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摘要：采用制备的邻苯二甲酸二丁酯多克隆抗体建立可检测环境水体中痕量邻苯二甲酸二丁酯（DBP）的间接竞争酶联免疫（ELISA）分析方法，对各种参数进行优化后，在最優条件下本方法具有较高的灵敏度（检测限为 66.6 ng/mL）、较宽的检测范围（70～1 600 ng/mL）、较好的准确度（回收率82.8%～104.0%）。利用此高通量分析方法对镇江部分河流中水样、底泥进行分析，结果发现镇江市区几处河流，DBP普遍检出，水样中DBP浓度为76.5～140.4 ng/mL，底泥中DBP浓度可达114.6～248.7 ng/g。
关键词：邻苯二甲酸二丁酯；酶联免疫；抗体；水体；镇江
中图分类号：X824文献标志码：A
文章编号：1002-1302（2017）05-0289-03
邻苯二甲酸酯类物质（phthalateesters，PAEs）是一类大量应用于塑料及一次性塑料消费品（食品包装材料、容器、医疗用品）的增塑剂，还可以作为原料用于香味剂、化妆品和冷凝剂，这类化合物的使用，造成了全球性的污染[1]。其中，邻苯二甲酸二丁酯（dibutyl phthalate，DBP）在被检出的PAEs样品中分布最为广泛[2]，Fatoki等对南非East London港中DBP浓度进行了分析，其含量可达2.8～121.9 ng/mL[3]；Adeniyi等报道称尼日利亚的河水中DBP的含量为202.5～270.5 ng/mL[4]；陆继龙等对第二松花江中下游中DBP浓度进行了测定，其平均浓度高达717.24 ng/mL[5]。同时，研究表明，DBP具有明显的生殖毒性：可以引起染色体丢失或断裂等畸变，阻碍正常精子的生成[6]；可导致雄性兔与大鼠生殖道畸形，睾丸萎缩，从而造成其生殖系统损伤[7]。因此，建立简单、快速高通量的分析方法，对水体中此类污染物进行分析极其必要。DBP分子的化学结构如图1所示。
目前报道的有关分析DBP的方法主要有气相色谱-质谱法[8]、液相色谱法[9]、LC-MS/MS[10-11]等仪器方法，然而，由于这类方法存在测试成本高、分析时间长、检测所需样品量大（通常大于500 mL）及前处理步骤繁琐等不足，无法在较大范围内系统、全面、快速分析环境水体中DBP的含量。与此相比，酶联免疫法（ELISA）具有灵敏度高、特异性强、操作简便、检测成本低、适合高通量分析的优势。因此，本研究利用自主制备的DBP多克隆抗体，建立了高灵敏的ELISA方法，优化了影响方法灵敏度与准确度的各种因素，并以此方法对镇江地区部分小型浅水河流中DBP的污染状况进行了调查。
1材料和方法
1.1材料和试剂
DBP抗原抗体，由江苏大学环境科学团队制备；邻苯二甲酸二丁酯标准品、乙酸乙酯、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG、四甲基联胺，均购自美国Sigma公司；Tween-20、十二水合磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）、二水磷酸二氢钠（NaH2PO4·2H2O）、磷酸二氢钾（KH2PO4）、氯化钠（NaCl）、氯化钾（KCl）、碳酸钠（Na2CO3）、碳酸氢钠（NaHCO3）、浓硫酸（H2SO4）等，均购自国药集团化学试剂有限公司，且均为分析纯；酶标板，购自丹麦NUNC公司。
碳酸盐包被缓冲液CB：0.05 mol/L、pH值为9.6；封闭液：含1%明胶的CB液；洗涤液PBST：0.01 mol/L、pH值为7.4、含体积分数0.05% Tween-20的PBS液；抗体稀释液：0.01 mol/L、pH值为7.4、0.01% Tween-20、0.1%明胶的PBS液；显色液：10 mg邻苯二胺、25 mL柠檬酸钠缓冲液、5 μL 30%过氧化氢，用时混合；终止液：2 mol/L H2SO4。
1.2仪器设备
电子分析天平，购自重庆CoiC公司；恒溫培养箱，上海精密科学仪器有限公司；酶标仪，购自美国Thermo公司。
1.3间接竞争酶联免疫分析方法（ic-ELISA）的建立
采用方阵滴定法，确定抗原最佳包被浓度、抗体最佳包被浓度，为达到最佳检测条件，对孵育条件、封闭时间、一抗竞争时间、二抗稀释倍数、pH值、离子强度等影响因素进行优化。
具体ic-ELISA操作步骤为：（1）包被：用包被液将稀释的包被原加至酶标板，100 μL/孔，4 ℃过夜孵育；（2）洗涤：倾去孔内液体，用洗涤液洗3遍，200 μL/孔，在吸水纸上拍干；（3）封闭：加入150 μL/孔封闭液，37 ℃孵育1 h；（4）洗涤：倾去孔内液体，用200 μL洗涤液洗1遍，在吸水纸上拍干；（5）加样：每孔加入50 μL不同浓度的标准品和适当稀释的待检血清，37 ℃孵育30 min；（6）洗涤：倾去孔内液体，用洗液洗3遍，200 μL/孔，在吸水纸上拍干；（7）加酶辣根过氧化物酶标记的二抗：加入 100 μL/孔 HRP-羊抗兔IgG，37 ℃孵育 30 min；（8）洗涤：倾去孔内液体，用洗液洗5遍，200 μL/孔，在吸水纸上拍干；（9）显色：加入新鲜配制的TMB底物溶液，100 μL/孔，避光显色10 min；（10）终止：加入终止液，50 μL/孔；（11）测定：用酶标仪读取各孔D450 nm值。
1.4建立标准曲线及数据分析
根据以上优化的结果，按照“1.3”节中的方法建立DBP的标准曲线。以零标准品D450 nm值为B0值，相应浓度标准品抑制时的D450 nm值为B值。以标准品浓度的对数为横坐标，以B/B0为纵坐标，绘制标准曲线。测定10份空白样，取测定平均值减3倍标准偏差，标准曲线上其对应的浓度值即为检测限（limit of detection，LOD）。
1.5交叉反应率的测定
选择与邻苯二甲酸二丁酯具有类似结构和类似功能的邻苯二甲酸二乙酯（diethyl phthalate，DEP）、邻苯二甲酸丁苄酯（benzyl butyl phthalate，BBP）、邻苯二甲酸单乙酯（monoethyl phthalate，MEP）、邻苯二甲酸单丁酯（monobutyl phthalate，MBP）、邻苯二甲酸单乙基己基酯（monoethylhexyl phthalate，MEHP）、邻苯二甲酸二正辛酯（di-n-octyl phthalate，DnOP）、邻苯二甲酸二异辛酯[di（2-ethylhexyl）phthalate，DiOP]，测定得到各药物的IC50值（抑制中点即抑制率为50%时对应的浓度），按公式（1）计算交叉反应率。 [JZ（]交叉反应率=DBP的 IC50值/相似结构物的IC50值×100%。
1.6样品前处理及添加回收率的测定
各取2 mL（或2 mg泥土，自然阴干）的样品，加入4 mL正己烷，振荡摇匀后使用高速离心机6 000 r/min离心 10 min，取上清，并用氮吹仪吹干。最终样品用2 mL磷酸盐缓冲液（PBS）复溶。
取空白样本，添加一定体积的DBP标准液，每个水平设3个平行。将混合物在漩涡混合器上涡动1 min，然后静置 15 min。按建立的间接竞争ELISA方法测定，检测时每份样品做3个平行重复孔。将各样品测得的D450 nm值代入标准曲线，计算出样品中的药物浓度，并根据公式（2）计算回收率。
[JZ（]回收率=实测值/添加值×100%。
2结果与分析
2.1间接竞争ELISA方法的建立与优化
为达到最佳的检测效果，本研究对影响方法的各种参数进行了优化，包括抗原稀释度、抗体稀释度、孵育条件、封闭时间、一抗竞争时间、HRP稀释度、pH值、离子强度。在最优条件下（部分數据如表1所示），分别为：抗原稀释度1 ∶[KG-*3]5 000、抗体稀释度1 ∶[KG-*3]30 000、孵育条件4 ℃过夜、封闭时间1.5 h、一抗竞争时间30 min、HRP稀释度1 ∶[KG-*3]2 000、pH值7.0、离子强度0.15 mol/L，以DBP浓度的LOG值为横坐标，抑制百分比（B/B0）为纵坐标绘制标准曲线（图2），其抑制程度与DBP的浓度具有明显的线性关系（70～1 600 ng/mL），IC50值为421 ng/mL，检测限可达66.6 ng/mL。
2.2交叉反应率测定
在最佳反应条件下，测定7种DBP的类似结构物，其中对BBP的交叉反应率为22.5%，对DEP的交叉反应率为 1.08%，其余5种均小于0.01%，从而可推断该检测体系所用的DBP抗体具有较强的特异性。根据免疫学的基本原理[12]：抗体倾向于识别距离偶联段最远的基团（主导的抗原决定簇）。对于所测定的7种PAEs，只有BBP在距离偶联段最远处，和DBP有相似的正丁基官能团，而其他PAEs均无。
2.3样本添加回收试验
[JP2]DBP在样品中的添加回收率、变异系数如表2所示。结果表明，其添加回收率均值在82.8%～104.0%之间，变异系数均小于20%，显示该方法的准确度和精确度均符合检测要求。
2.4镇江市内小型浅水河流水体和底泥的检测
表3为镇江市部分小型浅水河流中DBP在水体、底泥中的含量。由表3可知，DBP作为一种常见增塑剂在环境水体中普遍存在。4条河流中，除玉带河未检测到（玉带河离市区较远，且河道定期清淤，故水质较好），其余3条河流水体中DBP的含量介于76.5～140.4 ng/mL之间，显著高于台湾河（1.0～13.5 ng/mL）[13]、意大利淡水（ND～0.028 ng/mL）[14]和加拿大False Creek港（9.32～63.9 ng/mL）[15]中DBP的含量，而且超过《地表水环境质量标准》（GB 3838—2002）中DBP的标准限值（3 ng/mL）[16]。显然，DBP在3条市区河流中污染严重，这可能与河流周边附近工业废水的排放、固体废弃物的堆放和雨水淋洗以及PVC塑料的缓慢释放有关；另外下游的DBP含量明显高于中游，可推断出随河流沿程增加，带入水体中的污染物呈增加趋势，导致DBP含量也随之升高。
3結论
本研究建立了环境水体中DBP间接竞争ELISA分析方法。通过条件优化，本方法的IC50值可达421 ng/mL，线性范围为70～1 600 ng/mL，检测限为66.6 ng/mL。同时，本方法具有较高的准确度与精确度（回收率为82.8%～104.0%，变异系数为3.25%～10.20%）。利用此方法对镇江市部分小型浅水河流进行检测分析，结果表明市区内水体中DBP污染较为严重。本研究为DBP在镇江区域的污染状况调查、风险评估提供了一定的技术支持。
参考文献：
[1]Fromme H，Küchler T，Otto T，et al. Occurrence of phthalates and bisphenol A and F in the environment[J]. Water Research，2002，36（6）：1429-1438.
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[3]Fatoki O S，Noma A. Solid phase extraction method for selectivedetermination of phthalate esters in the aquatic environme[J]. Water Air and Soil Pollution，2002，140（1/2/3/4）：85-98.
[4]Adeniyi A A，Okedeyi O O，Yusuf K A. Flame ionization gas chromatographic determination of phthalate esters in water，surface sediments and fish species in the Ogun river catchments，Ketu，Lagos，Nigeria[J]. Environmental Monitoring and Assessment，2011，172（1/2/3/4）：561-569. [5]陆继龙，郝立波，王春振，等. 第二松花江中下游水体邻苯二甲酸酯分布特征[J]. 环境科学与技术，2007，30（12）：35-37.
[6]蔡智鸣，杨科峰，厉曙光，等. DBP、DOP对小鼠的联合遗传毒性[J]. 环境与职业医学，2002，19（3）：197-198.
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[FQ）]
关键词：邻苯二甲酸二丁酯；酶联免疫；抗体；水体；镇江
中图分类号：X824文献标志码：A
文章编号：1002-1302（2017）05-0289-03
邻苯二甲酸酯类物质（phthalateesters，PAEs）是一类大量应用于塑料及一次性塑料消费品（食品包装材料、容器、医疗用品）的增塑剂，还可以作为原料用于香味剂、化妆品和冷凝剂，这类化合物的使用，造成了全球性的污染[1]。其中，邻苯二甲酸二丁酯（dibutyl phthalate，DBP）在被检出的PAEs样品中分布最为广泛[2]，Fatoki等对南非East London港中DBP浓度进行了分析，其含量可达2.8～121.9 ng/mL[3]；Adeniyi等报道称尼日利亚的河水中DBP的含量为202.5～270.5 ng/mL[4]；陆继龙等对第二松花江中下游中DBP浓度进行了测定，其平均浓度高达717.24 ng/mL[5]。同时，研究表明，DBP具有明显的生殖毒性：可以引起染色体丢失或断裂等畸变，阻碍正常精子的生成[6]；可导致雄性兔与大鼠生殖道畸形，睾丸萎缩，从而造成其生殖系统损伤[7]。因此，建立简单、快速高通量的分析方法，对水体中此类污染物进行分析极其必要。DBP分子的化学结构如图1所示。
目前报道的有关分析DBP的方法主要有气相色谱-质谱法[8]、液相色谱法[9]、LC-MS/MS[10-11]等仪器方法，然而，由于这类方法存在测试成本高、分析时间长、检测所需样品量大（通常大于500 mL）及前处理步骤繁琐等不足，无法在较大范围内系统、全面、快速分析环境水体中DBP的含量。与此相比，酶联免疫法（ELISA）具有灵敏度高、特异性强、操作简便、检测成本低、适合高通量分析的优势。因此，本研究利用自主制备的DBP多克隆抗体，建立了高灵敏的ELISA方法，优化了影响方法灵敏度与准确度的各种因素，并以此方法对镇江地区部分小型浅水河流中DBP的污染状况进行了调查。
1材料和方法
1.1材料和试剂
DBP抗原抗体，由江苏大学环境科学团队制备；邻苯二甲酸二丁酯标准品、乙酸乙酯、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG、四甲基联胺，均购自美国Sigma公司；Tween-20、十二水合磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）、二水磷酸二氢钠（NaH2PO4·2H2O）、磷酸二氢钾（KH2PO4）、氯化钠（NaCl）、氯化钾（KCl）、碳酸钠（Na2CO3）、碳酸氢钠（NaHCO3）、浓硫酸（H2SO4）等，均购自国药集团化学试剂有限公司，且均为分析纯；酶标板，购自丹麦NUNC公司。
碳酸盐包被缓冲液CB：0.05 mol/L、pH值为9.6；封闭液：含1%明胶的CB液；洗涤液PBST：0.01 mol/L、pH值为7.4、含体积分数0.05% Tween-20的PBS液；抗体稀释液：0.01 mol/L、pH值为7.4、0.01% Tween-20、0.1%明胶的PBS液；显色液：10 mg邻苯二胺、25 mL柠檬酸钠缓冲液、5 μL 30%过氧化氢，用时混合；终止液：2 mol/L H2SO4。
1.2仪器设备
电子分析天平，购自重庆CoiC公司；恒溫培养箱，上海精密科学仪器有限公司；酶标仪，购自美国Thermo公司。
1.3间接竞争酶联免疫分析方法（ic-ELISA）的建立
采用方阵滴定法，确定抗原最佳包被浓度、抗体最佳包被浓度，为达到最佳检测条件，对孵育条件、封闭时间、一抗竞争时间、二抗稀释倍数、pH值、离子强度等影响因素进行优化。
具体ic-ELISA操作步骤为：（1）包被：用包被液将稀释的包被原加至酶标板，100 μL/孔，4 ℃过夜孵育；（2）洗涤：倾去孔内液体，用洗涤液洗3遍，200 μL/孔，在吸水纸上拍干；（3）封闭：加入150 μL/孔封闭液，37 ℃孵育1 h；（4）洗涤：倾去孔内液体，用200 μL洗涤液洗1遍，在吸水纸上拍干；（5）加样：每孔加入50 μL不同浓度的标准品和适当稀释的待检血清，37 ℃孵育30 min；（6）洗涤：倾去孔内液体，用洗液洗3遍，200 μL/孔，在吸水纸上拍干；（7）加酶辣根过氧化物酶标记的二抗：加入 100 μL/孔 HRP-羊抗兔IgG，37 ℃孵育 30 min；（8）洗涤：倾去孔内液体，用洗液洗5遍，200 μL/孔，在吸水纸上拍干；（9）显色：加入新鲜配制的TMB底物溶液，100 μL/孔，避光显色10 min；（10）终止：加入终止液，50 μL/孔；（11）测定：用酶标仪读取各孔D450 nm值。
1.4建立标准曲线及数据分析
根据以上优化的结果，按照“1.3”节中的方法建立DBP的标准曲线。以零标准品D450 nm值为B0值，相应浓度标准品抑制时的D450 nm值为B值。以标准品浓度的对数为横坐标，以B/B0为纵坐标，绘制标准曲线。测定10份空白样，取测定平均值减3倍标准偏差，标准曲线上其对应的浓度值即为检测限（limit of detection，LOD）。
1.5交叉反应率的测定
选择与邻苯二甲酸二丁酯具有类似结构和类似功能的邻苯二甲酸二乙酯（diethyl phthalate，DEP）、邻苯二甲酸丁苄酯（benzyl butyl phthalate，BBP）、邻苯二甲酸单乙酯（monoethyl phthalate，MEP）、邻苯二甲酸单丁酯（monobutyl phthalate，MBP）、邻苯二甲酸单乙基己基酯（monoethylhexyl phthalate，MEHP）、邻苯二甲酸二正辛酯（di-n-octyl phthalate，DnOP）、邻苯二甲酸二异辛酯[di（2-ethylhexyl）phthalate，DiOP]，测定得到各药物的IC50值（抑制中点即抑制率为50%时对应的浓度），按公式（1）计算交叉反应率。 [JZ（]交叉反应率=DBP的 IC50值/相似结构物的IC50值×100%。
1.6样品前处理及添加回收率的测定
各取2 mL（或2 mg泥土，自然阴干）的样品，加入4 mL正己烷，振荡摇匀后使用高速离心机6 000 r/min离心 10 min，取上清，并用氮吹仪吹干。最终样品用2 mL磷酸盐缓冲液（PBS）复溶。
取空白样本，添加一定体积的DBP标准液，每个水平设3个平行。将混合物在漩涡混合器上涡动1 min，然后静置 15 min。按建立的间接竞争ELISA方法测定，检测时每份样品做3个平行重复孔。将各样品测得的D450 nm值代入标准曲线，计算出样品中的药物浓度，并根据公式（2）计算回收率。
[JZ（]回收率=实测值/添加值×100%。
2结果与分析
2.1间接竞争ELISA方法的建立与优化
为达到最佳的检测效果，本研究对影响方法的各种参数进行了优化，包括抗原稀释度、抗体稀释度、孵育条件、封闭时间、一抗竞争时间、HRP稀释度、pH值、离子强度。在最优条件下（部分數据如表1所示），分别为：抗原稀释度1 ∶[KG-*3]5 000、抗体稀释度1 ∶[KG-*3]30 000、孵育条件4 ℃过夜、封闭时间1.5 h、一抗竞争时间30 min、HRP稀释度1 ∶[KG-*3]2 000、pH值7.0、离子强度0.15 mol/L，以DBP浓度的LOG值为横坐标，抑制百分比（B/B0）为纵坐标绘制标准曲线（图2），其抑制程度与DBP的浓度具有明显的线性关系（70～1 600 ng/mL），IC50值为421 ng/mL，检测限可达66.6 ng/mL。
2.2交叉反应率测定
在最佳反应条件下，测定7种DBP的类似结构物，其中对BBP的交叉反应率为22.5%，对DEP的交叉反应率为 1.08%，其余5种均小于0.01%，从而可推断该检测体系所用的DBP抗体具有较强的特异性。根据免疫学的基本原理[12]：抗体倾向于识别距离偶联段最远的基团（主导的抗原决定簇）。对于所测定的7种PAEs，只有BBP在距离偶联段最远处，和DBP有相似的正丁基官能团，而其他PAEs均无。
2.3样本添加回收试验
[JP2]DBP在样品中的添加回收率、变异系数如表2所示。结果表明，其添加回收率均值在82.8%～104.0%之间，变异系数均小于20%，显示该方法的准确度和精确度均符合检测要求。
2.4镇江市内小型浅水河流水体和底泥的检测
表3为镇江市部分小型浅水河流中DBP在水体、底泥中的含量。由表3可知，DBP作为一种常见增塑剂在环境水体中普遍存在。4条河流中，除玉带河未检测到（玉带河离市区较远，且河道定期清淤，故水质较好），其余3条河流水体中DBP的含量介于76.5～140.4 ng/mL之间，显著高于台湾河（1.0～13.5 ng/mL）[13]、意大利淡水（ND～0.028 ng/mL）[14]和加拿大False Creek港（9.32～63.9 ng/mL）[15]中DBP的含量，而且超过《地表水环境质量标准》（GB 3838—2002）中DBP的标准限值（3 ng/mL）[16]。显然，DBP在3条市区河流中污染严重，这可能与河流周边附近工业废水的排放、固体废弃物的堆放和雨水淋洗以及PVC塑料的缓慢释放有关；另外下游的DBP含量明显高于中游，可推断出随河流沿程增加，带入水体中的污染物呈增加趋势，导致DBP含量也随之升高。
3結论
本研究建立了环境水体中DBP间接竞争ELISA分析方法。通过条件优化，本方法的IC50值可达421 ng/mL，线性范围为70～1 600 ng/mL，检测限为66.6 ng/mL。同时，本方法具有较高的准确度与精确度（回收率为82.8%～104.0%，变异系数为3.25%～10.20%）。利用此方法对镇江市部分小型浅水河流进行检测分析，结果表明市区内水体中DBP污染较为严重。本研究为DBP在镇江区域的污染状况调查、风险评估提供了一定的技术支持。
参考文献：
[1]Fromme H，Küchler T，Otto T，et al. Occurrence of phthalates and bisphenol A and F in the environment[J]. Water Research，2002，36（6）：1429-1438.
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[4]Adeniyi A A，Okedeyi O O，Yusuf K A. Flame ionization gas chromatographic determination of phthalate esters in water，surface sediments and fish species in the Ogun river catchments，Ketu，Lagos，Nigeria[J]. Environmental Monitoring and Assessment，2011，172（1/2/3/4）：561-569. [5]陆继龙，郝立波，王春振，等. 第二松花江中下游水体邻苯二甲酸酯分布特征[J]. 环境科学与技术，2007，30（12）：35-37.
[6]蔡智鸣，杨科峰，厉曙光，等. DBP、DOP对小鼠的联合遗传毒性[J]. 环境与职业医学，2002，19（3）：197-198.
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