【摘 要】
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目的通过构建bcl-6基因野生型、突变体3’UTR区及其编码序列(CDS),观察miR-127对bcl-6的直接靶向调控作用及bcl-6表达载体回复miR-127抑制细胞周期和细胞生长的功能。方法利
【机 构】
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解放军总医院内分泌科,北京军区第264医院内分泌科,解放军309医院肿瘤科,解放军总医院肿瘤科,解放军61213部队
【基金项目】
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中国人民解放军第三〇九医院课题(2015MS-010)
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目的通过构建bcl-6基因野生型、突变体3’UTR区及其编码序列(CDS),观察miR-127对bcl-6的直接靶向调控作用及bcl-6表达载体回复miR-127抑制细胞周期和细胞生长的功能。方法利用PCR方法扩增bcl-6基因3’UTR区序列及其CDS,分别构建在pc DNA3.0-Luc和pc DNA3.0-Flag载体上,在bcl-6基因3’UTR质粒基础上应用重组PCR方法构建miR-127结合位点突变的突变体报告基因质粒,应用荧光素酶报告基因系统检测miR-127对bcl-6的直接靶向调控作用,在肝癌细胞Hep G2中检测过表达及敲低miR-127引起bcl-6基因表达抑制后细胞周期和细胞生长的改变,同时应用表达载体回复bcl-6蛋白水平,检测bcl-6在miR-127调控细胞周期和细胞生长中的必要性。结果构建的重组质粒经酶切鉴定和测序证实构建正确,bcl-6 3’UTR野生型和突变体报告质粒与miR-127共转293T细胞和Hep G2细胞后荧光素酶报告基因检测显示miR-127明显降低野生型报告质粒的活性,但对突变体活性没有影响,miR-127可引起Hep G2细胞G2/M期阻滞并抑制细胞生长,bcl-6可以逆转miR-127对细胞周期和细胞生长的影响。结论成功构建bcl-6基因3’UTR区野生型、突变体报告质粒和bcl-6基因的表达载体,荧光素酶报告基因和回复实验证实均具有生物学功能。
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