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摘要阐述了RNA干扰(RNAi)现象的发现、作用机制,分析了RANi技术在农业生产中的主要应用,以为RANi的进一步研究应用提供依据。
关键词RNAi;作用机制;农业生产
中图分类号Q522文献标识码A文章编号 1007-5739(2010)06-0039-01
近年来研究表明,一些小的双链RNA(dsRNA)能通过促使mRNA降解,高效特异的抑制细胞内与其同源序列基因的表达,诱使细胞表现特定基因缺失的表型,称为RNA干扰(RNA Interference,RNAi)。不同的有机体,包括植物、果蝇、线虫及一些哺乳动物大多能利用RNA干扰来抵御病毒及其他外来核酸的侵入,提示它可能是生物体的一种进化保守机制。同时,也可能成为基因功能分析和基因治疗的一个革命性工具。
1RNA干扰的发现和命名
1995年,Guo和Kemphues试图利用正义RNA影响秀丽新小杆线虫中的par-1基因的表达,以期观察到基因表达的增强,结果意外的发现正义RNA链和反义RNA链同样地抑制了par-1基因的表达。这与传统上对反义RNA技术的解释正好相反。这是RAN干扰现象的首次发现,但是2人未能作出合理解释[1]。直到1998年,Fire等证实了正义RNA链抑制基因表达,以及过去的反义RNA对基因表达的阻断,都是由于体外转录所得RNA中污染了微量双链RNA而引起。当他们将体外转录得到的单链RNA纯化后注射线虫时发现,基因抑制效应变得十分微弱,而经过纯化的双链RNA却正好相反,能够高效特异性阻断相应基因的表达。该小组将这一现象称为RNA干扰(RNA Interference,RNAi)[2]。
2RNA干扰的机制
对于RNA 干涉的机制,人们先后提出多种模型。Hynes等认为RNA干涉是生物在长期进化过程中形成的一种对病毒侵染的抗性,与基因表达产物的过量与否无关;当病毒或转入的外源基因内部有同源序列,或外源基因与内源基因之间有同源序列时,往往会导致异位配对(ectopic pairing),并转录产生双链的异常RNA(aberrant RNA,aRNA),细胞中一旦产生aRNA,就会激活RdRPs 的活性,RdRPs再以aRNA为模板合成大量21～25 bp的互补RNA(complementary RNA,cRNA)。这些cRNA 与同源mRNA 结合形成部分双链结构dsRNA,被双链特异性RNase 识别并降解。Waterhouse将正义RNA 和反义RNA导入植物后,发现正义RNA与反义RNA共转录比二者单独作用更易引起基因沉默。于是他们认为异位配对并不是导致基因沉默的根本原因,而根本原因在于外源基因插入受体基因组中的方向不同,导致正义RNA和反义RNA的合成。这些转录产物形成dsRNA,dsRNA 在细胞质中被螺旋酶、RdRPs 和类似于RNaseL 的核酸内切酶形成的复合体所识别。螺旋酶使双链解旋,RdRPs 以其中一条链为模板合成cRNA,类似于RNaseL 的核酸内切酶结合于cRNA 的两端,当cRNA与具有同源序列的mRNA结合以后,RNaseL在单链处切开mRNA 分子,从而使mRNA 降解,基因沉默,并由此提出了双链RNA模型[3]。
在该模型中,RNAi发生的基本过程可分为起始阶段和效应阶段。在起始阶段,RNaseⅢ家族的双链特异的核糖核酸酶(在果蝇中命名为Dicer)以ATP依赖的方式将长的dsRNA切割成21~23 nt的小干扰 RNA(small interfering RNA,siRNA)[4-5]。在效应阶段,siRNA参与形成RNA诱导的沉默复合物(RNA-induced silencing complex,RISC)[6]。RISC以ATP依赖的方式催化双链siRNA解旋,然后利用其内部的单链siRNA/miRNA,通过碱基配对识别与之互补的靶 RNA,随后,RISC中的核酸内切酶在距离siRNA 3′端12个碱基的位置切割靶RNA[7]。最后,切割后的靶 RNA在核酸外切酶的作用下被降解,导致目的基因的沉默。
3RNAi技术在农业生产中的应用
随着RNAi技术的日益成熟,其在各个领域的应用也越来越广泛,在农业生产中尤其是育种和作物抗病毒方面也发挥着巨大的作用。
3.1在育种方面的应用研究
雄性不育系及恢复系的培育是产生具有优良性状杂交种的前提,在育种上有重大意义。目前,有很多研究者通过 RNAi技术控制植物花期,研究植物雄性不育及育性恢复。首先,可以培育出受控制的能稳定遗传的不育植株;其次,可减少基因污染,促进植株生长,控制花期,缩短育种周期。Chuang[8]等用RNAi证明了拟南芥中和花发育有关的基因,获了能稳定遗传的雄性不育突变体。其他植物中也有和其同源的基因,可进一步研究其功能,以获得其他植物雄性不育突变体。在育种工作中,远源杂交(或自交)不亲和性使人们难以获得优良的杂交种。为了解决这一问题,人们研究提出许多途径,如选择亲和或不亲和性弱的品种进行种间杂交,增加染色体倍数以促进亲和性较多表现等方法。HT基因是McClure等发现的在分子水平上和花粉自交不亲和性有关的基因,其在烟草花柱中的表达使花柱富含天冬氨酰蛋白。Brien等为阐明HT基因的功能,构建了反义ScHT-A和RNAi ScHT-B系統。在反义系统中ScHT-A mRNA水平有很大降低,没有植物变为自交亲和。在进一步构建的RNAiScHT-B系统中,ScHT-B mRNA特意的干扰,而不会影响到ScHT-A mRNA。结果表明,只有ScHT-B基因和自交不亲和现象有关,并发现30%的ScHT-B基因对维持自交不亲和现象是必须的[9]。除了以上的应用外,RNAi在植物淀粉合成途径、改变植物中淀粉含量、增加植物抗逆性等多方面的应用均有报道 。
3.2RNAi技术在作物抗病毒方面的应用
RNAi序列特异性识别并降解目标RNA,在包括真菌、植物和动物的大量真核生物中都有发现,并被认为是植物的一种抵抗病毒的防御机制。研究者发现,转入病毒基因的植物会对此病毒具有抗性,并且RNA沉默一旦建立,所有和其同源的RNA都会被降解,即植物对同一种病毒的第2次侵染以及与这种病毒部分同源的其他病毒都具有抗性[10]。RNAi技术有助于更加深入的了解植物抵抗病毒入侵的机制,并据此培育出具有优良品质的抗病植株。水稻黄斑病毒 RYMV在非洲广泛流行,自然的预防机制为隐性、多基因性状。将该病毒复制所需的某种酶的基因转入水稻,诱发基因沉默,从而使植物具有RYMV病毒的抗性,这种抗性能稳定遗传3代。进一步研究发现,很多植物RNA病毒也会编码特定的蛋白抑制基因沉默的发生。玉米矮花叶病毒和玉米炭疽线条病毒存在C2/C2一基因,可抑制植物中的RNAi,使C2转录水平升高,花青苷色素沉积加强。有人转入李瘟病毒(Plum pox virus,PPV)NIb序列的烟草在 PPV 编码沉默抑制子(HCPro)情况下,表现出因 RNA沉默引发的对 PPV 的抗性。用具有转基因沉默和病毒抗性的愈伤组织进一步试验证明,能产生沉默抑制子2b和HCPi’o的黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)和烟草脉状病毒(Tobacco vein mottling virus,TVMV)都具有病毒抗性。只有由CMV产生而不是由原有TVMV产生的沉默抑制子可以抑制基因沉默,使植株再次变为PPV易感型[11]。RNAi的这些研究可帮助人们揭开植物抗病的机理,为最终培育出所需要的优质抗病植株奠定基础。
4參考文献
[1] GUO S,KEMPHEUS K J.Par-1,gene required for establishing polarity in C.elegans embryos,encodes a putative Ser/Thr kinase that is asymm-etrically distributed[J].Cell,1995,81(4):611-620.
[2] FIRE A,XU S,MONTGOMERY M K,et a1.Polent and specific genetic interference by double stranded RNA in eaenorhabditis elegans[J].Nature,1998,391:806-811.
[3] HYNES T R,S M MERVINE,E A YOST,et al.Live cell imaging of Gs and the 2-adrenergic receptor demonstrates that both s and 17 internalize upon stimulation and exhibit similar trafficking patterns that differ from that of the 2-adrenergic receptor[J].Biol Chem,2004(279):44101-44112.
[4] ZAMORE PD,TUSCHL T,SHARP PA,et al.RNAi:double-stranded RNA directs the ATP-dependent[J].Cell,2000,101(1):25-33.
[5] BERNSTEIN E,ALLIS C D.RNA meets chromatin[J].Genes
关键词RNAi;作用机制;农业生产
中图分类号Q522文献标识码A文章编号 1007-5739(2010)06-0039-01
近年来研究表明,一些小的双链RNA(dsRNA)能通过促使mRNA降解,高效特异的抑制细胞内与其同源序列基因的表达,诱使细胞表现特定基因缺失的表型,称为RNA干扰(RNA Interference,RNAi)。不同的有机体,包括植物、果蝇、线虫及一些哺乳动物大多能利用RNA干扰来抵御病毒及其他外来核酸的侵入,提示它可能是生物体的一种进化保守机制。同时,也可能成为基因功能分析和基因治疗的一个革命性工具。
1RNA干扰的发现和命名
1995年,Guo和Kemphues试图利用正义RNA影响秀丽新小杆线虫中的par-1基因的表达,以期观察到基因表达的增强,结果意外的发现正义RNA链和反义RNA链同样地抑制了par-1基因的表达。这与传统上对反义RNA技术的解释正好相反。这是RAN干扰现象的首次发现,但是2人未能作出合理解释[1]。直到1998年,Fire等证实了正义RNA链抑制基因表达,以及过去的反义RNA对基因表达的阻断,都是由于体外转录所得RNA中污染了微量双链RNA而引起。当他们将体外转录得到的单链RNA纯化后注射线虫时发现,基因抑制效应变得十分微弱,而经过纯化的双链RNA却正好相反,能够高效特异性阻断相应基因的表达。该小组将这一现象称为RNA干扰(RNA Interference,RNAi)[2]。
2RNA干扰的机制
对于RNA 干涉的机制,人们先后提出多种模型。Hynes等认为RNA干涉是生物在长期进化过程中形成的一种对病毒侵染的抗性,与基因表达产物的过量与否无关;当病毒或转入的外源基因内部有同源序列,或外源基因与内源基因之间有同源序列时,往往会导致异位配对(ectopic pairing),并转录产生双链的异常RNA(aberrant RNA,aRNA),细胞中一旦产生aRNA,就会激活RdRPs 的活性,RdRPs再以aRNA为模板合成大量21～25 bp的互补RNA(complementary RNA,cRNA)。这些cRNA 与同源mRNA 结合形成部分双链结构dsRNA,被双链特异性RNase 识别并降解。Waterhouse将正义RNA 和反义RNA导入植物后,发现正义RNA与反义RNA共转录比二者单独作用更易引起基因沉默。于是他们认为异位配对并不是导致基因沉默的根本原因,而根本原因在于外源基因插入受体基因组中的方向不同,导致正义RNA和反义RNA的合成。这些转录产物形成dsRNA,dsRNA 在细胞质中被螺旋酶、RdRPs 和类似于RNaseL 的核酸内切酶形成的复合体所识别。螺旋酶使双链解旋,RdRPs 以其中一条链为模板合成cRNA,类似于RNaseL 的核酸内切酶结合于cRNA 的两端,当cRNA与具有同源序列的mRNA结合以后,RNaseL在单链处切开mRNA 分子,从而使mRNA 降解,基因沉默,并由此提出了双链RNA模型[3]。
在该模型中,RNAi发生的基本过程可分为起始阶段和效应阶段。在起始阶段,RNaseⅢ家族的双链特异的核糖核酸酶(在果蝇中命名为Dicer)以ATP依赖的方式将长的dsRNA切割成21~23 nt的小干扰 RNA(small interfering RNA,siRNA)[4-5]。在效应阶段,siRNA参与形成RNA诱导的沉默复合物(RNA-induced silencing complex,RISC)[6]。RISC以ATP依赖的方式催化双链siRNA解旋,然后利用其内部的单链siRNA/miRNA,通过碱基配对识别与之互补的靶 RNA,随后,RISC中的核酸内切酶在距离siRNA 3′端12个碱基的位置切割靶RNA[7]。最后,切割后的靶 RNA在核酸外切酶的作用下被降解,导致目的基因的沉默。
3RNAi技术在农业生产中的应用
随着RNAi技术的日益成熟,其在各个领域的应用也越来越广泛,在农业生产中尤其是育种和作物抗病毒方面也发挥着巨大的作用。
3.1在育种方面的应用研究
雄性不育系及恢复系的培育是产生具有优良性状杂交种的前提,在育种上有重大意义。目前,有很多研究者通过 RNAi技术控制植物花期,研究植物雄性不育及育性恢复。首先,可以培育出受控制的能稳定遗传的不育植株;其次,可减少基因污染,促进植株生长,控制花期,缩短育种周期。Chuang[8]等用RNAi证明了拟南芥中和花发育有关的基因,获了能稳定遗传的雄性不育突变体。其他植物中也有和其同源的基因,可进一步研究其功能,以获得其他植物雄性不育突变体。在育种工作中,远源杂交(或自交)不亲和性使人们难以获得优良的杂交种。为了解决这一问题,人们研究提出许多途径,如选择亲和或不亲和性弱的品种进行种间杂交,增加染色体倍数以促进亲和性较多表现等方法。HT基因是McClure等发现的在分子水平上和花粉自交不亲和性有关的基因,其在烟草花柱中的表达使花柱富含天冬氨酰蛋白。Brien等为阐明HT基因的功能,构建了反义ScHT-A和RNAi ScHT-B系統。在反义系统中ScHT-A mRNA水平有很大降低,没有植物变为自交亲和。在进一步构建的RNAiScHT-B系统中,ScHT-B mRNA特意的干扰,而不会影响到ScHT-A mRNA。结果表明,只有ScHT-B基因和自交不亲和现象有关,并发现30%的ScHT-B基因对维持自交不亲和现象是必须的[9]。除了以上的应用外,RNAi在植物淀粉合成途径、改变植物中淀粉含量、增加植物抗逆性等多方面的应用均有报道 。
3.2RNAi技术在作物抗病毒方面的应用
RNAi序列特异性识别并降解目标RNA,在包括真菌、植物和动物的大量真核生物中都有发现,并被认为是植物的一种抵抗病毒的防御机制。研究者发现,转入病毒基因的植物会对此病毒具有抗性,并且RNA沉默一旦建立,所有和其同源的RNA都会被降解,即植物对同一种病毒的第2次侵染以及与这种病毒部分同源的其他病毒都具有抗性[10]。RNAi技术有助于更加深入的了解植物抵抗病毒入侵的机制,并据此培育出具有优良品质的抗病植株。水稻黄斑病毒 RYMV在非洲广泛流行,自然的预防机制为隐性、多基因性状。将该病毒复制所需的某种酶的基因转入水稻,诱发基因沉默,从而使植物具有RYMV病毒的抗性,这种抗性能稳定遗传3代。进一步研究发现,很多植物RNA病毒也会编码特定的蛋白抑制基因沉默的发生。玉米矮花叶病毒和玉米炭疽线条病毒存在C2/C2一基因,可抑制植物中的RNAi,使C2转录水平升高,花青苷色素沉积加强。有人转入李瘟病毒(Plum pox virus,PPV)NIb序列的烟草在 PPV 编码沉默抑制子(HCPro)情况下,表现出因 RNA沉默引发的对 PPV 的抗性。用具有转基因沉默和病毒抗性的愈伤组织进一步试验证明,能产生沉默抑制子2b和HCPi’o的黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)和烟草脉状病毒(Tobacco vein mottling virus,TVMV)都具有病毒抗性。只有由CMV产生而不是由原有TVMV产生的沉默抑制子可以抑制基因沉默,使植株再次变为PPV易感型[11]。RNAi的这些研究可帮助人们揭开植物抗病的机理,为最终培育出所需要的优质抗病植株奠定基础。
4參考文献
[1] GUO S,KEMPHEUS K J.Par-1,gene required for establishing polarity in C.elegans embryos,encodes a putative Ser/Thr kinase that is asymm-etrically distributed[J].Cell,1995,81(4):611-620.
[2] FIRE A,XU S,MONTGOMERY M K,et a1.Polent and specific genetic interference by double stranded RNA in eaenorhabditis elegans[J].Nature,1998,391:806-811.
[3] HYNES T R,S M MERVINE,E A YOST,et al.Live cell imaging of Gs and the 2-adrenergic receptor demonstrates that both s and 17 internalize upon stimulation and exhibit similar trafficking patterns that differ from that of the 2-adrenergic receptor[J].Biol Chem,2004(279):44101-44112.
[4] ZAMORE PD,TUSCHL T,SHARP PA,et al.RNAi:double-stranded RNA directs the ATP-dependent[J].Cell,2000,101(1):25-33.
[5] BERNSTEIN E,ALLIS C D.RNA meets chromatin[J].Genes