目的:采用在线中心切割超高效二维液相色谱（2D-UPLC）法,建立同时测定复方南星止痛膏中3个双酯型乌头生物碱（新乌头碱、乌头碱和次乌头碱）的含量测定方法。方法:一维UPLC采用Waters XBridgeBEH C₁₈色谱柱（2.1 mm×50 mm 1.7μm）,以甲醇-0.008%二乙胺为流动相,梯度洗脱,流速0.1 mL·min^-1,柱温18℃;二维UPLC采用Waters XBridge BEH C₁₈色谱柱（3.0 mm×100 mm 1.7μm）,以乙腈-0.01%磷酸为流动相,梯度洗脱,流速0.7 mL·min^-1,柱温40℃。进样量1μL,检测波长235 nm。结果:新乌头碱、乌头碱和次乌头碱的线性范围分别为0.66～9.90、0.55～8.20和0.91～13.72μg·mL^-1,R2分别为0.999 5、0.999 9和0.999 6,线性关系良好;3个成分的平均加样回收率在82.5%～88.8%之间,方法的准确度和稳定性均较好;复方南星止痛膏中新乌头碱、乌头碱和次乌头碱含量分别在3.2～5.0、0.9～1.3、8.5～10.4μg·g^-1范围内。结论:该方法有效改善了复方南星止痛膏中待测组分的分离度,极大提高了检测灵敏度,对制剂中的3个双酯型乌头生物碱进行准确定量分析,提高产品的质量控制水平,并为临床用药提供理论支持。