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【摘要】 目的：通过检测胃泌素及丙谷胺干预下胃癌MKN45细胞DNMT-1基因表达与E-Cadherin和MMP-2基因甲基化变化的相关性。方法：胃癌细胞株分别在胃泌素和丙谷胺干预下分为空白组、胃泌素组、丙谷胺组和混合组，应用SYBR Green I Q-PCR检测各组DNMT-1基因表达水平；运用RQ-MSP法检测用亚硫酸氢盐修饰后的基因组DNA为模板的各组基因甲基化状态。结果：胃泌素组与空白组相比，DNMT-1表达明显增高，而丙谷胺组则表达明显减低（P<0.05）；DNMT-1表达量与E-Cadherin甲基化变化存在明显相关性，而与MMP-2甲基化并无明显相关性。结论：胃泌素可促进DNMT-1表达，DNMT-1可能直接影响E-Cadherin甲基化，而其可能间接影响MMP-2表达模式。
【关键词】 胃癌； 胃泌素； 丙谷胺； DNA甲基转移酶-1； 基质金属蛋白酶-2； E-钙粘蛋白； 甲基化
胃肠道是人体最大的内分泌器官，各种内分泌激素可通过细胞膜上相应受体结合而产生影响，激素分泌失调均可导致胃肠道疾病。胃泌素是一种多肽类激素，它的主要生物学作用是刺激壁细胞分泌胃酸。近年来研究证实，外源性胃泌素对胃癌、结肠癌等胃肠道肿瘤细胞生物学行为有影响作用，但胃泌素是否参与了胃癌细胞的侵袭、转移目前还不清楚。本研究旨在观察胃泌素影响DNMT-1基因表达，从而导致MMP-2和E-Cadherin甲基化改变，以此探讨胃泌素在改变胃癌细胞表达模式中的作用。
1 材料与方法
1.1 主要试剂与仪器 MKN45胃癌细胞系由南昌大学第一附属医院消化疾病研究所提供，5肽胃泌素购自上海丽珠东风生物技术公司，丙谷胺（分析纯）购自江苏金坛制药厂，各引物由上海天工生物合成，TIANGEN公司的TRNzol–A+总RNA提取试剂盒，DNA提取试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司，荧光定量试剂盒（Takara Dalian）SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ，DA7600自动实时荧光PCR仪。
1.2 细胞培养及实验分组 MKN45胃癌细胞系培养于DMEM培养液中，加10%小牛血清，置37 ℃、5%CO2恒温培养箱，隔天换液，3 d传代。用含10%小牛血清的DMEM液将胃泌素浓度配为25×2 ?g/mL，丙谷胺浓度为32×2 ?g/mL。实验共分四组：空白对照组、胃泌素组、丙谷胺组和胃泌素加丙谷胺组。取传代后72 h的细胞，用含10%小牛血清的培养液调整细胞浓度为1×105接种于六孔培养皿，每孔1.2 mL，待细胞贴壁后弃去培养液，空白对照组加含10%小牛血清培养液10.0 mL，胃泌素组加胃泌素液5.0 mL，丙谷胺组加丙谷胺液5.0 mL，再各加含10%小牛血清培养液5.0 mL，胃泌素加丙谷胺组两者各加5.0 mL。培养48 h后，取出培养皿，从培养皿移去培养液，用胰蛋白酶消化方法收集细胞。
1.3 SYBR Green Ⅰ Q-PCR
1.3.1 总RNA提取及反转录 收集各组胃癌细胞，采用TIANGEN公司的TRNzol–A+总RNA提取试剂盒操作步骤提取各组细胞总RNA，再用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测总mRNA完整性及有无DNA污染，通过测A260值检测RNA浓度，测A260/A280值检测其纯度。用宝生物工程有限公司PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser试剂盒进行反转录。
1.3.2 Q-PCR扩增
1.3.2.1 PCR 条件的摸索和优化：本研究采用PCR的序列如下（5' to 3'）：DNMT-1上游CCAGGATTACAAGGAAAAGCAC下游TTCAGTTTCTGTTTGGGTGTTG，内参β-actin上游CCACGAAACTACGTTCAACTCC下游GTGATCTCCTTCTGCATCCTGT。反应程序为95 ℃预变性30 s 1次，95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃ 30 s 40个循环。鉴定产物后，摸索PCR反应最适当的扩增条件，包括最适合的模板浓度、引物浓度0.2～1.0 μM及退火温度55～65 ℃，从而减少非特异性条带和引物二聚体的产生，减少测量误差。
1.3.2.2 SYBR Green Ⅰ法进行Q-PCR 荧光染料SYBR Green Ⅰ法进行PCR扩增，每份标本重复5次。反应体系20 μL： SYBR Green Ⅰ 10 μL，0.4 μM的引物上、下游各0.8 mL，模板2.0 μL，ddH2O补足体系。DNMT-1反应条件：95 ℃预变性30 s，然后95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s共40个循环；内参β-actin与目的基因反应体系及反应条件均相同。扩增完成后按仪器默认条件进行溶解曲线分析。用2%琼脂糖凝胶电泳分析，PCR產物长度符合目的基因引物设计长度。通过PCR扩增曲线判定结果是否是阳性，溶解曲线可判断其特异性，系列稀释的cDNA模板标准量观察扩增效率。
1.4 实时定量甲基化特异性PCR（RQ-MSP）
1.4.1 DNA提取、硫化并纯化处理 按照EasyPureTM Genomic DNA Kit说明书进行DNA提取。提取的基因组DNA经2%琼脂糖电泳检测其完整性，经紫外分光光度计检测A260/A280均在1.8～2.0。各组基因组DNA首先经过亚硫酸氢钠化学修饰，DNA修饰后用吸附柱纯化去除游离亚硫酸氢钠后以此作为PCR 反应的模板。
1.4.2 甲基化特异性PCR（methylation-specific PCR， MSP） PCR引物序列见表1，反应体积为20 μL，2×SYBR Premix Ex Taq，DNA模板2μL，上下游引物（10 pmol/μL）各0.8 μL，加水至20 μL。循环扩增条件：E-Cadherin 95 ℃ 60 s，95 ℃ 5 s，64 ℃ 30 s，40个循环；MMP-2 95 ℃ 60 s，95 ℃ 5 s，59 ℃ 30 s，40个循环。 1.5 相对表达量水平的计算
1.5.1 DNMT-1相对量的表达水平 直接用样品各自的内源控制物β-actin表达来标准化加入的初始RNA量，样品中靶基因的相对mRNA表达水平用以下公式计算：相对mRNA表达=2-△ct×100%，其中△ct值=靶基因Ct值-β-actinCt值。可依次分别得到每个标本相对β-actin的模板数。
1.5.2 各干预组及空白对照组甲基化相对定量比较 运用上述建立的MSP方法分析胃泌素和丙谷胺对胃癌细胞中E-Cadherin和MMP-2基因甲基化的影响作用（n=5），采用比较Ct值法计算公式2-△t（△ct值=甲基化Ct值-非甲基化Ct 值）法来半定量，显示各组甲基化相对非甲基化水平改变。
1.6 统计学处理 采用SPSS 13.0统计软件对实验数据进行分析，Q-PCR的计量资料采用（x±s）表示。两样本均数比较，方差齐时采用两独立样本t检验，方差不齐时行秩和检验。相關性分析用Pearson线性相关检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 各组PCR产物的确定和分析 实验中所应用的实时检测系统能分别扩增出各自特异性的产物。
2.1.1 熔解曲线分析结果显示，各基因相应引物都扩增出了特异性的产物，其峰值所对应的温度与预期产物的Tm值一致，未出现其他异常波形，波的形状也较锐利（图1）。各组MMP-2和E-Cadherin基因MSP两对引物都扩增出了特异性的产物（详细结果见本课题相关文章内容）。
2.1.2 琼脂糖凝胶电泳结果显示，各组基因DNMT-1的PCR产物为单一条带，且符合目的基因引物设计长度大小一致（图2）。各组MMP-2和E-Cadherin基因MSP产物琼脂糖凝胶电泳结果，甲基化产物与非甲基化产物均为单一条带且与预期片段大小一致（图3、4）。
2.2 DNMT-1与MMP-2、E-Cadherin甲基化相关性分析
2.2.1 SYBR Green Ⅰ Q-PCR结果 运用上述实时荧光定量PCR方法，分析各处理组与空白组胃癌细胞中DNMT-1基因表达变化（n=5）进行比较，结果显示胃泌素组相对空白组DNMT-1表达量显著增高，丙谷胺组和混合组其表达量显著下降。
2.2.2 DNMT-1与MMP-2、E-Cadherin甲基化相关性分析结果 通过Pearson方法进行相关分析，DNMT-1与MMP-2甲基化无明显相关性，与E-Cadherin甲基化存在明显相关性（P<0.01）。见表2。
3 讨论
胃肠道是人体最大的内分泌器官，激素分泌失调或受体结构和功能异常均可导致胃肠道疾病。近年来研究证实，胃癌在发生和发展过程中有胃泌素的参与，胃泌素能促进致癌物诱导胃癌的发生，并参与胃肠肿瘤增殖与调控。有研究显示，胃癌组患者存在高胃泌素血症，明显高于健康人和胃肠道良性疾病，随着胃癌的进展，胃泌素呈递增趋势[1]。这种变化规律表明，胃泌素可促进胃癌的生长、浸润和转移，对肿瘤生长有促进作用[2]。然而，胃泌素导致胃癌细胞有这种生物行为还不清楚。本研究通过观察胃泌素影响DNMT-1基因表达，改变MMP-2和E-Cadherin基因甲基化状态，从而导致基因表达变化，以此探讨胃泌素在胃癌侵袭和转移中的可能分子机制。
DNA甲基化异常在早期癌及癌组织基因组上是最常见的表观遗传事件，DNA甲基化变化与肿瘤的发生密切相关。DNA 异常甲基化可造成基因高甲基化或低甲基化。DNA高基化可导致基因转录沉默，使重要基因如抑癌基因丧失功能；DNA低甲基化可促使部分癌基因出现过表达，以致正常细胞的生长分化调控失常以及损伤后DNA不能被及时修复而引起肿瘤的发生。研究发现的具有肿瘤特异性甲基化的DNA 修复基因O6-甲基鸟嘌呤DNA 甲基转移酶（methylguanine DNA methy ltransferase， MGMT）启动子区或第一外显子内的CpG岛甲基化与其转录失活有关，这种变化可使染色质进入关闭状态，导致核小体定位异常[3]。DNA的甲基化由DNA甲基转移酶（DNA methyltransferase， DNMT）催化完成，可导致肿瘤组织DNA甲基化紊乱[4-5]。DNA甲基化转移酶1（DNMT1）是DNA甲基化转移酶家族的成员之一，是DNA甲基化发生的关键酶，对编码基因甲基化状态的维持有重要作用。DNMT1优先以半甲基化的DNA 作为甲基化底物， 其靶点为复制叉，如果模板DNA链相应的序列被甲基化，则Dnmt1在新合成的DNA 链中引入甲基基团，由此维持甲基化模式。多种肿瘤相关基因甲基化是胃癌中的频发事件，可能是胃癌发生的直接或决定性的作用，胃癌中诸多基因CpG 岛甲基化导致的表遗传学改变，导致抑癌基因在胃癌中低表达可能与该基因甲基化有关。
本实验运用荧光定量PCR技术检测在胃泌素干预下的胃癌细胞Dnmt1基因mRNA表达变化。数据表明胃泌素可以显著提高Dnmt1基因表达水平，而其受体拮抗剂可显著抑制Dnmt1表达，Dnmt1与E-Cadherin甲基化存在明显相关性，而与MMP-2甲基化没有关系。现很多研究表明，胃癌组织高表达MMP-2，同时胃泌素可上调MMP-2基因表达水平，过表达的MMP-2导致细胞周围外基质降解等，可能一定程度可促进癌细胞侵袭转移。MMPs是一类高度保守的依赖于锌离子的内切蛋白水解酶家族，可降解基底膜和细胞外基质的大多数蛋白质[6]，并对细胞运动和管腔形成起重要作用，MMP还可提高促血管生成因子如VEGF、bFGF、TGF-B及TGF的作用[7]，还可调节肿瘤细胞生长。MMP-2基质金属蛋白酶（MMP）家族的重要成员之一，主要降解明胶及Ⅳ型胶原。近来研究表明MMP-2异常高表达，与多种肿瘤的侵袭和转移有关。然而本研究数据表明，DNMT-1不与MMP-2甲基化存在直接关系，可以判定DNMT-1不能直接影响MMP-2基因的表达，存在其他控制通路。上皮钙黏蛋白（E-cadherin）作为最重要的粘附分子，是一种肿瘤细胞侵袭转移抑制剂，其生理功能主要是介导上皮细胞粘附、维持组织结构完整性，并维持细胞极性和参与分化。E-cadherin失活与多种肿瘤的浸润和转移有关。其失活机制主要有基因突变、杂合性缺失、甲基化等。本实验结果表明，胃泌素可能通过DNMT-1促进E-cadherin甲基化，从而导致该基因表达降低。 结果说明胃泌素可影响甲基化相关基因表达，它已成为经典的造成基因表达紊乱的“第二次打击模式”。启动区基因甲基化变化作为第二次打击事件，而使其功能发生变化。Ajani等[8]用胃泌素免疫抗原特异性的抗胃泌素抗体，从而抑制了肿瘤细胞的增殖和浸润，表明胃泌素参与了胃癌的发生和发展。随着肿瘤生长调节机制研究的不断深入，人们可望通过操纵激素的方法选择胃泌素依赖性胃癌进行内分泌治疗。高效专一的胃泌素受体拮抗剂的问世必将为胃癌患者提供一条特异性的非细胞毒性的内分泌辅助疗法，从而为胃癌内分泌治疗开辟新的途径。
浸润和转移是肿瘤细胞的生物特性，而这是受外在信号及内在的基因调控产物与细胞外基质（ECM）各种成分相互作用的结果。胃泌素的外在信號可以促进DNMT-1表达，这可导致细胞甲基化信号通路紊乱，从而可能间接调控MMP-2的表达，直接促进E-Cadherin基因表达沉默，导致细胞基因甲基化紊乱，促进了肿瘤的侵袭和转移。
参考文献
[1]马俊萍，曹润林.195例消化道疾病患者胃泌素水平测定的临床分析[J].山西职工医学院学报，2011，21（1）：24-25.
[2] Miyaji M， Ogoshi K， Tajima T， et al. Association between serum gastrin levels， gastric acid secretion and age in early gastric cancer[J]. Tumour Biol，1997，18（5）：311-320.
[3] Jung T Y， Jung S， Moon K S， et al. Changes of the O6-methylguanine-DNA methy ltransferase promoter methylation and MGMT protein expression after adjuvant treatment in gliob lastoma[J]. Oncol Rep，2010，23（5）：1269-1276.
[4] Fang J Y， Lu R， Mikovits J A， et al. Regulation of hMSH2 and hMLH1 expression in the human colon cancer cell line SW1116 by DNA methyltransferase 1[J]. Cancer Lett，2006，233（1）：124-130.
[5] Peng D F， Kanai Y， Sawada M， et al. Increased DNA methyltransferase 1 （DNMT1） protein expression in precancerous conditions and ductal carcinomas of the pancreas[J]. Cancer Sci，2005，96（7）：403-408.
[6] Chambers A F， Matrisian L M. Changing views of the role of matrix metalloproteinases in metastasis[J]. J Natl Cancer Inst，1997，89（17）：1260-1270.
[7] Zheng H， Takahashi H， Mural Y， et al. Expressions of MMP-2， MMP-9 and VEGF are closely linked to growth， invasion， metastasis and angiogenesis of gastric carcinoma[J]. Anticancer Res，2006，26（5A）：3579-3583.
[8] Ajani J A， Hecht J R， Ho L， et al. An open-label， multinational， multicenter study of G17DT vaccination combined with cisplatin and 5-fluorouracil in patients with untreated， advanced gastric or gastroesophageal cancer： the GC4 study[J]. Cancer，2006，106（9）：1908-1916.
（收稿日期：2013-10-19） （本文编辑：王宇）
【关键词】 胃癌； 胃泌素； 丙谷胺； DNA甲基转移酶-1； 基质金属蛋白酶-2； E-钙粘蛋白； 甲基化
胃肠道是人体最大的内分泌器官，各种内分泌激素可通过细胞膜上相应受体结合而产生影响，激素分泌失调均可导致胃肠道疾病。胃泌素是一种多肽类激素，它的主要生物学作用是刺激壁细胞分泌胃酸。近年来研究证实，外源性胃泌素对胃癌、结肠癌等胃肠道肿瘤细胞生物学行为有影响作用，但胃泌素是否参与了胃癌细胞的侵袭、转移目前还不清楚。本研究旨在观察胃泌素影响DNMT-1基因表达，从而导致MMP-2和E-Cadherin甲基化改变，以此探讨胃泌素在改变胃癌细胞表达模式中的作用。
1 材料与方法
1.1 主要试剂与仪器 MKN45胃癌细胞系由南昌大学第一附属医院消化疾病研究所提供，5肽胃泌素购自上海丽珠东风生物技术公司，丙谷胺（分析纯）购自江苏金坛制药厂，各引物由上海天工生物合成，TIANGEN公司的TRNzol–A+总RNA提取试剂盒，DNA提取试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司，荧光定量试剂盒（Takara Dalian）SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ，DA7600自动实时荧光PCR仪。
1.2 细胞培养及实验分组 MKN45胃癌细胞系培养于DMEM培养液中，加10%小牛血清，置37 ℃、5%CO2恒温培养箱，隔天换液，3 d传代。用含10%小牛血清的DMEM液将胃泌素浓度配为25×2 ?g/mL，丙谷胺浓度为32×2 ?g/mL。实验共分四组：空白对照组、胃泌素组、丙谷胺组和胃泌素加丙谷胺组。取传代后72 h的细胞，用含10%小牛血清的培养液调整细胞浓度为1×105接种于六孔培养皿，每孔1.2 mL，待细胞贴壁后弃去培养液，空白对照组加含10%小牛血清培养液10.0 mL，胃泌素组加胃泌素液5.0 mL，丙谷胺组加丙谷胺液5.0 mL，再各加含10%小牛血清培养液5.0 mL，胃泌素加丙谷胺组两者各加5.0 mL。培养48 h后，取出培养皿，从培养皿移去培养液，用胰蛋白酶消化方法收集细胞。
1.3 SYBR Green Ⅰ Q-PCR
1.3.1 总RNA提取及反转录 收集各组胃癌细胞，采用TIANGEN公司的TRNzol–A+总RNA提取试剂盒操作步骤提取各组细胞总RNA，再用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测总mRNA完整性及有无DNA污染，通过测A260值检测RNA浓度，测A260/A280值检测其纯度。用宝生物工程有限公司PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser试剂盒进行反转录。
1.3.2 Q-PCR扩增
1.3.2.1 PCR 条件的摸索和优化：本研究采用PCR的序列如下（5' to 3'）：DNMT-1上游CCAGGATTACAAGGAAAAGCAC下游TTCAGTTTCTGTTTGGGTGTTG，内参β-actin上游CCACGAAACTACGTTCAACTCC下游GTGATCTCCTTCTGCATCCTGT。反应程序为95 ℃预变性30 s 1次，95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃ 30 s 40个循环。鉴定产物后，摸索PCR反应最适当的扩增条件，包括最适合的模板浓度、引物浓度0.2～1.0 μM及退火温度55～65 ℃，从而减少非特异性条带和引物二聚体的产生，减少测量误差。
1.3.2.2 SYBR Green Ⅰ法进行Q-PCR 荧光染料SYBR Green Ⅰ法进行PCR扩增，每份标本重复5次。反应体系20 μL： SYBR Green Ⅰ 10 μL，0.4 μM的引物上、下游各0.8 mL，模板2.0 μL，ddH2O补足体系。DNMT-1反应条件：95 ℃预变性30 s，然后95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s共40个循环；内参β-actin与目的基因反应体系及反应条件均相同。扩增完成后按仪器默认条件进行溶解曲线分析。用2%琼脂糖凝胶电泳分析，PCR產物长度符合目的基因引物设计长度。通过PCR扩增曲线判定结果是否是阳性，溶解曲线可判断其特异性，系列稀释的cDNA模板标准量观察扩增效率。
1.4 实时定量甲基化特异性PCR（RQ-MSP）
1.4.1 DNA提取、硫化并纯化处理 按照EasyPureTM Genomic DNA Kit说明书进行DNA提取。提取的基因组DNA经2%琼脂糖电泳检测其完整性，经紫外分光光度计检测A260/A280均在1.8～2.0。各组基因组DNA首先经过亚硫酸氢钠化学修饰，DNA修饰后用吸附柱纯化去除游离亚硫酸氢钠后以此作为PCR 反应的模板。
1.4.2 甲基化特异性PCR（methylation-specific PCR， MSP） PCR引物序列见表1，反应体积为20 μL，2×SYBR Premix Ex Taq，DNA模板2μL，上下游引物（10 pmol/μL）各0.8 μL，加水至20 μL。循环扩增条件：E-Cadherin 95 ℃ 60 s，95 ℃ 5 s，64 ℃ 30 s，40个循环；MMP-2 95 ℃ 60 s，95 ℃ 5 s，59 ℃ 30 s，40个循环。 1.5 相对表达量水平的计算
1.5.1 DNMT-1相对量的表达水平 直接用样品各自的内源控制物β-actin表达来标准化加入的初始RNA量，样品中靶基因的相对mRNA表达水平用以下公式计算：相对mRNA表达=2-△ct×100%，其中△ct值=靶基因Ct值-β-actinCt值。可依次分别得到每个标本相对β-actin的模板数。
1.5.2 各干预组及空白对照组甲基化相对定量比较 运用上述建立的MSP方法分析胃泌素和丙谷胺对胃癌细胞中E-Cadherin和MMP-2基因甲基化的影响作用（n=5），采用比较Ct值法计算公式2-△t（△ct值=甲基化Ct值-非甲基化Ct 值）法来半定量，显示各组甲基化相对非甲基化水平改变。
1.6 统计学处理 采用SPSS 13.0统计软件对实验数据进行分析，Q-PCR的计量资料采用（x±s）表示。两样本均数比较，方差齐时采用两独立样本t检验，方差不齐时行秩和检验。相關性分析用Pearson线性相关检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 各组PCR产物的确定和分析 实验中所应用的实时检测系统能分别扩增出各自特异性的产物。
2.1.1 熔解曲线分析结果显示，各基因相应引物都扩增出了特异性的产物，其峰值所对应的温度与预期产物的Tm值一致，未出现其他异常波形，波的形状也较锐利（图1）。各组MMP-2和E-Cadherin基因MSP两对引物都扩增出了特异性的产物（详细结果见本课题相关文章内容）。
2.1.2 琼脂糖凝胶电泳结果显示，各组基因DNMT-1的PCR产物为单一条带，且符合目的基因引物设计长度大小一致（图2）。各组MMP-2和E-Cadherin基因MSP产物琼脂糖凝胶电泳结果，甲基化产物与非甲基化产物均为单一条带且与预期片段大小一致（图3、4）。
2.2 DNMT-1与MMP-2、E-Cadherin甲基化相关性分析
2.2.1 SYBR Green Ⅰ Q-PCR结果 运用上述实时荧光定量PCR方法，分析各处理组与空白组胃癌细胞中DNMT-1基因表达变化（n=5）进行比较，结果显示胃泌素组相对空白组DNMT-1表达量显著增高，丙谷胺组和混合组其表达量显著下降。
2.2.2 DNMT-1与MMP-2、E-Cadherin甲基化相关性分析结果 通过Pearson方法进行相关分析，DNMT-1与MMP-2甲基化无明显相关性，与E-Cadherin甲基化存在明显相关性（P<0.01）。见表2。
3 讨论
胃肠道是人体最大的内分泌器官，激素分泌失调或受体结构和功能异常均可导致胃肠道疾病。近年来研究证实，胃癌在发生和发展过程中有胃泌素的参与，胃泌素能促进致癌物诱导胃癌的发生，并参与胃肠肿瘤增殖与调控。有研究显示，胃癌组患者存在高胃泌素血症，明显高于健康人和胃肠道良性疾病，随着胃癌的进展，胃泌素呈递增趋势[1]。这种变化规律表明，胃泌素可促进胃癌的生长、浸润和转移，对肿瘤生长有促进作用[2]。然而，胃泌素导致胃癌细胞有这种生物行为还不清楚。本研究通过观察胃泌素影响DNMT-1基因表达，改变MMP-2和E-Cadherin基因甲基化状态，从而导致基因表达变化，以此探讨胃泌素在胃癌侵袭和转移中的可能分子机制。
DNA甲基化异常在早期癌及癌组织基因组上是最常见的表观遗传事件，DNA甲基化变化与肿瘤的发生密切相关。DNA 异常甲基化可造成基因高甲基化或低甲基化。DNA高基化可导致基因转录沉默，使重要基因如抑癌基因丧失功能；DNA低甲基化可促使部分癌基因出现过表达，以致正常细胞的生长分化调控失常以及损伤后DNA不能被及时修复而引起肿瘤的发生。研究发现的具有肿瘤特异性甲基化的DNA 修复基因O6-甲基鸟嘌呤DNA 甲基转移酶（methylguanine DNA methy ltransferase， MGMT）启动子区或第一外显子内的CpG岛甲基化与其转录失活有关，这种变化可使染色质进入关闭状态，导致核小体定位异常[3]。DNA的甲基化由DNA甲基转移酶（DNA methyltransferase， DNMT）催化完成，可导致肿瘤组织DNA甲基化紊乱[4-5]。DNA甲基化转移酶1（DNMT1）是DNA甲基化转移酶家族的成员之一，是DNA甲基化发生的关键酶，对编码基因甲基化状态的维持有重要作用。DNMT1优先以半甲基化的DNA 作为甲基化底物， 其靶点为复制叉，如果模板DNA链相应的序列被甲基化，则Dnmt1在新合成的DNA 链中引入甲基基团，由此维持甲基化模式。多种肿瘤相关基因甲基化是胃癌中的频发事件，可能是胃癌发生的直接或决定性的作用，胃癌中诸多基因CpG 岛甲基化导致的表遗传学改变，导致抑癌基因在胃癌中低表达可能与该基因甲基化有关。
本实验运用荧光定量PCR技术检测在胃泌素干预下的胃癌细胞Dnmt1基因mRNA表达变化。数据表明胃泌素可以显著提高Dnmt1基因表达水平，而其受体拮抗剂可显著抑制Dnmt1表达，Dnmt1与E-Cadherin甲基化存在明显相关性，而与MMP-2甲基化没有关系。现很多研究表明，胃癌组织高表达MMP-2，同时胃泌素可上调MMP-2基因表达水平，过表达的MMP-2导致细胞周围外基质降解等，可能一定程度可促进癌细胞侵袭转移。MMPs是一类高度保守的依赖于锌离子的内切蛋白水解酶家族，可降解基底膜和细胞外基质的大多数蛋白质[6]，并对细胞运动和管腔形成起重要作用，MMP还可提高促血管生成因子如VEGF、bFGF、TGF-B及TGF的作用[7]，还可调节肿瘤细胞生长。MMP-2基质金属蛋白酶（MMP）家族的重要成员之一，主要降解明胶及Ⅳ型胶原。近来研究表明MMP-2异常高表达，与多种肿瘤的侵袭和转移有关。然而本研究数据表明，DNMT-1不与MMP-2甲基化存在直接关系，可以判定DNMT-1不能直接影响MMP-2基因的表达，存在其他控制通路。上皮钙黏蛋白（E-cadherin）作为最重要的粘附分子，是一种肿瘤细胞侵袭转移抑制剂，其生理功能主要是介导上皮细胞粘附、维持组织结构完整性，并维持细胞极性和参与分化。E-cadherin失活与多种肿瘤的浸润和转移有关。其失活机制主要有基因突变、杂合性缺失、甲基化等。本实验结果表明，胃泌素可能通过DNMT-1促进E-cadherin甲基化，从而导致该基因表达降低。 结果说明胃泌素可影响甲基化相关基因表达，它已成为经典的造成基因表达紊乱的“第二次打击模式”。启动区基因甲基化变化作为第二次打击事件，而使其功能发生变化。Ajani等[8]用胃泌素免疫抗原特异性的抗胃泌素抗体，从而抑制了肿瘤细胞的增殖和浸润，表明胃泌素参与了胃癌的发生和发展。随着肿瘤生长调节机制研究的不断深入，人们可望通过操纵激素的方法选择胃泌素依赖性胃癌进行内分泌治疗。高效专一的胃泌素受体拮抗剂的问世必将为胃癌患者提供一条特异性的非细胞毒性的内分泌辅助疗法，从而为胃癌内分泌治疗开辟新的途径。
浸润和转移是肿瘤细胞的生物特性，而这是受外在信号及内在的基因调控产物与细胞外基质（ECM）各种成分相互作用的结果。胃泌素的外在信號可以促进DNMT-1表达，这可导致细胞甲基化信号通路紊乱，从而可能间接调控MMP-2的表达，直接促进E-Cadherin基因表达沉默，导致细胞基因甲基化紊乱，促进了肿瘤的侵袭和转移。
参考文献
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（收稿日期：2013-10-19） （本文编辑：王宇）