.B, Levine R, et al. Multiple Forms of Cardiac M yosin_binding Protein C Exist and Can Regulate Thick Filament Stability［J］. J,
Gen, Physiol, 2007,129:419-428.
［6］Flashman E, Redwood C, Moolman_Smook J. Cardiac myosin binding protein C: i tsrole in physiology and disease［J］. Circ Res, 2004,94(10):1279-1289.
［7］Carlo Guardiani, Fabio Cecconi, Roberto Livi. Stability and Kinetic Propert ies of C5_Domain from Myosin Binding Protein C and its Mutants［J］. Biophysical Journal, 2008,94:1403-1411.
［8］Oakley CE, Hambly BD, Curmi PM, et al. Myosin binding protein C: structural abnormalities in familial hypertrophic cardiomyopathy［J］. Cell Res, 2004,14(2 ):95-110.
［关键词］ 肥厚型心肌病；心肌肌球蛋白结合蛋白C；基因；突变
中图分类号：R542.2 文献标识码：A 文章编号：1009_816X(2008)05_030 1_03
肥厚型心肌病(Hypertrophic cardiomyopathy，HCM)是一种以不明原因的心肌肥厚、心肌纤 维排列紊乱为特征的心肌病。它的发病率为0.04％～0.4％，Sadoul的研究认 为该病的患病基因携带率达到了1/500，是危害人类健康的主要疾病之一［1］，是青 少年患者发生心脏性猝死的最常见的原因。迄今已确定了至少13个基因 上近450种突变与HCM的发病有关［2］，主要位于肌小节收缩蛋白编码基因上。三种 常见的突变基因是β_肌球蛋白重链、心肌肌球结合蛋白C（Cardiac myosin binding prote in_C，MyBPC3）和肌钙蛋白T。MyBPC3基因编码MyBPC3，目前发现15%的肥厚型心肌病由MyBP C3基因突变引起［3］，该基因位于染色体11p11.2，含35个外显子，编码1173个氨 基酸的肽链。目前已发现的60多个该基因的突变中，多为缺失、插入、重复突变，产生羧基 末端截短蛋白， 7个是错义突变，产生突变蛋白，造成肌小节结构和功能损害。本研究将对92例肥厚型心肌 病患者的MyBPC3基因的第14-15、17、25、27、33号外显子的分析，筛查有无相关的突变。
1 对象与方法
1.1 对象：经家族调查无血缘关系的肥厚型心肌病患者92例，均为2002年8月至2005年8月 山东医科大学齐鲁医院门诊及住院患者，其中包括肥厚型心肌病先证者50例，散发病例42例 ，年龄12～70岁，平均年龄（41±15.58）岁。HCM的诊断标准为：室间隔或左室心室壁厚 度≥13mm，除外高血 压等引起继发性心肌肥厚的因素及其他心血管疾病。正常对照组100例，其中男68例、女 32例，平均13～72岁，平均年龄（37.3±13.3）岁，经详细询问病史、系统查体及经心电 图、超声心动图等辅助检查排除了器质性心脏疾病者。
1.2 方法：
1.2.1 在知情同意后采HCM患者及正常人的外周静脉血3ml，用酚：氯仿法提取基因组DNA 。
1.2.2 对这些DNA行聚合酶链反应(PCR)扩增基因组DNA：从基因库中查得MyBPC3基因第1 4-15、17、25、27、33号外显子及其邻近内含子的序列，由邻近的内含子序列设计对外显子 扩增的引物。其中第14-15号外显子序列如下：上游5'_CTC TCC TTT TGT CTC GGG GCT_3 ，下游5'_GGG TGA GCA TGA GGG TTG GC_3，扩增产物片段长度为384bp。PCR试剂盒由 大连宝生物工程公司提供，14-15号外显子反应条件的设置为：94℃初变性5min，94℃变 性1min，62℃退火1min，72℃延伸2min，重复35个循环，最后72℃充分延伸10min。PCR扩增 产物行2%琼脂糖凝胶电泳，用标准参照物标记检测是否产生了相应长度的特异性扩增片段。
1.2.3 单链构象多态性分析：PCR产物3μl加变性上样液［95％甲酰胺，0.03％二甲苯 青，0.05％溴酚兰，20mmol/L EDTA（PH8.0）］15μl，98℃变性10min立即冰浴骤冷，然后取15ul的样品，取微量加样器上样。用8%聚丙酰胺凝胶在110V恒压下电泳18～20h。电 泳结束后将胶剥出，用固 定液(乙醇300ml，冰乙酸100ml，双蒸水600ml)固定1～2h至二甲苯青条带刚好消失；回收 固定液双蒸水 漂洗3遍后用银染液［0.5g硝酸银溶于500ml双蒸水中(现配现用)］染色30min,双蒸水快速 漂洗3遍后用显影液［15g无水碳酸钠，溶于500ml双蒸水中(预冷)］显影10～15min至所有条 形显现满意为止，再用回收的固定液终止显影5min,用双蒸水漂洗2遍。通过与同一块胶上其 他泳道的带型相比较来发现有无迁移位置异常的条带。
1.2.4 测序分析：将经过SSCP分析发现的可疑PCR产物送大连宝生物工程公司再次纯 化后用双脱氧末端终止法进行测序，将测序结果与基因库中的序列相对照，检测是否具有突 变位点。
1.2.5 对检测到突变的患者的直系亲属进行系统查体及心电图、超声心动图等检查以判 断有 无肥厚型心肌病，同时对他们的MyBPC3基因的第14-15号外显子直接测序分析有无相同的突 变。
2 结果
2.1 我们对92例肥厚型心肌病患者的MyBPC3基因的第14-15、17、25、27、33号外显子进 行PC R扩增，在进行SSCP分析时发现1例患者的第14-15号外显子扩增产物在行SSCP分析时，除了 正常位置的三条单链带（图1）外，还有一条异常的单链条带，同时少了一条正常的带。将 其PCR产物送检测序，发现在445位密码子位置发生了ACG→TCG转换，使其编码的氨基酸由苏 氨酸（Thr）转变为丝氨酸（Ser）即T445S，如图2所示(封三)。对照组的100位研究对象在 该位点均未见异常，从而认为该位点为基因突变位点而非多态位点。
2.2 被检测到发生突变的患者为55岁女性，于一年前来我院查体，心电图较前无明显异常 ，超声心动图示室间隔中部异常增厚至17mm，无SAM现象及流出道梗阻的表现。对其直系亲 属逐个检查未再发现其他的HCM患者。同时，对其直系亲属的MyBPC3基因的第14-15号外显子 直接测序分析，在445位密码子位置也未发现突变位点。故认为该患者为一散发型病例。
3 讨论
心肌肌球蛋白结合蛋白C（MyBPC3）是粗肌丝的主要成分之一，是合成具有正常功能的肌小 节的必要成分。已知MyBPC3不仅参与正常心肌肌小节和肌丝的组装，稳定肌小节的结构，而 且通过磷酸化作用等形式调节横桥循环参与肌肉的收缩和舒张。从结构和功能上来解释该基 因突变引起肥厚型心肌病是合理的。
MyBPC3是细胞内免疫球蛋白超家族成员，包含11个结构域，目前具体的结构和功能尚未完全 了解。现有的研究发现MYBPC3在肌小节的A带与肌球蛋白分子连接，与肌钙蛋白的结合可进 一步稳定肌小节的结构［4，5］。有研究推测通过它的N端与肌球蛋白亚片断-2部分 的结合 ，降低肌动蛋白ATP酶的活性，从而参与调解肌肉的收缩；其磷酸化作用则消除这一过程导 致肌桥的舒张。MyBPC3变异导致HCM的机制可能是点突变导致的磷酸化过程的终止或者不完 全［6］：亦可能通过刺激肾上腺素的分泌来调节心脏的收缩性。已发现的60种突变 中，多 数可引起蛋白质羰基端肌球蛋结台区片段缺失。这些突变多发生于拼接区，缺失、插入及无 义突变导致截断蛋白的生成是引起HCM的分子基础。但是研究中也发现具有错义突变的HCM家 族，这些突变可能通过抑制相关结构域的功能来影响肌小节的结构与功能，或者通过结构域 结构的改变，发挥抑制被蛋白磷酸化的作用［7，8］导致发病。本文在心肌肌球蛋白 结合 蛋白C的第14-15外显子上发现了一个新的突变位点T445S，所编码的蛋白位于肌球蛋白结合 蛋白C的C3结构域，发生于此区的错义突变，就可能通过以上机制影响肌小节的结构和收缩 及舒张功能致HCM发生。这一发现反过来提示C3结构域是参与肌小节的结构并调节其收缩及 舒张功能的重要部分。其具体的作用有待于进一步的研究证实。
另外，研究发现HCM患者的基因突变类型与显性表达有一定的对应关系，如MyBPC3基因突变 所致的HCM与β_肌球蛋白重链基因突变所致的HCM相比，大都发病年龄较晚，心肌肥厚进行 性加重，猝死发生率相对较低，多数为中老年发病。本文发现的突变患者无明显的症状体 征，无SAM现象及流出道梗阻的表现，家族中无心源性猝死发作史，属于低危病人，与先前 的研究相吻合。
总之，HCM是一种原发性肌小节疾病。心肌肌球蛋白结合蛋白C的C3结构域对于其连接及调节功能起着至关重要的作用，该区域的基因突变可导致肥厚型心肌病的发生。本 文在一例HCM患者的MyBPC3基因的第14-15号外显子上发现了一个新的突变位点T445S并认为 此突变位点为该患者的致病基因位点。通过基因分析，使HCM症状前诊断及早期预防成为可 能。
参考文献
［1］Kubo T, Gimeno JR, Bahl JR, Bahl A, et al. Prevalence, clinical sig nificance, and genetic basis of hypertrophic cardiomyopathy with restrictive phe notype［J］. J Am Coll Cardiol, 2007, 49(25):2427-2429.
［2］Alcalai R, Seidman JG, Seidman CE. Genetic Basis of Hypertrophic Cardiomyop athy: From Bench to the Clinics［J］. J Cardiovasc Electrophysiol, 2008,19(1):10 4-110.
［3］Lucie Carrier, Gisele Bone, Ellen Bahrend, et al. organization and sequence of human cardiac myosin binding protein C gene (MYBPC3) and ldentification of M utations Predicted to Produce Truncated Proteins in Familial Hypertrophic Cardio myopathy［J］. Circ Res, 1997,80(3):427-434.
［4］Gilbert R, Kelly MG, Mikawa T, et al. The carboxyl terminus of myosin bindi ng protein C(MyBP_C, C_protein) specifies incorporation into the A_band of stria ted muscle［J］. J Cell Sci, 1996,109(1):101-111.
［5］Kulikovskaya l, McClellan G.B, Levine R, et al. Multiple Forms of Cardiac M yosin_binding Protein C Exist and Can Regulate Thick Filament Stability［J］. J,
Gen, Physiol, 2007,129:419-428.
［6］Flashman E, Redwood C, Moolman_Smook J. Cardiac myosin binding protein C: i tsrole in physiology and disease［J］. Circ Res, 2004,94(10):1279-1289.
［7］Carlo Guardiani, Fabio Cecconi, Roberto Livi. Stability and Kinetic Propert ies of C5_Domain from Myosin Binding Protein C and its Mutants［J］. Biophysical Journal, 2008,94:1403-1411.
［8］Oakley CE, Hambly BD, Curmi PM, et al. Myosin binding protein C: structural abnormalities in familial hypertrophic cardiomyopathy［J］. Cell Res, 2004,14(2 ):95-110.