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摘要：谷丰B是一个广谱高抗稻瘟病水稻保持系，含有稻瘟病抗性基因Pid2， Pid3和Pigm。为了进一步明确3个抗性基因在谷丰B中的作用，本研究利用CRISPR/Cas9多基因编辑系统构建了共敲除Pid2+Pid3+Pigm基因载体。通过遗传转化试验以及DNA测序，T0代植株获得多种突变体组合类型。对其中的Pid2、Pigm、Pid2+Pid3、Pid2+Pigm、Pid2+Pid3+Pigm等5种纯合突变体的T1代株系进行稻瘟病室内接种鉴定，研究结果表明，Pid2、Pid3和Pigm分别对86/5013、KJ201/CHE86061和 86/CHE86061/5013的菌株存在显著的抗性效应，Pid2+Pid3，Pid2+Pigm和Pid2+Pid3+Pigm的敲除株系的抗性不完全等同于单个基因的简单叠加，其中Pid2+Pid3+Pigm的突变体对菌株CHL768表现完全不同于其他类型突变体的感病性。上述结果为解析广谱高抗稻瘟病水稻材料谷丰B的抗性遗传机理提供重要信息，也为水稻稻瘟病抗病育种研究提供参考。
关键词：CRISPR/Cas9;水稻;稻瘟病;抗性基因
中图分类号：S 511文献标识码：A文章编号：1008-0384（2018）12-1231-06
稻瘟病是水稻生产最严重的病害之一，流行年份一般减产10%～30%，严重年份减产40%～50%，局部田块绝收[1]。培育和推广广谱高抗稻瘟病水稻品种是目前防治稻瘟病最经济有效且对环境安全的措施。然而，由于抗病基因的不合理使用加速了稻瘟菌的变异，致使稻瘟病抗性品种使用3～5年后丧失抗性[2]。因此，明确广谱高抗水稻品种抗病基因的相互作用对品种的合理布局尤为重要。
CRISPR/Cas9基因编辑技术是利用RNA介导Cas9核酸酶对靶向基因进行精确地修饰，最初是细菌和古细菌在长期演化中形成的对抗外来入侵病毒及外源DNA的一种适应性免疫防御机制[3]。CRISPR/Cas9技术由于操作简单、灵活、成本低、可以精准地对多个靶向基因进行敲除等优点，已成为广泛使用的基因编辑技术[4]。截至目前，利用该技术已经对水稻[5]、玉米[6]、小麦[7]、番茄[8]等作物的产量、抗病等重要农艺性状相关基因进行编辑。
谷丰B是一个广谱高抗稻瘟病水稻保持系，其配套的不育系谷丰A配组育成了27个杂交水稻组合，在生产上大面积推广应用[9]。本研究选用最新开发的抗性基因标记[10-12]，通过PCR扩增及酶切鉴定出谷丰B含有稻瘟病抗性基因Pid2＼ Pid3和Pigm。利用CRISPR/Cas9多基因編辑系统敲除谷丰B中的Pid2、Pid3和Pigm，并结合稻瘟病接种鉴定，明确Pid2， Pid3和Pigm在谷丰B中的相互作用，为其合理利用提供重要信息。
1材料与方法
1.1植物材料、载体和菌株
本研究所用的转基因受体材料谷丰B，以及研究中用到的稻瘟病菌株、大肠杆菌DH5α及农杆菌EHA105均由福建省农业科学院遗传工程重点实验室保存。其中，稻瘟病菌株CHE86061和KJ201含有AVRPi9/AVRPi2/AVRPizt等Pi2/9位点的无毒基因[13]，CHL2110和CHL768分别含有AVRPikp和AVRPi1等无毒基因[14]，86和5013是福建省水稻产区的优势小种，对多数水稻品种都具有很强的致病性，所含有的无毒基因还尚未确认[15]。植物CRISPR/Cas9多基因编辑载体由华南农业大学刘耀光教授课题组开发[16]。
1.2多基因编辑载体构建
通过NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）网站查找稻瘟病抗性基因Pigm、Pid2和Pid3的cDNA序列，利用CRISPRGE网络软件工具包（http：//skl.scau.edu.cn/）设计靶位点并合成敲除引物（表1）。通过酶切连接及PCR扩增构建5个含有U6a和U6b启动子的gRNA表达盒，将5个表达盒串联到载体pYLCRISPR/Cas9PubiH并转化到大肠杆菌DH5α。选取相邻2个表达盒的靶点引物做菌液PCR鉴定及测序验证。将验证正确的菌落提取质粒并转化到农杆菌EHA105，利用农杆菌介导法转化谷丰B愈伤组织。具体载体构建操作步骤参考刘耀光教授课题组开发的植物CRISPR/Cas9多基因编辑载体构建[16]。
1.3靶位点突变类型鉴定
参考张凤娟等[17]的方法提取水稻叶片总DNA。利用潮霉素引物做PCR鉴定转基因阳性植株。跨越各靶位点设计敲除靶点测序引物对转基因阳性植株进行PCR扩增，使用凝胶DNA回收试剂盒回收扩增产物并送测序。用DNAMAN软件将测序结果与野生型基因组进行核苷酸序列比对分析突变类型。
1.4人工接种鉴定
发苗：将待接种水稻种子浸种24 h后置于37℃培养箱催芽，将已经露白的种子播于接种池内。待到15～20 d后三叶期每份材料保留25株苗进行人工喷雾接种。
稻瘟菌培养：用燕麦米糠制备稻瘟菌培养基，接种稻瘟病菌株后放置27℃暗培养箱培养7 d左右。将表面菌丝刮掉以催生孢子。27℃培养箱继续培养10 d。
接种：将稻瘟病菌分生孢子用0.025% Tween 20水溶液洗脱。血球计数板显微镜下计数，孢子悬浮液含量调至2×105个孢子·mL-1。将洗脱的孢子液装入喷雾枪进行人工接种，每份材料喷5 mL孢子液。接种完覆盖一层遮光薄膜培养24 h。
调查：接种7 d左右即可进行调查。根据叶片上病斑的大小及面积评定病级，具体方法参考国际水稻研究所发布的稻瘟病分级标准：0级为高抗无病斑;1级为抗有针尖大小棕色斑点;2级为中抗有圆形稍长的坏死孢子斑，直径约1～2 mm，有明显的棕色边缘或黄色晕;3级为中感有狭窄或稍椭圆形病斑，宽1～2 mm，长3 mm;4级为感有典型纺锤状病斑，有黄色、棕色或紫色边缘;5级为高感有迅速合并白色的、浅灰色的或蓝色的病斑，没有明显的边缘[18]。 2结果与分析
2.1多基因编辑载体构建
利用合成引物扩增出5个gRNA表达盒。将5个gRNA表达盒串联构建在一个基因编辑载体上（图1A）。其中u6a、u6b启动子gRNA表达盒长度分别为629 bp和515 bp（图1B）;利用靶点引物Pid2u6aF和Pid2u6bR进行菌液PCR鉴定，扩增条带在500 bp左右（图1C），符合預期大小;将扩增出预期条带的菌液提取质粒，选取靶位点正向引物对质粒进行测序验证。测序结果中包含靶位点及相应启动子序列。结果表明Pigm+Pid2+Pid3多基因表达载体构建成功。
2.2多基因编辑水稻的鉴定
将Pigm、Pid2和Pid3多基因编辑双元表达载体利用农杆菌介导转化水稻保持系谷丰B的愈伤组织。利用潮霉素引物对T0代植株进行PCR扩增，筛选出转基因株系（图2A）。在靶点两端设计敲除载体测序鉴定引物对转基因株系进行扩增，并对扩增产物测序。通过与野生型基因序列对比，判断靶位点突变类型。结果发现T0代转基因植株出现多种突变体组合类型（图2B），其中突变体GFB23415为Pigm+Pid2+Pid3基因纯合突变;突变体GFB2348为Pigm+Pid3基因的纯合突变;突变体GFB23411是Pid2+Pid3纯合突变;突变体GFB2343和突变体GFB2345分别为Pigm和Pid2基因纯合突变。对上述多种突变体组合类型转基因株系留种，继续种植。T1代幼苗每个株系取10株混合提取DNA进行靶位点突变类型测序鉴定，结果显示均为纯合突变体（图2B）。说明5个突变体材料是稳定遗传的Pid2、 Pid3和Pigm编辑材料。
2.3突变体稻瘟病抗性鉴定与分析
对上述5个突变体株系及谷丰B同时进行稻瘟病接种鉴定，结果显示（表2），相比于野生型谷丰B，Pid2突变体对菌株86和5013表现出感病和高感病性，Pigm突变体对菌株86、CHE86061和5013表现出高感病性;对于Pid2+Pid3和Pid2+Pigm，不仅分别失去了Pid2和Pigm对菌株86、CHE86061和5013的抗性，还表现出对菌株KJ201的感病反应;突变体Pid2+Pid3+Pigm除了完全表现出Pid2，Pid3和Pigm突变体的感病性外，对CHL768也表现出完全不同于其他类型突变体的感病表型。由此可见，Pid2、Pid3和Pigm对谷丰B的抗性表现都具有重要的作用，它们以协同互作的方式贡献了谷丰B的广谱高抗的特性。
3讨论与结论
当前，主效抗病基因多存在于地方品种和野生水稻种质资源中，传统育种难以整合到现代水稻品种中，且存在遗传累赘等利用困难现象。转基因育种不失为一种简捷的手段，但是转基因育种在生产应用推广的问题上悬而未决，限制了其作用。CRISPR/Cas9基因组编辑技术的出现与发展，为创制生物资源及育种提供了新途径。目前该技术已广泛用于草甘膦抗性[19]及小麦白粉病抗性[20]等方面基因的编辑，并取得了明显的效果。CRISPR/Cas9技术的发展为研究水稻瘟病抗性基因提供一条新的途径。Wang等[21]利用CRISPR/Cas9系统编辑稻瘟病侵染效应因子OSERF922，获得了稻瘟病感病率大幅降低的突变体材料。杨海河等[2]利用CRISPR/Cas9技术对感稻瘟病品种的定点突变创制稻瘟病抗性水平明显提高的水稻pi21基因编辑材料。
CRISPR/Cas9系统会引发特异靶点产生多种形式的突变，主要包括碱基的缺失、插入以及替换。本研究中获得的突变体材料的突变类型主要是碱基缺失，少数出现单碱基的插入。其中突变体GFB23411的Pid2基因出现两个靶位点间的序列全部缺失，与王芳权等[22]对水稻pi21基因敲除的研究结果一致，可能是两个靶点距离较近且突变事件同时发生导致的，为敲除两点间的特异序列提供一定依据。由于等位基因出现不同的突变类型，又可以将突变体材料分为杂合突变型（1个等位基因突变，1等位基因不突变）、纯合突变型（两个等位基因突变类型一致）和双等位突变（两个等位基因突变类型不一致）。杂合突变类型株系自交后代会出现分离而导致功能的减弱或丧失，纯合和双等位突变类型不会出现后代自交分离现象。本研究采用的是刘耀光课题组开发的植物多靶点CRISPR/Cas9系统[16]，创制Pid2、Pigm、Pid2+Pid3、Pid2+Pigm和Pid2+Pid3+Pigm纯合突变体材料。
水稻对稻瘟病的抗性涉及复杂的网络调控，既有病原菌相关模式分子诱发的免疫反应（PAMPtriggered immunity， PTI）[23]，又有效应分子诱发的免疫反应（Effectortriggered immunity， ETI）[24]。其中ETI是由主效基因主导的抗性反应，也是当前抗病育种中应用的主要成分。谷丰B在长期的生产实践表现出稳定的稻瘟病抗性水平。本课题组通过分子标记鉴定出谷丰B里存在Pigm、Pid2和Pid3抗稻瘟病基因，研究成果将另文发表。本研究利用CRISPR/Cas9对谷丰B里的Pigm、Pid2和Pid3进行编辑后获得的突变体材料抗性水平下降，其中单个抗病基因敲除和多个抗病基因同时敲除的突变体材料对稻瘟病菌86及5013都表现出感或高感。可能是3个抗病基因之间可以相互作用共同抵抗某种稻瘟病生理小种。有研究表明抗性蛋白和无毒蛋白可以通过3种方式相互作用[25-27]。一个抗性蛋白可能不止和一个无毒蛋白直接互作，一个无毒蛋白也可以识别不同的抗性蛋白。因此，多个抗性蛋白可能会联合作用，增强对病原菌的抗性。这说明谷丰B对稻瘟病高抗性是由Pigm、Pid2和Pid3等3个或其他多个抗性基因共同作用的结果，而不是单个基因的简单叠加。
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（责任编辑：张梅）
关键词：CRISPR/Cas9;水稻;稻瘟病;抗性基因
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稻瘟病是水稻生产最严重的病害之一，流行年份一般减产10%～30%，严重年份减产40%～50%，局部田块绝收[1]。培育和推广广谱高抗稻瘟病水稻品种是目前防治稻瘟病最经济有效且对环境安全的措施。然而，由于抗病基因的不合理使用加速了稻瘟菌的变异，致使稻瘟病抗性品种使用3～5年后丧失抗性[2]。因此，明确广谱高抗水稻品种抗病基因的相互作用对品种的合理布局尤为重要。
CRISPR/Cas9基因编辑技术是利用RNA介导Cas9核酸酶对靶向基因进行精确地修饰，最初是细菌和古细菌在长期演化中形成的对抗外来入侵病毒及外源DNA的一种适应性免疫防御机制[3]。CRISPR/Cas9技术由于操作简单、灵活、成本低、可以精准地对多个靶向基因进行敲除等优点，已成为广泛使用的基因编辑技术[4]。截至目前，利用该技术已经对水稻[5]、玉米[6]、小麦[7]、番茄[8]等作物的产量、抗病等重要农艺性状相关基因进行编辑。
谷丰B是一个广谱高抗稻瘟病水稻保持系，其配套的不育系谷丰A配组育成了27个杂交水稻组合，在生产上大面积推广应用[9]。本研究选用最新开发的抗性基因标记[10-12]，通过PCR扩增及酶切鉴定出谷丰B含有稻瘟病抗性基因Pid2＼ Pid3和Pigm。利用CRISPR/Cas9多基因編辑系统敲除谷丰B中的Pid2、Pid3和Pigm，并结合稻瘟病接种鉴定，明确Pid2， Pid3和Pigm在谷丰B中的相互作用，为其合理利用提供重要信息。
1材料与方法
1.1植物材料、载体和菌株
本研究所用的转基因受体材料谷丰B，以及研究中用到的稻瘟病菌株、大肠杆菌DH5α及农杆菌EHA105均由福建省农业科学院遗传工程重点实验室保存。其中，稻瘟病菌株CHE86061和KJ201含有AVRPi9/AVRPi2/AVRPizt等Pi2/9位点的无毒基因[13]，CHL2110和CHL768分别含有AVRPikp和AVRPi1等无毒基因[14]，86和5013是福建省水稻产区的优势小种，对多数水稻品种都具有很强的致病性，所含有的无毒基因还尚未确认[15]。植物CRISPR/Cas9多基因编辑载体由华南农业大学刘耀光教授课题组开发[16]。
1.2多基因编辑载体构建
通过NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）网站查找稻瘟病抗性基因Pigm、Pid2和Pid3的cDNA序列，利用CRISPRGE网络软件工具包（http：//skl.scau.edu.cn/）设计靶位点并合成敲除引物（表1）。通过酶切连接及PCR扩增构建5个含有U6a和U6b启动子的gRNA表达盒，将5个表达盒串联到载体pYLCRISPR/Cas9PubiH并转化到大肠杆菌DH5α。选取相邻2个表达盒的靶点引物做菌液PCR鉴定及测序验证。将验证正确的菌落提取质粒并转化到农杆菌EHA105，利用农杆菌介导法转化谷丰B愈伤组织。具体载体构建操作步骤参考刘耀光教授课题组开发的植物CRISPR/Cas9多基因编辑载体构建[16]。
1.3靶位点突变类型鉴定
参考张凤娟等[17]的方法提取水稻叶片总DNA。利用潮霉素引物做PCR鉴定转基因阳性植株。跨越各靶位点设计敲除靶点测序引物对转基因阳性植株进行PCR扩增，使用凝胶DNA回收试剂盒回收扩增产物并送测序。用DNAMAN软件将测序结果与野生型基因组进行核苷酸序列比对分析突变类型。
1.4人工接种鉴定
发苗：将待接种水稻种子浸种24 h后置于37℃培养箱催芽，将已经露白的种子播于接种池内。待到15～20 d后三叶期每份材料保留25株苗进行人工喷雾接种。
稻瘟菌培养：用燕麦米糠制备稻瘟菌培养基，接种稻瘟病菌株后放置27℃暗培养箱培养7 d左右。将表面菌丝刮掉以催生孢子。27℃培养箱继续培养10 d。
接种：将稻瘟病菌分生孢子用0.025% Tween 20水溶液洗脱。血球计数板显微镜下计数，孢子悬浮液含量调至2×105个孢子·mL-1。将洗脱的孢子液装入喷雾枪进行人工接种，每份材料喷5 mL孢子液。接种完覆盖一层遮光薄膜培养24 h。
调查：接种7 d左右即可进行调查。根据叶片上病斑的大小及面积评定病级，具体方法参考国际水稻研究所发布的稻瘟病分级标准：0级为高抗无病斑;1级为抗有针尖大小棕色斑点;2级为中抗有圆形稍长的坏死孢子斑，直径约1～2 mm，有明显的棕色边缘或黄色晕;3级为中感有狭窄或稍椭圆形病斑，宽1～2 mm，长3 mm;4级为感有典型纺锤状病斑，有黄色、棕色或紫色边缘;5级为高感有迅速合并白色的、浅灰色的或蓝色的病斑，没有明显的边缘[18]。 2结果与分析
2.1多基因编辑载体构建
利用合成引物扩增出5个gRNA表达盒。将5个gRNA表达盒串联构建在一个基因编辑载体上（图1A）。其中u6a、u6b启动子gRNA表达盒长度分别为629 bp和515 bp（图1B）;利用靶点引物Pid2u6aF和Pid2u6bR进行菌液PCR鉴定，扩增条带在500 bp左右（图1C），符合預期大小;将扩增出预期条带的菌液提取质粒，选取靶位点正向引物对质粒进行测序验证。测序结果中包含靶位点及相应启动子序列。结果表明Pigm+Pid2+Pid3多基因表达载体构建成功。
2.2多基因编辑水稻的鉴定
将Pigm、Pid2和Pid3多基因编辑双元表达载体利用农杆菌介导转化水稻保持系谷丰B的愈伤组织。利用潮霉素引物对T0代植株进行PCR扩增，筛选出转基因株系（图2A）。在靶点两端设计敲除载体测序鉴定引物对转基因株系进行扩增，并对扩增产物测序。通过与野生型基因序列对比，判断靶位点突变类型。结果发现T0代转基因植株出现多种突变体组合类型（图2B），其中突变体GFB23415为Pigm+Pid2+Pid3基因纯合突变;突变体GFB2348为Pigm+Pid3基因的纯合突变;突变体GFB23411是Pid2+Pid3纯合突变;突变体GFB2343和突变体GFB2345分别为Pigm和Pid2基因纯合突变。对上述多种突变体组合类型转基因株系留种，继续种植。T1代幼苗每个株系取10株混合提取DNA进行靶位点突变类型测序鉴定，结果显示均为纯合突变体（图2B）。说明5个突变体材料是稳定遗传的Pid2、 Pid3和Pigm编辑材料。
2.3突变体稻瘟病抗性鉴定与分析
对上述5个突变体株系及谷丰B同时进行稻瘟病接种鉴定，结果显示（表2），相比于野生型谷丰B，Pid2突变体对菌株86和5013表现出感病和高感病性，Pigm突变体对菌株86、CHE86061和5013表现出高感病性;对于Pid2+Pid3和Pid2+Pigm，不仅分别失去了Pid2和Pigm对菌株86、CHE86061和5013的抗性，还表现出对菌株KJ201的感病反应;突变体Pid2+Pid3+Pigm除了完全表现出Pid2，Pid3和Pigm突变体的感病性外，对CHL768也表现出完全不同于其他类型突变体的感病表型。由此可见，Pid2、Pid3和Pigm对谷丰B的抗性表现都具有重要的作用，它们以协同互作的方式贡献了谷丰B的广谱高抗的特性。
3讨论与结论
当前，主效抗病基因多存在于地方品种和野生水稻种质资源中，传统育种难以整合到现代水稻品种中，且存在遗传累赘等利用困难现象。转基因育种不失为一种简捷的手段，但是转基因育种在生产应用推广的问题上悬而未决，限制了其作用。CRISPR/Cas9基因组编辑技术的出现与发展，为创制生物资源及育种提供了新途径。目前该技术已广泛用于草甘膦抗性[19]及小麦白粉病抗性[20]等方面基因的编辑，并取得了明显的效果。CRISPR/Cas9技术的发展为研究水稻瘟病抗性基因提供一条新的途径。Wang等[21]利用CRISPR/Cas9系统编辑稻瘟病侵染效应因子OSERF922，获得了稻瘟病感病率大幅降低的突变体材料。杨海河等[2]利用CRISPR/Cas9技术对感稻瘟病品种的定点突变创制稻瘟病抗性水平明显提高的水稻pi21基因编辑材料。
CRISPR/Cas9系统会引发特异靶点产生多种形式的突变，主要包括碱基的缺失、插入以及替换。本研究中获得的突变体材料的突变类型主要是碱基缺失，少数出现单碱基的插入。其中突变体GFB23411的Pid2基因出现两个靶位点间的序列全部缺失，与王芳权等[22]对水稻pi21基因敲除的研究结果一致，可能是两个靶点距离较近且突变事件同时发生导致的，为敲除两点间的特异序列提供一定依据。由于等位基因出现不同的突变类型，又可以将突变体材料分为杂合突变型（1个等位基因突变，1等位基因不突变）、纯合突变型（两个等位基因突变类型一致）和双等位突变（两个等位基因突变类型不一致）。杂合突变类型株系自交后代会出现分离而导致功能的减弱或丧失，纯合和双等位突变类型不会出现后代自交分离现象。本研究采用的是刘耀光课题组开发的植物多靶点CRISPR/Cas9系统[16]，创制Pid2、Pigm、Pid2+Pid3、Pid2+Pigm和Pid2+Pid3+Pigm纯合突变体材料。
水稻对稻瘟病的抗性涉及复杂的网络调控，既有病原菌相关模式分子诱发的免疫反应（PAMPtriggered immunity， PTI）[23]，又有效应分子诱发的免疫反应（Effectortriggered immunity， ETI）[24]。其中ETI是由主效基因主导的抗性反应，也是当前抗病育种中应用的主要成分。谷丰B在长期的生产实践表现出稳定的稻瘟病抗性水平。本课题组通过分子标记鉴定出谷丰B里存在Pigm、Pid2和Pid3抗稻瘟病基因，研究成果将另文发表。本研究利用CRISPR/Cas9对谷丰B里的Pigm、Pid2和Pid3进行编辑后获得的突变体材料抗性水平下降，其中单个抗病基因敲除和多个抗病基因同时敲除的突变体材料对稻瘟病菌86及5013都表现出感或高感。可能是3个抗病基因之间可以相互作用共同抵抗某种稻瘟病生理小种。有研究表明抗性蛋白和无毒蛋白可以通过3种方式相互作用[25-27]。一个抗性蛋白可能不止和一个无毒蛋白直接互作，一个无毒蛋白也可以识别不同的抗性蛋白。因此，多个抗性蛋白可能会联合作用，增强对病原菌的抗性。这说明谷丰B对稻瘟病高抗性是由Pigm、Pid2和Pid3等3个或其他多个抗性基因共同作用的结果，而不是单个基因的简单叠加。
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（责任编辑：张梅）