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摘要 以红鳍东方鲀皮肤溃烂病病原——哈维弧菌2SYX002为抗原，通过杂交瘤技术制备了抗哈维弧菌的单抗1B6、1D6、1A4、5B4、6C6、2E7、4A7、5B2、4E12、1G3、7D7、8E10、4D12、2B9、7D6、6E6、1G2、6G6 和 2C1。特性分析结果表明：有8株单克隆抗体（1B6、1D6、1A4、5B4、6C6、7D6、6E6、6G6）特异性较差，与试验中所有菌株均发生反应；有6株（4A7、4E12、7D7、8E10、4D12、2B9）只与免疫菌株哈维弧菌2SYX002反应，与其他菌株均不发生反应。5株单抗（2E7、5B2、1G2、2C1 、1G3 ）与部分参考菌株有不同程度交叉反应；通过进一步特性分析，从中筛选出单克隆抗体2C1，其抗原包被浓度为5×107 cells/mL时，与试验中所有哈维弧菌分离株反应均为阳性，除溶藻弧菌外不与其他参考菌株发生交叉反应，效价为1：256。本研究扩充了哈维弧菌单克隆抗体库，为哈维弧菌单克隆抗体的进一步应用提供参考数据。
关键词 哈维弧菌；红鳍东方鲀；单克隆抗体；特性分析
中图分类号 S941.4 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2016）08-0239-01
Abstract In this paper， 6-week-old BALB/c mice were immunized with Vibrio harveyi 2SYX002 （isolated from dermal ulcer of Fugu rubripes） for monoclonal antibody preparation. After cell fusion，，screening， sub-cell clone， and so on， 19 hybridoma cell lines were obtained and named（1B6、1D6、1A4、5B4、6C6、2E7、4A7、5B2、4E12、1G3、7D7、8E10、4D12、2B9、7D6、6E6、1G2、6G6 and 2C1）.ELISA results showed that the MAb 1B6、1D6、1A4、5B4、6C6、7D6、6E6 and 6G6 had positive reaction with all of the standard and isolated strains.The mAb of 4A7、4E12、7D7、8E10、4D12 and 2B9 had no crossreaction with other 11 standard bacterial strains， only specific reaction with the immuned bactria. MAb 2E7、5B2，、1G2，、2C1 and 1G3 had cross-reacted with tested strains， such as Vibrio.parahaemolyticus， Vibrio.damsela and so on. Among them， MAb 2C1 only had positive reaction with all strains of Vibrio.harveyi and Vibrio.alginolyticus（the titer was 1：256）， without other 11 standard bacterial strains. The present results provided the basis for the preparation of immunochromatographic test strip to rapid detection Vibrio. harveyi.
Key words Vibrio harveyi；Fugu rubripes；monoclonal antibodies；characteristic analysis.
哈维弧菌（Vibrio harveyi）又称哈氏弧菌，广泛存在于海洋环境中，是海水养殖业中一种常见的致病菌。其宿主十分广泛，是对虾发光病的主要致病菌[1-2]，还可引起多种海水养殖鱼类溃疡病[3-5]，其中红鳍东方鲀皮肤溃烂病，具有传染性较强，死亡率較高的特点。哈维弧菌是该病主要病原菌之一，患病鱼体出现表皮溃烂，伴随全身性出血，病灶处肌肉组织严重液化，肝脏等器官严重损伤，给养殖业带来严重的经济损失。由于哈维弧菌遗传特征和生理生化特征复杂多样，并且与其近缘种在表型上有很高的相似性，依靠传统的检测方法检出率低，而且需依赖专业的技术和设备，耗时长、操作复杂，难以实现对疾病的及时诊断与防治。因此，发展哈维弧菌的快速检测技术在致病性弧菌诊断中有重要意义。基于免疫学原理的荧光抗体技术及酶联免疫吸附技术可以实现快速、特异的检测哈维弧菌。目前，Robertertson等制备了哈维弧菌的多克隆抗体[9]，但多抗血清具有明显的异质性，特异性较差。与之相比，单克隆抗体特异性高，其检测结果更准确可靠。本试验利用灭活的红鳍东方鲀“皮肤溃烂病”病原——哈维弧菌2SYX002作为抗原免疫小鼠，制备了抗哈维弧菌的单克隆抗体，并对其进行了特性分析，为哈维弧菌的快速检测技术的发展提供了物质基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料及试剂
哈维弧菌Vibrio.harveyi（ATCC35084）、灿烂弧菌Vibrio.splendidus（ATCC33125）、副溶血弧菌Vibrio.parahaemolyticus（KCTC2471）、溶藻弧菌Vibrio.alginolyticus（KCCM40513）、创伤弧菌Vibrio.vulnificus（ATCC2126）、美人鱼弧菌Vibrio.dams-ela（ATCC33539）、鳗弧菌Vibrio.anguillarum（KCTC2711）、希瓦氏菌Shewanella oneidensis（KCCM41821）、河豚链球菌Streptococcus iniae（KCTC3657）、杀鲑气单胞菌Aeromonas salm-onicida（MT004）、迟缓爱德华菌Edwardsiella tarda（ATCC15-947）均由韩国釜庆大学疾病预防实验室赠送。 免疫用哈维弧菌2SYX002由大连海洋大学王斌老师惠赠。其他5株哈维弧菌分离株2SYX001、2SYX003、2HWM001、2HWM002和2SYX005均由实验室保存。
试验用Balb/C小白鼠购自大连医科大学SPF实验动物中心。聚乙二醇（PEG1500）、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、碱性磷酸酶（AP）标记的羊抗小鼠Ig、对硝基苯磷酸盐（pNPP）均购自Sigma公司。RPMI-1640培养液、胎牛血清购自HYCLONE公司。
1.2 单克隆抗体的制备
以哈维弧菌2SYX002为抗原，免疫6周龄Balb/C小鼠后取其脾细胞与SP2/0细胞在PEG作用下融合。采用间接ELISA筛选出阳性杂交瘤后，再用有限稀释法获得单克隆细胞株。具体操作方法参照文献[10]。
1.3 单克隆抗体的特性分析
1.3.1 特异性分析。采用间接ELISA法，分别用哈维弧菌2SYX002和 11株参考菌株作为包被抗原，浓度为5×107 cells/mL，单克隆抗体作为一抗，SP2/0上清为阴性对照，具体操作步骤参见文献[11]。
1.3.2 适用性分析。采用间接ELISA法，分别用哈维弧菌
2SYX002和5株哈维弧菌分离株作为包被抗原，浓度为5×107（下转第260页）
（上接第239页）
cells/mL，单克隆抗体作为一抗，SP2/0上清为阴性对照，具体操作步骤参见文献[11]。
1.3.3 效价测定。采用棋盘滴定法对单克隆抗体的效价进行测定。哈维弧菌2SYX002包被浓度为5×107 cells/mL，10倍梯度稀释至5×105 cells/mL。将所得的抗哈维弧菌单克隆抗体原液以2倍比进行稀释至210，进行间接ELISA试验。具体操作步骤参见文献[11]。
2 结果与分析
2.1 杂交瘤细胞株
经筛选和克隆后共获得19株稳定分泌抗哈维弧菌2SYX002单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为1B6、1D6、1A4、5B4、6C6、2E7、4A7、5B2、4E12、1G3、7D7、8E10、4D12、2B9、7D6、6E6、1G2、6G6和2C1。
2.2 单克隆抗体的特异性、适用性及效价
对19株阳性单克隆抗体进行特异性试验，其中1B6、1D6、1A4、5B4、6C6、7D6、6E6 和 6G6 与所有试验菌株反应均为阳性；单抗4A7、4E12、7D7、8E10、4D12和 2B9 只与免疫菌株哈维弧菌 2SYX002 反应；其余5株5B2、 2C1 、1G2、1G3和 2E7与副溶血弧菌、溶藻弧菌、美人鱼弧菌、鳗弧菌、希瓦氏菌及迟缓爱德华菌有不同程度的交叉反应；2C1可以识别所有哈维弧菌的参考菌株及分离株（表1），且只与溶藻弧菌有交叉反应。单克隆抗体5B2、 2C1 、1G2、1G3 、2E7的效价分别为1∶4、1∶256、1∶64、1∶64、1∶128。
3 讨论
本试验用甲醛灭活的哈维弧菌为抗原，运用杂交瘤技术，成功制备并克隆了19株能够稳定分泌抗哈维弧菌 2SYX002单克隆抗体的杂交瘤细胞。特异性试验结果表明，所得的单抗与弧菌属细菌存在较强的交叉反应，其原因可能是由于弧菌属的细菌具有较高的相似度，亲缘关系较近。使用全菌作为抗原于免疫小鼠，与其他弧菌属细菌存在相同抗原。陈昌福等[12]用哈维氏弧菌LPS免疫同腹异育银鲫，发现哈维弧菌、鳗弧菌和溶藻弧菌三者脂多糖有部分相同抗原。在郝贵杰等[13]的研究中，用制得的哈维弧菌单抗的腹水做交叉反应试验结果表明，哈维弧菌与溶藻弧菌、麦氏弧菌和副溶血弧菌的表面抗原就拥有相似的抗原决定簇。
此外，张元兴等在抗迟缓爱德华菌单克隆抗体制备中，分别使用全菌和鞭毛蛋白作为抗原，比较其免疫小鼠效果，发现前者免疫后小鼠抗血清效价较后者低，不适于杂交瘤试验[14]。因此，今后试验中可通过以特异性蛋白为抗原免疫小鼠来提高抗体的特异性。
试验所得的单克隆体的效价与同类文献相比较低，可能是由于检测中使用的抗体为杂交瘤细胞培养液上清。郝贵杰等[15]制备的抗哈维氏弧菌脂多糖单克隆抗体杂交瘤细胞株，其细胞培养液上清ELISA效价为1∶1 600，腹水效价为6.4×104，得到大幅度提高。后续试验中可通过诱生小鼠腹水进一步提高抗体效价。本研究扩充了哈维弧菌单克隆抗体库，为哈维弧菌单克隆抗体的进一步应用提供更多参考数据。
4 参考文献
[1] 陈月忠，钟硕良，周宸.成虾发光病病原体的分离鉴定及防治技术研究[J].中山大学学报，2000，39（增刊1）：218-223.
[2] 刘问，钱冬，杨国梁，等.南美白对虾虾苗淡化期间发光病病原研究 [J].集美大学学报，2004，9（4）：300-304.
[3] 毛芝娟，刘国勇，陈昌福.大黄鱼溃疡病致病菌的初步分离与鉴定[J].安徽农业大学学报，2002，29（2）：178-181.
[4] 陈政强，姚志贤，林茂，等.半滑舌鳎皮肤溃疡病病原研究[J].水产学报，2012，32（5）：764-771.
[5] ZORRILLA I，ARIJO S，CHABRILLON M，et al.Vibrio species isolated from diseased farmed sole，Solea senegalensis（Kaup），and evaluation of the potential virulence role of their extracellular products[J].Fish Dis，2003，26：103-108.
[6] 王斌，于蘭萍，胡亮，等.红鳍东方鲀皮肤溃烂病病原菌的分离与鉴定[J].中国水产科学，2008，15（2）：352-358. [7] AUSTIN B，AUSTIN D A.Bacterial Fish Pathogens[M]//Diseases of Farmed and Wild Fish，3rdedn（revised）.Springer-Praxis，Godalming，1999.
[8] ANA C G，DAVID G B，MACHAEL R H.Molecular identifiction typing and tracking of Vibro harveyi in aquaculture system：Current methed and future prospects[J].Aquaculture，2009，287：1-10.
[9] ROBERTSON P A W，XU H S，AUSTIN B.An enzyme linked immunoso-rbent assay（ELISA）for the detection of Vibrio haryevi in penaeid shrimp and water[J].Journal of Microbiological Mehtods，1998，34：31-39.
[10] 李强，黄华，张显昱，等.鮰爱德华菌单克隆抗体的制备及其在黄颡鱼“红头病”研究中的应用[J].大连海洋大学学报，2014（4）：323-328.
[11] LI QIANG，JING HONG-LI，LI HUA，et al.Characterization and applic-ation of monoclonal antibodies against Shewanella marisflavi，a novel pathogen of Apostichopus japonicus[J].Chinese Journal of Oceanology and Limnology，2011，29（5）：973-980.
[12] 陈昌福，陈超然.鱼类三种致病菌的粗脂多糖对异育银鲫的免疫原性[J].水生生物学报，2002，2（5）：483-488.
[13] 郝贵杰，沈锦玉，徐洋.大黄鱼病原哈维氏弧菌单克隆抗体的制备及其应用[J].细水生生物学报，2009，33（3）：413-417.
[14] LIU Hesong，WANG Yue，XIAO Jingfan.An immunochromatographic test strip for rapid detection of fish pathogen Edwardsiella tarda[J].Bioresour-ces and Bioprocessing，2015（2）：20.
[15] 郝贵杰，沈锦玉，潘晓义.抗哈维氏弧菌脂多糖单克隆抗體的制备及其鉴定[J].上海水产大学学报，2008，17（3）：274-279.
关键词 哈维弧菌；红鳍东方鲀；单克隆抗体；特性分析
中图分类号 S941.4 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2016）08-0239-01
Abstract In this paper， 6-week-old BALB/c mice were immunized with Vibrio harveyi 2SYX002 （isolated from dermal ulcer of Fugu rubripes） for monoclonal antibody preparation. After cell fusion，，screening， sub-cell clone， and so on， 19 hybridoma cell lines were obtained and named（1B6、1D6、1A4、5B4、6C6、2E7、4A7、5B2、4E12、1G3、7D7、8E10、4D12、2B9、7D6、6E6、1G2、6G6 and 2C1）.ELISA results showed that the MAb 1B6、1D6、1A4、5B4、6C6、7D6、6E6 and 6G6 had positive reaction with all of the standard and isolated strains.The mAb of 4A7、4E12、7D7、8E10、4D12 and 2B9 had no crossreaction with other 11 standard bacterial strains， only specific reaction with the immuned bactria. MAb 2E7、5B2，、1G2，、2C1 and 1G3 had cross-reacted with tested strains， such as Vibrio.parahaemolyticus， Vibrio.damsela and so on. Among them， MAb 2C1 only had positive reaction with all strains of Vibrio.harveyi and Vibrio.alginolyticus（the titer was 1：256）， without other 11 standard bacterial strains. The present results provided the basis for the preparation of immunochromatographic test strip to rapid detection Vibrio. harveyi.
Key words Vibrio harveyi；Fugu rubripes；monoclonal antibodies；characteristic analysis.
哈维弧菌（Vibrio harveyi）又称哈氏弧菌，广泛存在于海洋环境中，是海水养殖业中一种常见的致病菌。其宿主十分广泛，是对虾发光病的主要致病菌[1-2]，还可引起多种海水养殖鱼类溃疡病[3-5]，其中红鳍东方鲀皮肤溃烂病，具有传染性较强，死亡率較高的特点。哈维弧菌是该病主要病原菌之一，患病鱼体出现表皮溃烂，伴随全身性出血，病灶处肌肉组织严重液化，肝脏等器官严重损伤，给养殖业带来严重的经济损失。由于哈维弧菌遗传特征和生理生化特征复杂多样，并且与其近缘种在表型上有很高的相似性，依靠传统的检测方法检出率低，而且需依赖专业的技术和设备，耗时长、操作复杂，难以实现对疾病的及时诊断与防治。因此，发展哈维弧菌的快速检测技术在致病性弧菌诊断中有重要意义。基于免疫学原理的荧光抗体技术及酶联免疫吸附技术可以实现快速、特异的检测哈维弧菌。目前，Robertertson等制备了哈维弧菌的多克隆抗体[9]，但多抗血清具有明显的异质性，特异性较差。与之相比，单克隆抗体特异性高，其检测结果更准确可靠。本试验利用灭活的红鳍东方鲀“皮肤溃烂病”病原——哈维弧菌2SYX002作为抗原免疫小鼠，制备了抗哈维弧菌的单克隆抗体，并对其进行了特性分析，为哈维弧菌的快速检测技术的发展提供了物质基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料及试剂
哈维弧菌Vibrio.harveyi（ATCC35084）、灿烂弧菌Vibrio.splendidus（ATCC33125）、副溶血弧菌Vibrio.parahaemolyticus（KCTC2471）、溶藻弧菌Vibrio.alginolyticus（KCCM40513）、创伤弧菌Vibrio.vulnificus（ATCC2126）、美人鱼弧菌Vibrio.dams-ela（ATCC33539）、鳗弧菌Vibrio.anguillarum（KCTC2711）、希瓦氏菌Shewanella oneidensis（KCCM41821）、河豚链球菌Streptococcus iniae（KCTC3657）、杀鲑气单胞菌Aeromonas salm-onicida（MT004）、迟缓爱德华菌Edwardsiella tarda（ATCC15-947）均由韩国釜庆大学疾病预防实验室赠送。 免疫用哈维弧菌2SYX002由大连海洋大学王斌老师惠赠。其他5株哈维弧菌分离株2SYX001、2SYX003、2HWM001、2HWM002和2SYX005均由实验室保存。
试验用Balb/C小白鼠购自大连医科大学SPF实验动物中心。聚乙二醇（PEG1500）、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、碱性磷酸酶（AP）标记的羊抗小鼠Ig、对硝基苯磷酸盐（pNPP）均购自Sigma公司。RPMI-1640培养液、胎牛血清购自HYCLONE公司。
1.2 单克隆抗体的制备
以哈维弧菌2SYX002为抗原，免疫6周龄Balb/C小鼠后取其脾细胞与SP2/0细胞在PEG作用下融合。采用间接ELISA筛选出阳性杂交瘤后，再用有限稀释法获得单克隆细胞株。具体操作方法参照文献[10]。
1.3 单克隆抗体的特性分析
1.3.1 特异性分析。采用间接ELISA法，分别用哈维弧菌2SYX002和 11株参考菌株作为包被抗原，浓度为5×107 cells/mL，单克隆抗体作为一抗，SP2/0上清为阴性对照，具体操作步骤参见文献[11]。
1.3.2 适用性分析。采用间接ELISA法，分别用哈维弧菌
2SYX002和5株哈维弧菌分离株作为包被抗原，浓度为5×107（下转第260页）
（上接第239页）
cells/mL，单克隆抗体作为一抗，SP2/0上清为阴性对照，具体操作步骤参见文献[11]。
1.3.3 效价测定。采用棋盘滴定法对单克隆抗体的效价进行测定。哈维弧菌2SYX002包被浓度为5×107 cells/mL，10倍梯度稀释至5×105 cells/mL。将所得的抗哈维弧菌单克隆抗体原液以2倍比进行稀释至210，进行间接ELISA试验。具体操作步骤参见文献[11]。
2 结果与分析
2.1 杂交瘤细胞株
经筛选和克隆后共获得19株稳定分泌抗哈维弧菌2SYX002单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为1B6、1D6、1A4、5B4、6C6、2E7、4A7、5B2、4E12、1G3、7D7、8E10、4D12、2B9、7D6、6E6、1G2、6G6和2C1。
2.2 单克隆抗体的特异性、适用性及效价
对19株阳性单克隆抗体进行特异性试验，其中1B6、1D6、1A4、5B4、6C6、7D6、6E6 和 6G6 与所有试验菌株反应均为阳性；单抗4A7、4E12、7D7、8E10、4D12和 2B9 只与免疫菌株哈维弧菌 2SYX002 反应；其余5株5B2、 2C1 、1G2、1G3和 2E7与副溶血弧菌、溶藻弧菌、美人鱼弧菌、鳗弧菌、希瓦氏菌及迟缓爱德华菌有不同程度的交叉反应；2C1可以识别所有哈维弧菌的参考菌株及分离株（表1），且只与溶藻弧菌有交叉反应。单克隆抗体5B2、 2C1 、1G2、1G3 、2E7的效价分别为1∶4、1∶256、1∶64、1∶64、1∶128。
3 讨论
本试验用甲醛灭活的哈维弧菌为抗原，运用杂交瘤技术，成功制备并克隆了19株能够稳定分泌抗哈维弧菌 2SYX002单克隆抗体的杂交瘤细胞。特异性试验结果表明，所得的单抗与弧菌属细菌存在较强的交叉反应，其原因可能是由于弧菌属的细菌具有较高的相似度，亲缘关系较近。使用全菌作为抗原于免疫小鼠，与其他弧菌属细菌存在相同抗原。陈昌福等[12]用哈维氏弧菌LPS免疫同腹异育银鲫，发现哈维弧菌、鳗弧菌和溶藻弧菌三者脂多糖有部分相同抗原。在郝贵杰等[13]的研究中，用制得的哈维弧菌单抗的腹水做交叉反应试验结果表明，哈维弧菌与溶藻弧菌、麦氏弧菌和副溶血弧菌的表面抗原就拥有相似的抗原决定簇。
此外，张元兴等在抗迟缓爱德华菌单克隆抗体制备中，分别使用全菌和鞭毛蛋白作为抗原，比较其免疫小鼠效果，发现前者免疫后小鼠抗血清效价较后者低，不适于杂交瘤试验[14]。因此，今后试验中可通过以特异性蛋白为抗原免疫小鼠来提高抗体的特异性。
试验所得的单克隆体的效价与同类文献相比较低，可能是由于检测中使用的抗体为杂交瘤细胞培养液上清。郝贵杰等[15]制备的抗哈维氏弧菌脂多糖单克隆抗体杂交瘤细胞株，其细胞培养液上清ELISA效价为1∶1 600，腹水效价为6.4×104，得到大幅度提高。后续试验中可通过诱生小鼠腹水进一步提高抗体效价。本研究扩充了哈维弧菌单克隆抗体库，为哈维弧菌单克隆抗体的进一步应用提供更多参考数据。
4 参考文献
[1] 陈月忠，钟硕良，周宸.成虾发光病病原体的分离鉴定及防治技术研究[J].中山大学学报，2000，39（增刊1）：218-223.
[2] 刘问，钱冬，杨国梁，等.南美白对虾虾苗淡化期间发光病病原研究 [J].集美大学学报，2004，9（4）：300-304.
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[4] 陈政强，姚志贤，林茂，等.半滑舌鳎皮肤溃疡病病原研究[J].水产学报，2012，32（5）：764-771.
[5] ZORRILLA I，ARIJO S，CHABRILLON M，et al.Vibrio species isolated from diseased farmed sole，Solea senegalensis（Kaup），and evaluation of the potential virulence role of their extracellular products[J].Fish Dis，2003，26：103-108.
[6] 王斌，于蘭萍，胡亮，等.红鳍东方鲀皮肤溃烂病病原菌的分离与鉴定[J].中国水产科学，2008，15（2）：352-358. [7] AUSTIN B，AUSTIN D A.Bacterial Fish Pathogens[M]//Diseases of Farmed and Wild Fish，3rdedn（revised）.Springer-Praxis，Godalming，1999.
[8] ANA C G，DAVID G B，MACHAEL R H.Molecular identifiction typing and tracking of Vibro harveyi in aquaculture system：Current methed and future prospects[J].Aquaculture，2009，287：1-10.
[9] ROBERTSON P A W，XU H S，AUSTIN B.An enzyme linked immunoso-rbent assay（ELISA）for the detection of Vibrio haryevi in penaeid shrimp and water[J].Journal of Microbiological Mehtods，1998，34：31-39.
[10] 李强，黄华，张显昱，等.鮰爱德华菌单克隆抗体的制备及其在黄颡鱼“红头病”研究中的应用[J].大连海洋大学学报，2014（4）：323-328.
[11] LI QIANG，JING HONG-LI，LI HUA，et al.Characterization and applic-ation of monoclonal antibodies against Shewanella marisflavi，a novel pathogen of Apostichopus japonicus[J].Chinese Journal of Oceanology and Limnology，2011，29（5）：973-980.
[12] 陈昌福，陈超然.鱼类三种致病菌的粗脂多糖对异育银鲫的免疫原性[J].水生生物学报，2002，2（5）：483-488.
[13] 郝贵杰，沈锦玉，徐洋.大黄鱼病原哈维氏弧菌单克隆抗体的制备及其应用[J].细水生生物学报，2009，33（3）：413-417.
[14] LIU Hesong，WANG Yue，XIAO Jingfan.An immunochromatographic test strip for rapid detection of fish pathogen Edwardsiella tarda[J].Bioresour-ces and Bioprocessing，2015（2）：20.
[15] 郝贵杰，沈锦玉，潘晓义.抗哈维氏弧菌脂多糖单克隆抗體的制备及其鉴定[J].上海水产大学学报，2008，17（3）：274-279.