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关键词多重PCR；植物生物学；应用
中图分类号S188文献标识码A文章编号0517-6611（2015）06-093-03
收稿日期20150107聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是体外酶促合成反应、重复扩增DNA序列的一种方法，可以使目标DNA片段在几个小时内扩增出千万倍。自1983年PCR技术建立以来，由于其超强的扩增能力，且可与其他分子生物学方法相结合，已广泛应用于生命科学的各个领域，成为发展和应用最为迅猛的分子生物学技术之一。随着该技术的不断发展和创新，目前已开发出了一系列适用于不同研究目的的PCR新技术，如反转录PCR、荧光实时定量PCR、差异显示PCR、着色互补PCR、巢式PCR、免疫PCR、多重PCR等[1-3]。
多重PCR（Multiplex-PCR）技术因为具有高效快捷、高度特异敏感、实验成本低、实验进程快等优点而得到广泛应用。自1988年Chamberian等[4]首先报道了用多重PCR诊断杜式肌营养不良症（DMD）以来，多重PCR技术迅速在动物、微生物以及人类研究方面得到广泛应用[5-6]。然而，多重PCR技术在植物生物学研究方面起步较晚，研究与应用相对较少[7]。目前，随着对多重PCR技术认识的加深和研究的深入，越来越多的植物学家们热衷于研究多重PCR技术在植物生物学中的应用。
1 多重PCR技术的原理和发展
1.1 多重PCR技术的原理多重PCR（multiplex PCR）是在普通PCR的基础上发展起来的，其原理与常规PCR基本相同，即它是在同一个PCR反应体系中加入2对或2对以上的特异性引物，由于各引物都能与模板DNA特异性结合，因而可同时扩增出针对多个DNA模板或同一模板不同区的多个目的DNA片段[8-10]，该方法可节省时间、降低成本、提高效率、加快试验进程。该技术基于引物筛选的基础上，需要对反应体系和反应条件进行多次优化。
1.2多重PCR技术的发展近年来，随着分子生物学的迅猛发展和新技术的不断涌现， 基于传统的多重PCR原理已开发出一系列的新技术，如多重PCR生物芯片技术、双寡聚核苷酸引物多重PCR技术、AFLP多重PCR、逆转录多重PCR、巢式多重PCR、实时多重PCR技术、荧光定量多重PCR等，以满足实践中不同研究和应用的需求[11]。目前，基于多重PCR试剂盒的研发也取得了一些进展，如QIAGEN公司研制出的一种新型多重PCR反应缓冲系统，通过添加NH+4来调节平衡K+，以扩大多重PCR反应的最适退火温度范围；BioSource研制出的多重PCR试剂盒，可以直接用于目标基因的检测和分析[12]。
2 多重PCR技术在植物生物学研究中的应用
2.1植物种质纯度和属性鉴定多重PCR技术已成为植物种质纯度鉴定、血统归属辨别方面的一种高效、快捷的手段。在大田作物种质纯度鉴定方面，Arlorio等[13]应用多重PCR将硬粒小麦和普通小麦区分开，且是基于内转录间隔区（ITS）的扩增，所以在高温下也能有效工作。万映秀等[14]建立了3个多重PCR体系并应用到141份国内外小麦品种的检测中，其结果与SDSPAGE结果相比较，这3个多重PCR体系能够准确高效地检测9个小麦品质性状的基因组成。谭君等[15]以3个玉米自交系、4个玉米杂交种为试验材料，建立了7对SSR引物的多重PCR体系，对玉米杂交种和自交种进行鉴定，结果在准确可靠性上优于单一引物PCR，充分显示出多重PCR高效快捷、成本低廉的优点。陈浩东等[16]利用双重PCR检测体系对杂交棉种子纯度进行了鉴定，对亲缘关系较近的品种间混杂进行了三重、四重PCR扩增，也得到了正常的扩增结果，为进一步简化棉花SSR多重PCR程序及优化处理提供了有益参考。在园艺植物种质鉴别方面，Polashock等[17]利用多重PCR技术快速地鉴别出不同基因型的美洲浆果；Li等[18]基于多重PCR分子检测，鉴别出酿造葡萄酒和苹果汁所用的果品种类。在植物血统归属方面，可以根据植物不同种质的生物学特性，利用多重PCR进行鉴别，如Pastorino等[19]采用多重PCR技术对不同种属大豆的根瘤菌进行扩增，基于扩增出不同大小的基因片段长度将其血统归属辨别开来，结果扩增出的730 bp基因片段与我国血统的大豆根瘤菌的寄主品种特异基因同源，900 bp的基因片段与日本大豆根瘤菌的寄主品种的特异基因同源，故此较好地辨别出中国大豆和日本大豆。
2.2转基因植物鉴定目前，多重PCR技术已成功应用于转基因和非转基因植物的鉴别实践中[20]。2002年，Permingeat等[21]基于2对引物的PCR技术同时检测CryIA基因和PAT基因，成功地将转基因玉米与非转基因玉米区分开来。2005年，邵碧英等[22]提取玉米及其制品的总DNA，用PCR方法检测其中的转基因成分并筛选阳性样品，建立几组玉米内源zein基因和转基因成分之间的多重PCR检测方法，结果表明，所建立的多重PCR方法应用于同时检测玉米内源基因和转基因成分是可行的。2006年，邵碧英等[23]建立的马铃薯内源PATA基因和3种转基因成分之间的多重PCR检测体系，能够特异地应用于马铃薯及其制品中转基因成分的检测。2009年，王渭霞等[24]利用四重PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳，能够快速准确地检测出目前为止转基因水稻中常用的CaMV35S、NOS、Bt 、CpTi等外源基因。2011年，陈贞等[25]建立棉花转基因成分六重PCR检测体系，以棉花内源基因sad1、报告基因GUS、外源抗虫基因Cry1Ab /Ac、筛选基因NPTⅡ、NOS终止子和CaMV35S启动子为检测目标，结果表明该多重PCR检测体系能够有效地从少至1颗棉籽的少量样品中检测出其中的转基因成分。2013年，邱良焱等[26]以转Bar、Bt基因的双抗稻米为试验原料，针对其水稻内源基因SPS和外源基因设计多重PCR检测体系，成功地应用该检测体系快速地检测出原料中的全部6条目标基因。 2.3植物病害检测多重PCR在生物体疾病诊断或检测上的应用是从人类开始的，所以在人类和动物上有着非常广泛的应用，并取得了巨大的成就。相比之下，多重PCR在植物病虫害检测上的应用研究较少。2001年，Fraaije等[27]利用多重PCR一次性辨别出小麦的叶斑病、条锈病、黄锈病和褐锈病这4种病原体，然后提取出来并按量接种到19个小麦品种上，结果表明，大多数冬小麦品种的表现性状与其接种量成正比，这为其他大样本病害的早期检测和防治提供了有益的参考。2002年，Dovas等[28]对感染黄化病的马铃薯植株进行取样分析时发现，马铃薯同时被2种病毒（TICV和ToCV）侵染，由于这2种病毒扩增出的片段分别是229和466 bp，所以他们运用多重PCR对样品进行分析，能快速、准确地将其鉴别出来。2008年，岳红妮等[29]通过多次优化建立起可同时检测大麦条纹花叶病毒、大麦黄矮病毒PAV株系、小麦黄花叶病毒和小麦蓝矮植原体的多重PCR检测体系，被这4种病毒复合侵染的小麦多重PCR扩增后出现了503、600、898和1 240 bp的4条特异性带，实现了植原体DNA病原和病毒RNA病原的同时检测，体现出多重PCR的优越性。张显勇等[30]也建立了可以同时检测甘蔗花叶病和宿根矮化病的多重PCR检测体系，能够稳定且特异地检测出蔗株中是否有导致甘蔗花叶病和宿根矮化病的单一或混合的病原。2010年，谭小勇等[31]建立的三重PCR体系扩增出615、480和945 bp的特异片段可同时用来检测香蕉束顶病毒﹑黄瓜花叶病毒和香蕉线条病毒，进一步利用该三重PCR技术初步检测49份采自华南地区不同蕉区的田间样品，结果表明该多重PCR体系可以有效地检测上述3种病毒。2011年，赵芹等[32]根据小西葫芦黄花叶病毒、番木瓜环斑病毒和黄瓜花叶病毒的外壳蛋白基因保守区序列设计了特异引物，在单一PCR的基础上经过优化，初步建立了能同时检测以上3种病毒的多重PCR检测体系，为节瓜病毒病原的检测提供了理论与技术支持。
2.4植物的抗病基因检测近年来，利用多重PCR技术同时检测2种以上抗病基因的研究越来越受到人们的重视。2005年，李君明等[33]利用多重PCR反应体系，分别对番茄抗根结线虫的Mi基因、抗番茄花叶病毒病的Tm-22基因紧密连锁的SCAR标记进行了同时扩增筛选，扩增的特异性片段与单引物扩增片段基本完全吻合，再进行酶切以鉴别杂纯合基因型和感病基因型，该体系可用于在同一PCR反应体系中，对2个抗病基因进行同时筛选鉴定及苗期早期辅助选育。2008年，倪大虎等[34]利用多重PCR技术， 可以在同一PCR反应体系中同时选择Pi9（t）基因和Xa21基因， 与分别的单一PCR检测结果完全一致，提高了PCR的选择效率。2011年，研究者[35]建立了可同时检测抗马铃薯胞囊线虫H1基因，抗马铃薯X病毒RX1基因，抗马铃薯晚疫病R1、R2基因和抗马铃薯Y病毒Rychc基因的多重PCR检测体系，并利用此体系检测含有这5种抗病基因的96株杂交植株时，结果准确、可靠，且用时比单一PCR少得多。2012年，陈涛等[36]利用与抗白粉病基因Pm21和Pm13连锁的特异标记，随机挑选出114株含有抗白粉病基因Pm21和Pm13的杂交F4代群体进行单一PCR和多重PCR检测，其中5株具有Pm21的特异标记，4株具有Pm13的特异标记，还有4个单株同时具有Pm21和Pm13的特异标记，多重PCR与单一PCR检测结果一致。这说明该体系可以应用于对Pm21和Pm13的多重PCR检测，能够更加快速地检测出含有这2个抗病基因的累加体材料。2013年，刘超勤等[37]只利用一次多重PCR反应同时对番茄抗黄化曲叶病毒病的Ty1、Ty2基因，抗根结线虫病Mi基因和抗叶霉病Cf5基因紧密连锁的CAPS标记进行了筛选，经酶切后所获得的特异性片段大小与前人试验所得大小基本相同，证明了四重PCR检测的准确性。
2.5在植物育种上的应用近年来，育种学家们也把多重PCR技术运用到多种植物育种过程中。2003年，研究者[38]运用多重PCR技术分析澳大利亚主要的50个小麦栽培种的高分子量麦谷蛋白亚基，结果显示仅有2个品种的高分子量麦谷蛋白亚基与前人测定的不同，随后也证实了是前人检测有误。该体系中所使用的3个引物对都处于小麦不同的染色体组，这能同时鉴定出所有的高分子量麦谷蛋白亚基。2003年，张树珍等[39]以PchsA为启动子构建了康乃馨ACC氧化酶基因的反义植物表达载体，通过农杆菌介导法把这个载体导入康乃馨优良的栽培品种中，获得3株转基因植株，经多重PCR和PCRSouthern杂交检测，证实康乃馨ACC氧化酶的反义基因已经整合到康乃馨的基因组中，获得了能延长插瓶寿命的康乃馨新品种。2007年，张晓科等[40]利用现有小麦品质性状基因的分子标记，建立了3个多重PCR体系，并用已知性状的品种进行了验证。其中，多重PCR体系Ⅰ可用于一般的小麦品质分子育种，以提高选育材料的整体加工品质水平；体系Ⅱ可用于强筋小麦品种的选育；体系Ⅲ可用于淀粉品质或糯小麦的选育。由于每个体系中的引物之间不存在相互抑制和错配，因此品种检测的结果可靠、重复性好、成本低。将这3个多重PCR检测体系用于小麦品质育种的亲本评价和杂交后代优质基因的聚合，有助于提高优质专用小麦品种评价和选育的效率。2009年，郑寒等[41]基于小麦Ax1/Ax2、Dx5和Bx7OE等优质亚基的特异性分子标记构建相应的多重PCR体系，经过品种和群体检验，利用该体系鉴定这些亚基的结果稳定可靠、成本低。进一步利用该技术对89份西藏小麦育成和推广品种（系）的优质亚基频率进行鉴定，结果显示，该区小麦没有检测到Bx7OE，同时携带2个优质亚基的材料频率约为10%。这说明，多重PCR可作为一种可靠性高、实用性强的标记辅助选择技术用于小麦品质育种亲本评价和杂交聚合优质亚基基因小麦新品种的选育。在其他植物分子育种实践中，多重PCR技术体系的建立和应用研究也相继展开。 3多重PCR技术在植物生物学研究中的应用前景
分子方法研究植物是近20年植物生物学研究的重要发展阶段，而许多分子方法的推进都是基于新的PCR技术的开发和应用。相对单一PCR而言，多重PCR具有极大的优越性：一次PCR反应中能同时检测多个基因型，因而高效、快捷、经济；PCR反应中高度特异敏感，因而保证了扩增结果的准确、可靠；试验操作简单、程序化、耗时少，在一定程度上加速了试验进程。这些优点使得多重PCR在多个方面得到了飞速发展，已经在人类学、动物学、植物学、微生物学、食品学研究等方面得到了广泛应用[42]。
由于多重PCR是在同一体系中进行复合扩增，故其在植物生物学研究的实践中不可避免地存在一定的问题和缺陷，如可能存在多对引物之间的相互抑制、引物与非靶序列的结合产生非特异性扩增，等。因此，在多重PCR的应用中，如何合理设计引物，优化最佳多重PCR体系及反应条件以减少非特异性扩增至关重要。这通常需要基于反应中的主要成分和反应条件进行多次优化后以确定一个成熟的反应体系，再视不同模板和引物来适当调整试验条件[43]。也有一些研究者直接应用与成熟的单一PCR反应完全相同的条件，在遵循引物组合的一般原则下进行多重PCR试验，同样取得了令人满意的结果[44]。这样可以避免为建立多重PCR反应体系需要进行的繁琐优化试验，也相应拓展了多重PCR技术在实际中的应用范畴。
随着多重PCR技术的不断发展应用，其与其他技术的结合也越来越多。如将多重PCR与毛细管电泳技术结合，可以提高基因分裂效率和检测的准确度[45]；将多重PCR与四色荧光技术结合，可以提高检测的灵敏度和缩短检测时间[46]，等。今后，随着现代生物技术的发展，多重PCR技术及与其他技术的结合在植物生物学研究中越来越受到广大植物学家们的青睐，尤其是在DNA遗传分析和基因检测方面具有广阔的应用前景和发展方向。
43卷6期任素贤等多重PCR技术在植物生物学研究中的应用进展参考文献
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多重PCR（Multiplex-PCR）技术因为具有高效快捷、高度特异敏感、实验成本低、实验进程快等优点而得到广泛应用。自1988年Chamberian等[4]首先报道了用多重PCR诊断杜式肌营养不良症（DMD）以来，多重PCR技术迅速在动物、微生物以及人类研究方面得到广泛应用[5-6]。然而，多重PCR技术在植物生物学研究方面起步较晚，研究与应用相对较少[7]。目前，随着对多重PCR技术认识的加深和研究的深入，越来越多的植物学家们热衷于研究多重PCR技术在植物生物学中的应用。
1 多重PCR技术的原理和发展
1.1 多重PCR技术的原理多重PCR（multiplex PCR）是在普通PCR的基础上发展起来的，其原理与常规PCR基本相同，即它是在同一个PCR反应体系中加入2对或2对以上的特异性引物，由于各引物都能与模板DNA特异性结合，因而可同时扩增出针对多个DNA模板或同一模板不同区的多个目的DNA片段[8-10]，该方法可节省时间、降低成本、提高效率、加快试验进程。该技术基于引物筛选的基础上，需要对反应体系和反应条件进行多次优化。
1.2多重PCR技术的发展近年来，随着分子生物学的迅猛发展和新技术的不断涌现， 基于传统的多重PCR原理已开发出一系列的新技术，如多重PCR生物芯片技术、双寡聚核苷酸引物多重PCR技术、AFLP多重PCR、逆转录多重PCR、巢式多重PCR、实时多重PCR技术、荧光定量多重PCR等，以满足实践中不同研究和应用的需求[11]。目前，基于多重PCR试剂盒的研发也取得了一些进展，如QIAGEN公司研制出的一种新型多重PCR反应缓冲系统，通过添加NH+4来调节平衡K+，以扩大多重PCR反应的最适退火温度范围；BioSource研制出的多重PCR试剂盒，可以直接用于目标基因的检测和分析[12]。
2 多重PCR技术在植物生物学研究中的应用
2.1植物种质纯度和属性鉴定多重PCR技术已成为植物种质纯度鉴定、血统归属辨别方面的一种高效、快捷的手段。在大田作物种质纯度鉴定方面，Arlorio等[13]应用多重PCR将硬粒小麦和普通小麦区分开，且是基于内转录间隔区（ITS）的扩增，所以在高温下也能有效工作。万映秀等[14]建立了3个多重PCR体系并应用到141份国内外小麦品种的检测中，其结果与SDSPAGE结果相比较，这3个多重PCR体系能够准确高效地检测9个小麦品质性状的基因组成。谭君等[15]以3个玉米自交系、4个玉米杂交种为试验材料，建立了7对SSR引物的多重PCR体系，对玉米杂交种和自交种进行鉴定，结果在准确可靠性上优于单一引物PCR，充分显示出多重PCR高效快捷、成本低廉的优点。陈浩东等[16]利用双重PCR检测体系对杂交棉种子纯度进行了鉴定，对亲缘关系较近的品种间混杂进行了三重、四重PCR扩增，也得到了正常的扩增结果，为进一步简化棉花SSR多重PCR程序及优化处理提供了有益参考。在园艺植物种质鉴别方面，Polashock等[17]利用多重PCR技术快速地鉴别出不同基因型的美洲浆果；Li等[18]基于多重PCR分子检测，鉴别出酿造葡萄酒和苹果汁所用的果品种类。在植物血统归属方面，可以根据植物不同种质的生物学特性，利用多重PCR进行鉴别，如Pastorino等[19]采用多重PCR技术对不同种属大豆的根瘤菌进行扩增，基于扩增出不同大小的基因片段长度将其血统归属辨别开来，结果扩增出的730 bp基因片段与我国血统的大豆根瘤菌的寄主品种特异基因同源，900 bp的基因片段与日本大豆根瘤菌的寄主品种的特异基因同源，故此较好地辨别出中国大豆和日本大豆。
2.2转基因植物鉴定目前，多重PCR技术已成功应用于转基因和非转基因植物的鉴别实践中[20]。2002年，Permingeat等[21]基于2对引物的PCR技术同时检测CryIA基因和PAT基因，成功地将转基因玉米与非转基因玉米区分开来。2005年，邵碧英等[22]提取玉米及其制品的总DNA，用PCR方法检测其中的转基因成分并筛选阳性样品，建立几组玉米内源zein基因和转基因成分之间的多重PCR检测方法，结果表明，所建立的多重PCR方法应用于同时检测玉米内源基因和转基因成分是可行的。2006年，邵碧英等[23]建立的马铃薯内源PATA基因和3种转基因成分之间的多重PCR检测体系，能够特异地应用于马铃薯及其制品中转基因成分的检测。2009年，王渭霞等[24]利用四重PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳，能够快速准确地检测出目前为止转基因水稻中常用的CaMV35S、NOS、Bt 、CpTi等外源基因。2011年，陈贞等[25]建立棉花转基因成分六重PCR检测体系，以棉花内源基因sad1、报告基因GUS、外源抗虫基因Cry1Ab /Ac、筛选基因NPTⅡ、NOS终止子和CaMV35S启动子为检测目标，结果表明该多重PCR检测体系能够有效地从少至1颗棉籽的少量样品中检测出其中的转基因成分。2013年，邱良焱等[26]以转Bar、Bt基因的双抗稻米为试验原料，针对其水稻内源基因SPS和外源基因设计多重PCR检测体系，成功地应用该检测体系快速地检测出原料中的全部6条目标基因。 2.3植物病害检测多重PCR在生物体疾病诊断或检测上的应用是从人类开始的，所以在人类和动物上有着非常广泛的应用，并取得了巨大的成就。相比之下，多重PCR在植物病虫害检测上的应用研究较少。2001年，Fraaije等[27]利用多重PCR一次性辨别出小麦的叶斑病、条锈病、黄锈病和褐锈病这4种病原体，然后提取出来并按量接种到19个小麦品种上，结果表明，大多数冬小麦品种的表现性状与其接种量成正比，这为其他大样本病害的早期检测和防治提供了有益的参考。2002年，Dovas等[28]对感染黄化病的马铃薯植株进行取样分析时发现，马铃薯同时被2种病毒（TICV和ToCV）侵染，由于这2种病毒扩增出的片段分别是229和466 bp，所以他们运用多重PCR对样品进行分析，能快速、准确地将其鉴别出来。2008年，岳红妮等[29]通过多次优化建立起可同时检测大麦条纹花叶病毒、大麦黄矮病毒PAV株系、小麦黄花叶病毒和小麦蓝矮植原体的多重PCR检测体系，被这4种病毒复合侵染的小麦多重PCR扩增后出现了503、600、898和1 240 bp的4条特异性带，实现了植原体DNA病原和病毒RNA病原的同时检测，体现出多重PCR的优越性。张显勇等[30]也建立了可以同时检测甘蔗花叶病和宿根矮化病的多重PCR检测体系，能够稳定且特异地检测出蔗株中是否有导致甘蔗花叶病和宿根矮化病的单一或混合的病原。2010年，谭小勇等[31]建立的三重PCR体系扩增出615、480和945 bp的特异片段可同时用来检测香蕉束顶病毒﹑黄瓜花叶病毒和香蕉线条病毒，进一步利用该三重PCR技术初步检测49份采自华南地区不同蕉区的田间样品，结果表明该多重PCR体系可以有效地检测上述3种病毒。2011年，赵芹等[32]根据小西葫芦黄花叶病毒、番木瓜环斑病毒和黄瓜花叶病毒的外壳蛋白基因保守区序列设计了特异引物，在单一PCR的基础上经过优化，初步建立了能同时检测以上3种病毒的多重PCR检测体系，为节瓜病毒病原的检测提供了理论与技术支持。
2.4植物的抗病基因检测近年来，利用多重PCR技术同时检测2种以上抗病基因的研究越来越受到人们的重视。2005年，李君明等[33]利用多重PCR反应体系，分别对番茄抗根结线虫的Mi基因、抗番茄花叶病毒病的Tm-22基因紧密连锁的SCAR标记进行了同时扩增筛选，扩增的特异性片段与单引物扩增片段基本完全吻合，再进行酶切以鉴别杂纯合基因型和感病基因型，该体系可用于在同一PCR反应体系中，对2个抗病基因进行同时筛选鉴定及苗期早期辅助选育。2008年，倪大虎等[34]利用多重PCR技术， 可以在同一PCR反应体系中同时选择Pi9（t）基因和Xa21基因， 与分别的单一PCR检测结果完全一致，提高了PCR的选择效率。2011年，研究者[35]建立了可同时检测抗马铃薯胞囊线虫H1基因，抗马铃薯X病毒RX1基因，抗马铃薯晚疫病R1、R2基因和抗马铃薯Y病毒Rychc基因的多重PCR检测体系，并利用此体系检测含有这5种抗病基因的96株杂交植株时，结果准确、可靠，且用时比单一PCR少得多。2012年，陈涛等[36]利用与抗白粉病基因Pm21和Pm13连锁的特异标记，随机挑选出114株含有抗白粉病基因Pm21和Pm13的杂交F4代群体进行单一PCR和多重PCR检测，其中5株具有Pm21的特异标记，4株具有Pm13的特异标记，还有4个单株同时具有Pm21和Pm13的特异标记，多重PCR与单一PCR检测结果一致。这说明该体系可以应用于对Pm21和Pm13的多重PCR检测，能够更加快速地检测出含有这2个抗病基因的累加体材料。2013年，刘超勤等[37]只利用一次多重PCR反应同时对番茄抗黄化曲叶病毒病的Ty1、Ty2基因，抗根结线虫病Mi基因和抗叶霉病Cf5基因紧密连锁的CAPS标记进行了筛选，经酶切后所获得的特异性片段大小与前人试验所得大小基本相同，证明了四重PCR检测的准确性。
2.5在植物育种上的应用近年来，育种学家们也把多重PCR技术运用到多种植物育种过程中。2003年，研究者[38]运用多重PCR技术分析澳大利亚主要的50个小麦栽培种的高分子量麦谷蛋白亚基，结果显示仅有2个品种的高分子量麦谷蛋白亚基与前人测定的不同，随后也证实了是前人检测有误。该体系中所使用的3个引物对都处于小麦不同的染色体组，这能同时鉴定出所有的高分子量麦谷蛋白亚基。2003年，张树珍等[39]以PchsA为启动子构建了康乃馨ACC氧化酶基因的反义植物表达载体，通过农杆菌介导法把这个载体导入康乃馨优良的栽培品种中，获得3株转基因植株，经多重PCR和PCRSouthern杂交检测，证实康乃馨ACC氧化酶的反义基因已经整合到康乃馨的基因组中，获得了能延长插瓶寿命的康乃馨新品种。2007年，张晓科等[40]利用现有小麦品质性状基因的分子标记，建立了3个多重PCR体系，并用已知性状的品种进行了验证。其中，多重PCR体系Ⅰ可用于一般的小麦品质分子育种，以提高选育材料的整体加工品质水平；体系Ⅱ可用于强筋小麦品种的选育；体系Ⅲ可用于淀粉品质或糯小麦的选育。由于每个体系中的引物之间不存在相互抑制和错配，因此品种检测的结果可靠、重复性好、成本低。将这3个多重PCR检测体系用于小麦品质育种的亲本评价和杂交后代优质基因的聚合，有助于提高优质专用小麦品种评价和选育的效率。2009年，郑寒等[41]基于小麦Ax1/Ax2、Dx5和Bx7OE等优质亚基的特异性分子标记构建相应的多重PCR体系，经过品种和群体检验，利用该体系鉴定这些亚基的结果稳定可靠、成本低。进一步利用该技术对89份西藏小麦育成和推广品种（系）的优质亚基频率进行鉴定，结果显示，该区小麦没有检测到Bx7OE，同时携带2个优质亚基的材料频率约为10%。这说明，多重PCR可作为一种可靠性高、实用性强的标记辅助选择技术用于小麦品质育种亲本评价和杂交聚合优质亚基基因小麦新品种的选育。在其他植物分子育种实践中，多重PCR技术体系的建立和应用研究也相继展开。 3多重PCR技术在植物生物学研究中的应用前景
分子方法研究植物是近20年植物生物学研究的重要发展阶段，而许多分子方法的推进都是基于新的PCR技术的开发和应用。相对单一PCR而言，多重PCR具有极大的优越性：一次PCR反应中能同时检测多个基因型，因而高效、快捷、经济；PCR反应中高度特异敏感，因而保证了扩增结果的准确、可靠；试验操作简单、程序化、耗时少，在一定程度上加速了试验进程。这些优点使得多重PCR在多个方面得到了飞速发展，已经在人类学、动物学、植物学、微生物学、食品学研究等方面得到了广泛应用[42]。
由于多重PCR是在同一体系中进行复合扩增，故其在植物生物学研究的实践中不可避免地存在一定的问题和缺陷，如可能存在多对引物之间的相互抑制、引物与非靶序列的结合产生非特异性扩增，等。因此，在多重PCR的应用中，如何合理设计引物，优化最佳多重PCR体系及反应条件以减少非特异性扩增至关重要。这通常需要基于反应中的主要成分和反应条件进行多次优化后以确定一个成熟的反应体系，再视不同模板和引物来适当调整试验条件[43]。也有一些研究者直接应用与成熟的单一PCR反应完全相同的条件，在遵循引物组合的一般原则下进行多重PCR试验，同样取得了令人满意的结果[44]。这样可以避免为建立多重PCR反应体系需要进行的繁琐优化试验，也相应拓展了多重PCR技术在实际中的应用范畴。
随着多重PCR技术的不断发展应用，其与其他技术的结合也越来越多。如将多重PCR与毛细管电泳技术结合，可以提高基因分裂效率和检测的准确度[45]；将多重PCR与四色荧光技术结合，可以提高检测的灵敏度和缩短检测时间[46]，等。今后，随着现代生物技术的发展，多重PCR技术及与其他技术的结合在植物生物学研究中越来越受到广大植物学家们的青睐，尤其是在DNA遗传分析和基因检测方面具有广阔的应用前景和发展方向。
43卷6期任素贤等多重PCR技术在植物生物学研究中的应用进展参考文献
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