论文部分内容阅读
摘 要 目的：通过siRNA技术，探讨Notch1靶向沉默对人绒毛膜上皮癌JEG3细胞增殖及侵袭力的影响。方法：设计并合成Notch1-siRNA寡核苷酸链，将与人类基因无同源性的siRNA片段作为阴性对照，分别转染JEG-3细胞。将JEG-3细胞进行分离培养，并分3组：未转染正常对照组（NT）、转染对照siRNA的阴性对照组（CS）、转染Notch1 siRNA基因沉默组（NS）。利用MTT法检测细胞增殖情况，Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力。结果：NS组细胞增殖情况显著低于NT组和CS组。侵袭实验结果显示NS组侵袭细胞数目（58.3±4.2）明显少于NT组（109.2±6.3）与CS组（116.8±5.9）（P<0.05）。结论：Notch1靶向沉默能够减缓JEG-3细胞增殖，降低侵袭能力，提示Notch1可能是治疗人绒毛膜上皮癌的靶点。
关键词 绒毛膜上皮癌 Notch1 siRNA JEG-3细胞
中图分类号：R730.2313； R737.3 文献标志码：A 文章编号：1006-1533（2019）21-0066-05
Effects of Notch1 siRNA on the human chorionic carcinoma cell proliferation and invasive QU Pingbo1*， WANG Chunhong2， XIA Wei1
（1. Shanghai Shengdi Pharmaceutical Co.， Ltd.， Shanghai 201210， China； 2. Shanghai Shengzhao Biotechnology Company， Shanghai 201104， China）
ABSTRACT Objective： To investigate the effects of Notch1 siRNA on the proliferation and the invasive ability of human chorionic carcinoma JEG-3 cell. Methods： Notch1 siRNA oligonucleotide chain was designed and synthesized and siRNA fragment with no homology to human gene was taken as a negative control， and they were respectively transfected into JEG-3 cells. The transfected JEG-3 cells were isolated， cultured and divided into three groups： the control group （NT） without any transfection， control group （CS） was transfected by control siRNA and Notch1 siRNA group （NS） was transfected by Notch1 siRNA. Cell proliferation was detected by MTT assay and the ability of cell invasion was assayed by Transwell invasion experiment. Results： The cell proliferation ability of NS group was significantly lower than the other two groups（P<0.05）. Transwell invasion experiment test results showed the number of cells （58.3±4.2） in the NS group was obviously less than NT group （109.2±6.3） and CS group （116.8±5.9） （P<0.05）. Conclusion： Notch1 targeted silence can slow the JEG -3 cell proliferation， reduce its ability to attack. Notch1 may be targeted for the treatment of human chorionic carcinoma.
KEy WORDS chorionic carcinoma； Notch1； siRNA； JEG-3 cells
絨毛膜上皮癌简称绒癌，是一种高度恶性的滋养细胞肿瘤。可造成严重的局部组织破坏，早期即可发生血道转移而危及患者生命。随着多药联合化疗的进展，绒癌患者的治愈率有了明显的提高，但仍有相当一部分病例治疗效果不满意。最新报道显示，有14%的高危群患者因无法耐受化疗药的不良反应而中断疗程，患者5年生存率仅有43%，这对绒癌治疗药物提出了新要求[1-2]。近年来分子靶向治疗日益受到关注[3]，它以肿瘤细胞的特性改变为作用靶点，在发挥更强抗肿瘤活性的同时减少对正常细胞的毒性，使化疗更加“有的放矢”。
Notch受体是由2 753个氨基酸残基组成的单链跨膜受体蛋白，广泛存在于多种物种中，在进化上十分保守，属于跨膜受体蛋白家族。Notch信号传导通路在细胞增殖、分化及凋亡中发挥着多种功能，Notch信号的活化和抑制与多种肿瘤的发生、发展有关，因此，调节Notch信号可能是肿瘤治疗的一个新靶点。Notch1是Notch信号通路上的重要调节分子，Notch1信号与消化系统肿瘤的发生发展和转移有密切关系，是肿瘤组织中最常表达的Notch家族成员之一[4-6]。在对人类T淋巴细胞白血病的研究中首次发现了Notch1信号通路与肿瘤的关系，大量实验证明此通路的突变是急性T淋巴细胞白血病发生的关键诱因[7-10]。Pang等[11]在对滋养细胞BeWo和JAR细胞系的研究中发现，Notch1可增强细胞的侵袭能力。Cobellis等[12]研究发现，血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）表达减少下调了Notch蛋白的表达，从而影响滋养细胞对子宫内膜的可控性侵袭，参与子痫前期的发病。由此可见，Notch信号传导通路不仅与胎盘细胞分化、滋养细胞增殖、侵袭密切相关，而且与胎盘血管内皮细胞增殖分化密切相关，该信号传导通路发生异常，很有可能与绒毛膜癌的发生有关，但国内外相关文献未见报道。 本实验拟通过建立JEG-3绒毛膜癌细胞模型，通过RNA干扰（RNA interference，iRNA）技术，转染JEG-3细胞，使Notch1表达沉默，分别检测对JEG-3细胞增殖以及侵袭能力的影响，旨在为进一步寻找绒毛膜癌治疗的一个新的靶点提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
JEG-3细胞系购自中国科学院动物研究所计划生育与生殖生物学国家重点实验室；胎牛血清购自杭州四季青生物公司；DMEM、胰酶购自美国Gibco公司；MTT、转染试剂Fugene HD购自美国Promega公司；HERAcell 150型CO2培养箱购自德国Heraeus公司；半干转印系统购自美国Bio-rad公司；PVDF膜购自美国迈博瑞公司；抗Notch1抗体购自英国Abcam公司；抗GAPDH抗体和RIPA裂解液购自碧云天生物技术公司。
1.2 实验方法
1.2.1 细胞培养
JEG-3常规复苏后，置于含胎牛血清10%、谷丙酰胺2 mmol/L及丙酮酸钠1 mmol/L的DMEM培养液中，于37 ℃、5% CO2的培养箱培养。3次传代稳定后，用于实验。
1.2.2 合成Notch1-siRNA序列
查閱GenBank中Notch1序列（NM-001105721.1），设计siRNA片段，由上海吉玛公司合成。Notch1-siRNA序列：5’-CCGCCUUUGUGCUUCUGUU-3’，Control siRNA序列：5’-UUUUCGCAUCGAGUCACGUCU-3’。
1.2.3 细胞转染
实验分组：将合成的Notch1-siRNA寡核苷酸链转染到质粒pGCsilencerTMU6/GFP上，同时将携带与人类基因无同源性的siRNA片段表达质粒作为阴性对照，将两种质粒分别转染至对数期生长的细胞进行实验。细胞共分为3组：常规培养的未转染正常对照组（NT）、转染Control siRNA的阴性对照组（CS）、转染Notch1-siRNA基因沉默组（NS）。转染时分别加入DMEM培养基/Fugene HD，Control siRNA/Fugene HD混合物和Notch1-siRNA/Fugene HD混合物。
细胞转染：将处于对数生长期的各组细胞用胰酶进行消化，按照2×105个细胞/孔的密度接种于6孔板，加入无双抗含10%胎牛血清DMED培养基，培养过夜至细胞密度为60%～80%。转染前更换新鲜培养液无双抗DMED培养基2 ml。用250 ml无血清DMEM分别对200 pmol/L siRNA和5 ml转染试剂Fugene HD进行稀释，于37 ℃孵育5 min，然后将二者混匀再次孵育20 min，将混合物逐滴加入6孔板，混匀，培养6 h后，换含10%胎牛血清DMEM完全培养基继续培养48～72 h。
1.2.4 Western-blot检测各组细胞Notch1蛋白的表达
转染培养48～72 h后弃上清，用4 ℃预冷的0.01 mol/L PBS（pH7.4）洗涤细胞2次，加入RIPA裂解液，于冰上反应20 min，离心，收集上清液获得蛋白样品。按照比例加入蛋白电泳上样缓冲液，煮沸（95 ℃，5 min），瞬间离心备用。SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳，浓缩胶电压为60 V，35 min，分离胶为120 V，60 min。半干转仪PVDF膜200 mA，1 h。用5%的牛奶封闭液封闭90 min；然后分别加入一抗：抗Notch1抗体、抗GAPDH抗体（作为内参校正），于4 ℃孵育过夜，TBST洗膜3次；加入二抗，于室温孵育2 h，TBST洗膜3次；荧光显色。利用Labwork分析软件（基因公司）测定Western-blot条带的吸光度值，并与GAPDH吸光度值的比值表示蛋白的相对含量。
1.2.5 MTT法检测细胞增殖情况
细胞在6孔板转染后，将细胞消化接种于96孔内，调节细胞数为1×104/孔，5% CO2孵箱培养，分别用MTT在12、24、36、48和60 h检测细胞增殖情况：各孔加20 ml MTT溶液，室温反应1～4 h，弃上清，加入150 ml DMSO，震荡10 min，于490 nm测定光吸收值，记录结果并绘制细胞生长曲线图。
1.2.6 细胞侵袭能力的检测
包被基底膜：将Matrigel胶与无血清DMEM培养基以1∶8比例混匀，取50 ml加入Transwell小室膜上室，风干；水化基底膜，弃培养板中的残留液体，并加入50 ml无血清培养液。收集转染48 h后的各组细胞，用含有10 g/L BSA的无血清DMEM培养基重悬，使细胞密度为1×105/ml。接种200 ml细胞悬液到上室中，将小室置于含600 ml 20%胎牛血清的DMEM培养液的24孔板，孵育24 h，后用PBS淋洗，擦掉上室内细胞，PBS洗3次，95%乙醇固定，结晶紫染色，倒置显微镜随机选取5个视野（200×），计数穿过小室膜孔的细胞。
1.2.7 Western-blot检测各组细胞转染后MMP-2及MMP-9蛋白表达
收集转染72 h后的细胞，RIPA法提取蛋白，Western-blot方法检测各组细胞转染后MMP-2及MMP-9蛋白表达，方法同1.2.4。
1.2.8 统计学方法
所有实验步骤至少重复3次，统计软件SPSS 16.0进行统计分析，组间比较采用单因素方差分析，如果P<0.05提示具有统计学意义，则进一步采用最小显著性差异法进行组间两两配对比较。
2 结果
2.1 Notch1的表达水平
Western-blot检测各组细胞Notch1蛋白的表达，通过灰度值检测，显示NS组Notch1蛋白表达水平明显低于NT组及CS组，P<0.05（图1）。
2.2 細胞增殖能力的检测结果
MTT结果显示，第36、48和60 h三个时间点，NS组细胞增殖明显低于另外两组细胞，而NT与CS两组细胞增殖无明显差别（P<0.05，图2）；NT与CS组性别增殖速度无明显差别（图2）。
2.3 组细胞侵袭能力的检测结果
分别对三组细胞穿过Transwell小室膜的细胞进行计数。结果显示NS组细胞数目（58.3±4.2）明显少于NT组（109.2±6.3）与CS组（116.8±5.9），差异具有统计学意义（P<0.05）。而NT与CS组细胞间穿过小室膜的细胞数目无统计学差异。
2.4 细胞MMP-2、MMP-9的表达水平
Western-blot检测各组细胞Notch1蛋白的表达，通过灰度值检测，显示NS组MMP-2、MMP-9蛋白表达水平明显低于NT组及CS组（P<0.05）；而NT与CS组间细胞MMP-2、MMP-9的表达无明显差异（图3）。
3 讨论
siRNA是通过双链RNA分子在mRNA水平上将相应序列的基因关闭或者沉默的过程。iRNA技术通过siRNA介导，具有高度的稳定性、特异性，成功率高，且抑制范围广泛，近年来，被广泛应用于对细胞信号传导以及基因表达的研究领域。本实验通过siRNA技术，沉默JEG-3细胞Notch1基因，检测对JEG-3细胞的增殖以及侵袭能力的影响，结果显示，JEG-3细胞经转染后，Notch1蛋白表达明显下降，提示通过iRNA技术转染siRNA Notch1基因成功，且转染率达到90%以上。转染后，通过MTS法检测JEG-3细胞增殖情况，发现JEG-3在转染Notch1-siRNA后，细胞增殖速度明显低于另外两组细胞，说明沉默Notch1具有下调JEG-3细胞增殖的作用，进而提示沉默Notch1可能是控制绒癌发生发展的有效途径。恶性肿瘤治疗效果不佳的最主要原因在于其侵袭性生长，并造成转移灶的形成，因此，明确Notch1沉默后JEG-3细胞侵袭能力的改变，对研究Notch1沉默对绒癌的治疗前景有重要意义。基质金属蛋白酶2（MMP-2）和MMP-9在肿瘤组织中表达，在胰腺癌的研究中发现，上调Notch1，能够活化NF-κB信号通路，使MMP-9表达增加，从而明显促进肿瘤的浸润转移，而应用siRNA技术沉默Notch1基因后，则得到抑制肿瘤侵袭的结果，说明通过调节Notch1表达调节NF-κB信号通路，从而调节胰腺癌的侵袭过程[13]。此外有研究表明Notch1与MMP-2和MMP-9的表达呈正相关[14]。目前研究普遍认为，基底膜、细胞外基质的降解是肿瘤细胞侵袭转移的重要步骤，基质金属蛋白酶是目前唯一能降解细胞外基质的酶类，可以结合并活化肿瘤细胞膜上的跨膜蛋白，对细胞外基质进行降解，从而促进肿瘤细胞的侵袭转移。本实验通过Transwell侵袭实验检测发现，Notch1沉默后细胞穿过小室细胞数明显减少，且对侵袭相关因子MMP-2、MMP-9的检测发现，Notch1沉默后两种因子的表达均明显下调，说明Notch1沉默后，JEG-3细胞MMP-2、MMP-9表达下调，侵袭能力明显受到抑制。
Notch1靶向沉默能够减缓JEG-3细胞增殖能力，同时可能通过下调MMP-2、MMP-9表达，降低其侵袭能力，提示Notch1是影响JEG-3细胞增殖、侵袭的重要因子， Notch信号通路可能成为治疗人绒毛膜上皮癌新的靶点。
参考文献
[1] Noal S， Joly F， Leblanc E. Management of gestational trophoblastic disease[J]. Gynecol Obstet Fertil， 2010， 38（3）： 193-198.
[2] Seckl MJ， Sebire NJ， Berkowitz RS. Gestational trophoblastic disease[J]. Lancet， 2010， 376（9742）： 717-729.
[3] Cormier S， Vandormael-Pournin S， Babinet C， et al. Developmental expression of the Notch signaling pathway genes during mouse preimplantation development[J]. Gene Expr Patterns， 2004， 4（6）： 713-717.
[4] Ntziachristos P， Lim JS， Sage J， et al. From fly wings to targeted cancer therapies： a centennial for Notch signaling[J]. Cancer Cell， 2014， 3： 318-334.
[5] Li Y， Zhang J， Ma D， et al. Curcumin inhibits proliferation and invasion of osteosarcoma cells through inactivation of Notch-1 signaling [J]. FEBS J， 2012， 279（12）： 2247-2259. [6] 吴德明， 杨志强， 刘翔， 等. RNAi沉默Notch1基因对人骨肉瘤细胞MG63的促凋亡作用[J]. 山东医药， 2013， 53（4）： 36-38.
[7] Ma J， Wu M. The indicative effect of Notch1 expression for the prognosis of T-cell acute lymphocytic leukemia： a systematic review[J]. Mol Biol Rep， 2012， 39（5）： 6095-6100.
[8] Huang C， Hu X， Wang L， et al. Bortezomib suppresses the growth of leukemia cells with Notch1 overexpression in vivo and in vitro[J]. Cancer Chemother Pharmacol， 2012， 70（6）： 801-809.
[9] Hannon M M， Lohan F， Erbilgin Y， et al. Elevated TRIB2 with NOTCH1 activation in paediatric/adult T-ALL[J]. Br J Haematol， 2012， 158（5）： 626-634.
[10] Ma W， Gutierrez A， Goff D J， et al. NOTCH1 signaling promotes human T-cell acute lymphoblastic leukemia initiating cell regeneration in supportive niches[J/OL]. PLoS One， 2012， 7（6）： e39725. doi： 10.1371/journal.pone.0039725.
[11] Pang RT， Leung CO， Ye TM， et al. MicroRNA-34a suppresses invasion through downregulation of Notch1 and Jagged1 in cervical carcinoma and choriocarcinoma cells[J]. Carcinogenesis， 2010， 31（6）： 1037-1044.
[12] Cobellis L， Mastrogiacomo A， Federico E， et al. Distribution of Notch protein members in normal and preeclampsiacomplicated placentas[J]. Cell Tissue Res， 2007， 330（3）： 527-534.
[13] Zhang X， Chen T， Zhang J， et al. Notch1 promotes glima cell migration and invasion by stimulating beta-catenin and NFkappa B signaling via AKT activation[J]. Cancer Sci， 2012， 103（2）： 181-190.
[14] 孫增峰， 王乐， 谷峰， 等. Notch1基质金属蛋白酶2基质金属蛋白酶9蛋白在胶质瘤中的表达及其临床意义[J]. 中华肿瘤杂志， 2012， 34（1）： 26-30.
关键词 绒毛膜上皮癌 Notch1 siRNA JEG-3细胞
中图分类号：R730.2313； R737.3 文献标志码：A 文章编号：1006-1533（2019）21-0066-05
Effects of Notch1 siRNA on the human chorionic carcinoma cell proliferation and invasive QU Pingbo1*， WANG Chunhong2， XIA Wei1
（1. Shanghai Shengdi Pharmaceutical Co.， Ltd.， Shanghai 201210， China； 2. Shanghai Shengzhao Biotechnology Company， Shanghai 201104， China）
ABSTRACT Objective： To investigate the effects of Notch1 siRNA on the proliferation and the invasive ability of human chorionic carcinoma JEG-3 cell. Methods： Notch1 siRNA oligonucleotide chain was designed and synthesized and siRNA fragment with no homology to human gene was taken as a negative control， and they were respectively transfected into JEG-3 cells. The transfected JEG-3 cells were isolated， cultured and divided into three groups： the control group （NT） without any transfection， control group （CS） was transfected by control siRNA and Notch1 siRNA group （NS） was transfected by Notch1 siRNA. Cell proliferation was detected by MTT assay and the ability of cell invasion was assayed by Transwell invasion experiment. Results： The cell proliferation ability of NS group was significantly lower than the other two groups（P<0.05）. Transwell invasion experiment test results showed the number of cells （58.3±4.2） in the NS group was obviously less than NT group （109.2±6.3） and CS group （116.8±5.9） （P<0.05）. Conclusion： Notch1 targeted silence can slow the JEG -3 cell proliferation， reduce its ability to attack. Notch1 may be targeted for the treatment of human chorionic carcinoma.
KEy WORDS chorionic carcinoma； Notch1； siRNA； JEG-3 cells
絨毛膜上皮癌简称绒癌，是一种高度恶性的滋养细胞肿瘤。可造成严重的局部组织破坏，早期即可发生血道转移而危及患者生命。随着多药联合化疗的进展，绒癌患者的治愈率有了明显的提高，但仍有相当一部分病例治疗效果不满意。最新报道显示，有14%的高危群患者因无法耐受化疗药的不良反应而中断疗程，患者5年生存率仅有43%，这对绒癌治疗药物提出了新要求[1-2]。近年来分子靶向治疗日益受到关注[3]，它以肿瘤细胞的特性改变为作用靶点，在发挥更强抗肿瘤活性的同时减少对正常细胞的毒性，使化疗更加“有的放矢”。
Notch受体是由2 753个氨基酸残基组成的单链跨膜受体蛋白，广泛存在于多种物种中，在进化上十分保守，属于跨膜受体蛋白家族。Notch信号传导通路在细胞增殖、分化及凋亡中发挥着多种功能，Notch信号的活化和抑制与多种肿瘤的发生、发展有关，因此，调节Notch信号可能是肿瘤治疗的一个新靶点。Notch1是Notch信号通路上的重要调节分子，Notch1信号与消化系统肿瘤的发生发展和转移有密切关系，是肿瘤组织中最常表达的Notch家族成员之一[4-6]。在对人类T淋巴细胞白血病的研究中首次发现了Notch1信号通路与肿瘤的关系，大量实验证明此通路的突变是急性T淋巴细胞白血病发生的关键诱因[7-10]。Pang等[11]在对滋养细胞BeWo和JAR细胞系的研究中发现，Notch1可增强细胞的侵袭能力。Cobellis等[12]研究发现，血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）表达减少下调了Notch蛋白的表达，从而影响滋养细胞对子宫内膜的可控性侵袭，参与子痫前期的发病。由此可见，Notch信号传导通路不仅与胎盘细胞分化、滋养细胞增殖、侵袭密切相关，而且与胎盘血管内皮细胞增殖分化密切相关，该信号传导通路发生异常，很有可能与绒毛膜癌的发生有关，但国内外相关文献未见报道。 本实验拟通过建立JEG-3绒毛膜癌细胞模型，通过RNA干扰（RNA interference，iRNA）技术，转染JEG-3细胞，使Notch1表达沉默，分别检测对JEG-3细胞增殖以及侵袭能力的影响，旨在为进一步寻找绒毛膜癌治疗的一个新的靶点提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
JEG-3细胞系购自中国科学院动物研究所计划生育与生殖生物学国家重点实验室；胎牛血清购自杭州四季青生物公司；DMEM、胰酶购自美国Gibco公司；MTT、转染试剂Fugene HD购自美国Promega公司；HERAcell 150型CO2培养箱购自德国Heraeus公司；半干转印系统购自美国Bio-rad公司；PVDF膜购自美国迈博瑞公司；抗Notch1抗体购自英国Abcam公司；抗GAPDH抗体和RIPA裂解液购自碧云天生物技术公司。
1.2 实验方法
1.2.1 细胞培养
JEG-3常规复苏后，置于含胎牛血清10%、谷丙酰胺2 mmol/L及丙酮酸钠1 mmol/L的DMEM培养液中，于37 ℃、5% CO2的培养箱培养。3次传代稳定后，用于实验。
1.2.2 合成Notch1-siRNA序列
查閱GenBank中Notch1序列（NM-001105721.1），设计siRNA片段，由上海吉玛公司合成。Notch1-siRNA序列：5’-CCGCCUUUGUGCUUCUGUU-3’，Control siRNA序列：5’-UUUUCGCAUCGAGUCACGUCU-3’。
1.2.3 细胞转染
实验分组：将合成的Notch1-siRNA寡核苷酸链转染到质粒pGCsilencerTMU6/GFP上，同时将携带与人类基因无同源性的siRNA片段表达质粒作为阴性对照，将两种质粒分别转染至对数期生长的细胞进行实验。细胞共分为3组：常规培养的未转染正常对照组（NT）、转染Control siRNA的阴性对照组（CS）、转染Notch1-siRNA基因沉默组（NS）。转染时分别加入DMEM培养基/Fugene HD，Control siRNA/Fugene HD混合物和Notch1-siRNA/Fugene HD混合物。
细胞转染：将处于对数生长期的各组细胞用胰酶进行消化，按照2×105个细胞/孔的密度接种于6孔板，加入无双抗含10%胎牛血清DMED培养基，培养过夜至细胞密度为60%～80%。转染前更换新鲜培养液无双抗DMED培养基2 ml。用250 ml无血清DMEM分别对200 pmol/L siRNA和5 ml转染试剂Fugene HD进行稀释，于37 ℃孵育5 min，然后将二者混匀再次孵育20 min，将混合物逐滴加入6孔板，混匀，培养6 h后，换含10%胎牛血清DMEM完全培养基继续培养48～72 h。
1.2.4 Western-blot检测各组细胞Notch1蛋白的表达
转染培养48～72 h后弃上清，用4 ℃预冷的0.01 mol/L PBS（pH7.4）洗涤细胞2次，加入RIPA裂解液，于冰上反应20 min，离心，收集上清液获得蛋白样品。按照比例加入蛋白电泳上样缓冲液，煮沸（95 ℃，5 min），瞬间离心备用。SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳，浓缩胶电压为60 V，35 min，分离胶为120 V，60 min。半干转仪PVDF膜200 mA，1 h。用5%的牛奶封闭液封闭90 min；然后分别加入一抗：抗Notch1抗体、抗GAPDH抗体（作为内参校正），于4 ℃孵育过夜，TBST洗膜3次；加入二抗，于室温孵育2 h，TBST洗膜3次；荧光显色。利用Labwork分析软件（基因公司）测定Western-blot条带的吸光度值，并与GAPDH吸光度值的比值表示蛋白的相对含量。
1.2.5 MTT法检测细胞增殖情况
细胞在6孔板转染后，将细胞消化接种于96孔内，调节细胞数为1×104/孔，5% CO2孵箱培养，分别用MTT在12、24、36、48和60 h检测细胞增殖情况：各孔加20 ml MTT溶液，室温反应1～4 h，弃上清，加入150 ml DMSO，震荡10 min，于490 nm测定光吸收值，记录结果并绘制细胞生长曲线图。
1.2.6 细胞侵袭能力的检测
包被基底膜：将Matrigel胶与无血清DMEM培养基以1∶8比例混匀，取50 ml加入Transwell小室膜上室，风干；水化基底膜，弃培养板中的残留液体，并加入50 ml无血清培养液。收集转染48 h后的各组细胞，用含有10 g/L BSA的无血清DMEM培养基重悬，使细胞密度为1×105/ml。接种200 ml细胞悬液到上室中，将小室置于含600 ml 20%胎牛血清的DMEM培养液的24孔板，孵育24 h，后用PBS淋洗，擦掉上室内细胞，PBS洗3次，95%乙醇固定，结晶紫染色，倒置显微镜随机选取5个视野（200×），计数穿过小室膜孔的细胞。
1.2.7 Western-blot检测各组细胞转染后MMP-2及MMP-9蛋白表达
收集转染72 h后的细胞，RIPA法提取蛋白，Western-blot方法检测各组细胞转染后MMP-2及MMP-9蛋白表达，方法同1.2.4。
1.2.8 统计学方法
所有实验步骤至少重复3次，统计软件SPSS 16.0进行统计分析，组间比较采用单因素方差分析，如果P<0.05提示具有统计学意义，则进一步采用最小显著性差异法进行组间两两配对比较。
2 结果
2.1 Notch1的表达水平
Western-blot检测各组细胞Notch1蛋白的表达，通过灰度值检测，显示NS组Notch1蛋白表达水平明显低于NT组及CS组，P<0.05（图1）。
2.2 細胞增殖能力的检测结果
MTT结果显示，第36、48和60 h三个时间点，NS组细胞增殖明显低于另外两组细胞，而NT与CS两组细胞增殖无明显差别（P<0.05，图2）；NT与CS组性别增殖速度无明显差别（图2）。
2.3 组细胞侵袭能力的检测结果
分别对三组细胞穿过Transwell小室膜的细胞进行计数。结果显示NS组细胞数目（58.3±4.2）明显少于NT组（109.2±6.3）与CS组（116.8±5.9），差异具有统计学意义（P<0.05）。而NT与CS组细胞间穿过小室膜的细胞数目无统计学差异。
2.4 细胞MMP-2、MMP-9的表达水平
Western-blot检测各组细胞Notch1蛋白的表达，通过灰度值检测，显示NS组MMP-2、MMP-9蛋白表达水平明显低于NT组及CS组（P<0.05）；而NT与CS组间细胞MMP-2、MMP-9的表达无明显差异（图3）。
3 讨论
siRNA是通过双链RNA分子在mRNA水平上将相应序列的基因关闭或者沉默的过程。iRNA技术通过siRNA介导，具有高度的稳定性、特异性，成功率高，且抑制范围广泛，近年来，被广泛应用于对细胞信号传导以及基因表达的研究领域。本实验通过siRNA技术，沉默JEG-3细胞Notch1基因，检测对JEG-3细胞的增殖以及侵袭能力的影响，结果显示，JEG-3细胞经转染后，Notch1蛋白表达明显下降，提示通过iRNA技术转染siRNA Notch1基因成功，且转染率达到90%以上。转染后，通过MTS法检测JEG-3细胞增殖情况，发现JEG-3在转染Notch1-siRNA后，细胞增殖速度明显低于另外两组细胞，说明沉默Notch1具有下调JEG-3细胞增殖的作用，进而提示沉默Notch1可能是控制绒癌发生发展的有效途径。恶性肿瘤治疗效果不佳的最主要原因在于其侵袭性生长，并造成转移灶的形成，因此，明确Notch1沉默后JEG-3细胞侵袭能力的改变，对研究Notch1沉默对绒癌的治疗前景有重要意义。基质金属蛋白酶2（MMP-2）和MMP-9在肿瘤组织中表达，在胰腺癌的研究中发现，上调Notch1，能够活化NF-κB信号通路，使MMP-9表达增加，从而明显促进肿瘤的浸润转移，而应用siRNA技术沉默Notch1基因后，则得到抑制肿瘤侵袭的结果，说明通过调节Notch1表达调节NF-κB信号通路，从而调节胰腺癌的侵袭过程[13]。此外有研究表明Notch1与MMP-2和MMP-9的表达呈正相关[14]。目前研究普遍认为，基底膜、细胞外基质的降解是肿瘤细胞侵袭转移的重要步骤，基质金属蛋白酶是目前唯一能降解细胞外基质的酶类，可以结合并活化肿瘤细胞膜上的跨膜蛋白，对细胞外基质进行降解，从而促进肿瘤细胞的侵袭转移。本实验通过Transwell侵袭实验检测发现，Notch1沉默后细胞穿过小室细胞数明显减少，且对侵袭相关因子MMP-2、MMP-9的检测发现，Notch1沉默后两种因子的表达均明显下调，说明Notch1沉默后，JEG-3细胞MMP-2、MMP-9表达下调，侵袭能力明显受到抑制。
Notch1靶向沉默能够减缓JEG-3细胞增殖能力，同时可能通过下调MMP-2、MMP-9表达，降低其侵袭能力，提示Notch1是影响JEG-3细胞增殖、侵袭的重要因子， Notch信号通路可能成为治疗人绒毛膜上皮癌新的靶点。
参考文献
[1] Noal S， Joly F， Leblanc E. Management of gestational trophoblastic disease[J]. Gynecol Obstet Fertil， 2010， 38（3）： 193-198.
[2] Seckl MJ， Sebire NJ， Berkowitz RS. Gestational trophoblastic disease[J]. Lancet， 2010， 376（9742）： 717-729.
[3] Cormier S， Vandormael-Pournin S， Babinet C， et al. Developmental expression of the Notch signaling pathway genes during mouse preimplantation development[J]. Gene Expr Patterns， 2004， 4（6）： 713-717.
[4] Ntziachristos P， Lim JS， Sage J， et al. From fly wings to targeted cancer therapies： a centennial for Notch signaling[J]. Cancer Cell， 2014， 3： 318-334.
[5] Li Y， Zhang J， Ma D， et al. Curcumin inhibits proliferation and invasion of osteosarcoma cells through inactivation of Notch-1 signaling [J]. FEBS J， 2012， 279（12）： 2247-2259. [6] 吴德明， 杨志强， 刘翔， 等. RNAi沉默Notch1基因对人骨肉瘤细胞MG63的促凋亡作用[J]. 山东医药， 2013， 53（4）： 36-38.
[7] Ma J， Wu M. The indicative effect of Notch1 expression for the prognosis of T-cell acute lymphocytic leukemia： a systematic review[J]. Mol Biol Rep， 2012， 39（5）： 6095-6100.
[8] Huang C， Hu X， Wang L， et al. Bortezomib suppresses the growth of leukemia cells with Notch1 overexpression in vivo and in vitro[J]. Cancer Chemother Pharmacol， 2012， 70（6）： 801-809.
[9] Hannon M M， Lohan F， Erbilgin Y， et al. Elevated TRIB2 with NOTCH1 activation in paediatric/adult T-ALL[J]. Br J Haematol， 2012， 158（5）： 626-634.
[10] Ma W， Gutierrez A， Goff D J， et al. NOTCH1 signaling promotes human T-cell acute lymphoblastic leukemia initiating cell regeneration in supportive niches[J/OL]. PLoS One， 2012， 7（6）： e39725. doi： 10.1371/journal.pone.0039725.
[11] Pang RT， Leung CO， Ye TM， et al. MicroRNA-34a suppresses invasion through downregulation of Notch1 and Jagged1 in cervical carcinoma and choriocarcinoma cells[J]. Carcinogenesis， 2010， 31（6）： 1037-1044.
[12] Cobellis L， Mastrogiacomo A， Federico E， et al. Distribution of Notch protein members in normal and preeclampsiacomplicated placentas[J]. Cell Tissue Res， 2007， 330（3）： 527-534.
[13] Zhang X， Chen T， Zhang J， et al. Notch1 promotes glima cell migration and invasion by stimulating beta-catenin and NFkappa B signaling via AKT activation[J]. Cancer Sci， 2012， 103（2）： 181-190.
[14] 孫增峰， 王乐， 谷峰， 等. Notch1基质金属蛋白酶2基质金属蛋白酶9蛋白在胶质瘤中的表达及其临床意义[J]. 中华肿瘤杂志， 2012， 34（1）： 26-30.