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摘要：杂交育种是花生品种改良的主要方法之一，鉴定F1代杂交种子真伪并去除假杂种是杂交育种成功的前提。本研究建立起一套在不影响花生种子活力前提下提取花生F1代杂交种子子叶DNA，并结合Ah-MITE1分子标记鉴定技术，在播种前对花生F1代杂交种子真伪进行鉴定的技术，显著提高了去除假杂种的准确性，将有助于提高花生品种选育的效率。
关键词：花生；种子；杂种鉴定；转座子；AhMITE1；分子标记
中图分类号：S565.203.7 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2015）12-0001-05
花生常规育种方法主要包括引种、系统育种、杂交育种和诱变育种等，其中杂交育种是目前最重要、最有效的育种方法。为培育适宜不同地区种植的优良花生品种，需要采用杂交转育的方法使一些种质的优异性状更加有效地得以利用。理论上讲，通过现有的人工去雄授粉杂交技术获得品种间真杂种F1的概率应该很大，但在实际操作过程中，由于花生花器结构较小、母本去雄不彻底以及自交花未摘除完全等原因导致母本自交形成伪杂种的情况难以避免。随着分子生物学技术的不断发展，利用分子标记对杂种F1代进行鉴定的技术已在花生育种及遗传群体构建中得到广泛应用，提高了育种效率。
微型反向重复转座元件（Miniature Inverted-repeat Transposable Element， MITE）最早由Bureau等在玉米基因组中发现，后续研究证实其广泛分布于单子叶及双子叶植物基因附近或内部。MITE结构与非自主元件相似，具有TIR或TSD结构，但又具有反转录转座元件的高拷贝性。研究发现MITE主要包括Tourist和Stowaway两种类型，通过相应的自主转座元件编码的反转录酶识别TIR序列完成扩张。它插入位点的倾向性以及高度重复性，使其在植物基因表达调控以及遗传进化等方面发挥了重要的作用。MITE元件是在基因组中广泛分布的高度重复序列，其序列本身的多态性也在一定程度上反映基因组的多态性。目前，利用MITE转座元件作为遗传标记，已在水稻、烟草、大麦以及剪股颖等植物的遗传分析中得到应用。在花生方面，Shirasawa等研究了AhMITE1的特征，根据其两端序列开发了一系列AhMITE1引物，并构建了花生高密度遗传图谱。王洁等利用13对AhMITE1分子标记对6个花生杂交组合F.代植株进行鉴定，鉴定结果与表型鉴定结果完全符合，证实AhMITE1分子标记用于花生杂种鉴定的可靠性。王辉等利用33对AhMITE1分子标记对115份花生栽培种及高世代材料进行分析，其中31对引物获得较好的扩增效果，每对引物可扩增1～3条带，在所有分析材料中共扩增产生57条带，其中多态性条带数为54，多态性条带比率为96.49%。这些研究结果均表明AhMITE1分子标记作为一种新型的分子标记，具有操作性强、多态性高、带型简单稳定等其它标记无可比拟的优点，可广泛应用于花生品种鉴定、遗传图谱构建以及分子标记辅助育种等方面的研究。
目前报道的利用分子标记检测花生杂交F1代真伪杂种的方法均是利用F1代植株叶片DNA进行检测，这就要求必须将全部F1代杂交种种植，并待出苗后方能够进行检测。本研究旨在建立起一套在不影响花生种子活力的前提下提取花生F1代杂交种子子叶DNA，并结合AhMITE1分子标记鉴定技术，在播种前对花生F1代杂交种子真伪进行鉴定的技术，以提升花生品种的选育效率。
1 材料与方法
1.1 试验材料
本研究共选用12份花生材料及以其作为亲本杂交收获的F1代种子（表1）。上述亲本及F1代种子均收获于山东省花生研究所莱西实验农场。
1.2 试验方法
1.2.1 基因组DNA提取将12份花生亲本及Fi代种子编号后，在保证不破坏种子结构的情况下用刀片分别从每个种子远胚端切取约0.5mm厚子叶，置于对应编号的2mL离心管中，加入液氮后用研磨棒研磨成粉末。基因组DNA提取采用改良小量CTAB法。向每个装有花生子叶粉末的离心管中加入400μL已经预热到65℃的CTAB提取液，充分混匀后65℃水浴20min。然后加入400μL体积比为25： 24：1的酚一氯仿一异戊醇溶液或体积比为24：1的氯仿一异戊醇溶液（比较其纯化效果），颠倒混匀，12000r/min离心10min后，转移上清液到新的1.5mL离心管中。加入-20C预冷的异丙醇400μL，混匀后- 20℃沉淀20min。12000r/min离心10min后，用70%乙醇清洗，室温干燥DNA后加入TE溶液50μL，并置于-20℃保存待用。
1.2.2 PCR扩增体系及程序 AhMITEl-PCR反应体系为10μL，含2×Taq PCR MasterMix[天根生化科技（北京）有限公司]5μL、正向和反向引物（10μmol/L）各0.4μL、DNA 20ng。PCR程序为940C预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s.72℃延伸45s，共38个循环；72℃最后延伸10min。检测所使用的10对AhMITE1分子标记引物（表2）均来自Shirasawa等。
1.2.3 PCR扩增产物的电泳检测 PCR产物使用2%琼脂糖凝胶进行电泳（电泳缓冲液0.5×TBE，电压120V，时间45min），凝胶成像系统（上海天能科技有限公司）观察并拍照。
1.3 真伪杂种鉴定标准
在分子鉴定中，表现父母本杂合带型的F1代种子为真杂种，仅表现母本带型的为伪杂种。 2 结果与分析
2.1 DNA质量检测
本试验提取花生种子基因组DNA采用改良小量CTAB法，纯化过程分别使用酚一氯仿一异戊醇（25： 24：1）和氯仿一异戊醇（24：1）进行纯化。前者上清液加入异丙醇后析出少量沉淀，70%乙醇漂洗晾干加入TE溶液后完全溶解；而后者上清液加入异丙醇后析出大量沉淀，加入TE溶液后沉淀无法完全溶解。琼脂糖凝胶电泳结果（图1）显示，酚一氯仿一异戊醇纯化的DNA杂质较少，而氯仿一异戊醇纯化的DNA中含有大量的蛋白质等杂质。后续试验发现用前者DNA为模板可以成功地进行PCR扩增检测，而用后者DNA作为模板无法进行PCR检测，将后者DNA样品用酚一氯仿一异戊醇重新抽提沉淀并溶解后作为模板可以正常进行PCR检测。这是由于花生子叶中含有大量的蛋白质及脂肪等物质，单纯使用氯仿一异戊醇抽提得到的DNA样品中含有大量杂质，抑制Taq酶活性导致PCR扩增受阻，因此没有扩增产物，而酚一氯仿一异戊醇去除蛋白质等杂质的能力更强，因此在提取花生种子DNA的过程中必须使用酚一氯仿一异戊醇进行纯化。
2.2 亲本间AhMITE1标记多态性分析
利用12个亲本材料对本实验室已合成的部分AhMITE1标记引物进行筛选（图2），选取扩增条带清晰、片段大小在100～500bp之间、父母本间存在明显差异的共显性标记用于F1代杂种鉴定。分子标记筛选结果见表1。
2.3 F1代杂交种AhMITE1标记分析
按表1所示，利用不同的AhMITE1标记引物分别对11个杂交组合的F1代种子进行鉴定，部分鉴定图谱见图3。对各杂交组合的鉴定图谱进行分析，仅表现为母本带型的为伪杂种，表现出父母本杂合带型的为真杂种，计算得到各杂交组合的真杂种率（表3）。其中A1、A2、A6、A8真杂种率较高，达到50%以上，其余组合真杂种率均在50%以下，A10组合真杂种率最低，仅为3.2%。本研究还对同一双仁果中的不同籽仁进行比较，A1、A4、A6、A8、A10、A11组合双仁果中的两个Fi种子均表现为同样的带型，即同为真杂种或伪杂种；而A3、A5组合及A2、A7、A9组合分别有1个或2个双仁果中的两个Fi种子带型不相同，即一个为真杂种另一个为伪杂种。这种结果可能是由于杂交前母本去雄不彻底造成的。
3 结论与讨论
杂交技术在现今的花生育种以及遗传群体构建过程中已广泛使用，但由于各种因素影响，花生Fi代杂交种真杂种率较低。目前对花生F1代杂交种进行鉴定的方法均使用F1代植株叶片DNA，需要将所有杂交种子种植，待出苗后方能进行检测。本研究采用小量CTAB法从花生种子子叶中提取DNA，在不影响种子活力的前提下提取F1代杂交种子DNA，并结合AhMITE1分子标记鉴定技术，在播种前对杂交种子真伪进行鉴定，可以提前去除假杂种，显著提高F1代去杂的准确率，大大降低花生材料的取样及种植成本。
花生子房内有一至数个胚珠，胚珠横生。史春艳等通过对四粒红花生双受精过程进行观察发现，胚珠受精的顺序是从上到下，不是同时受精。这说明花生同一子房中的不同胚珠受精过程是相互独立的。本研究重点针对同一双仁果中不同籽仁进行分析，其中大部分双仁果中的两个F1代杂交种子均同为真杂种或伪杂种，但仍有小部分双仁果中两个F1代杂交种子一真一伪。这种情况可能是由于授粉前去雄不彻底等原因造成母本与父本花粉同时结合在母本柱头上，进入子房，并分别进入不同的胚珠。因此，在对花生F1代杂交种子进行真伪鉴定时，应对每一个F1代杂交种子进行编号检测。
关键词：花生；种子；杂种鉴定；转座子；AhMITE1；分子标记
中图分类号：S565.203.7 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2015）12-0001-05
花生常规育种方法主要包括引种、系统育种、杂交育种和诱变育种等，其中杂交育种是目前最重要、最有效的育种方法。为培育适宜不同地区种植的优良花生品种，需要采用杂交转育的方法使一些种质的优异性状更加有效地得以利用。理论上讲，通过现有的人工去雄授粉杂交技术获得品种间真杂种F1的概率应该很大，但在实际操作过程中，由于花生花器结构较小、母本去雄不彻底以及自交花未摘除完全等原因导致母本自交形成伪杂种的情况难以避免。随着分子生物学技术的不断发展，利用分子标记对杂种F1代进行鉴定的技术已在花生育种及遗传群体构建中得到广泛应用，提高了育种效率。
微型反向重复转座元件（Miniature Inverted-repeat Transposable Element， MITE）最早由Bureau等在玉米基因组中发现，后续研究证实其广泛分布于单子叶及双子叶植物基因附近或内部。MITE结构与非自主元件相似，具有TIR或TSD结构，但又具有反转录转座元件的高拷贝性。研究发现MITE主要包括Tourist和Stowaway两种类型，通过相应的自主转座元件编码的反转录酶识别TIR序列完成扩张。它插入位点的倾向性以及高度重复性，使其在植物基因表达调控以及遗传进化等方面发挥了重要的作用。MITE元件是在基因组中广泛分布的高度重复序列，其序列本身的多态性也在一定程度上反映基因组的多态性。目前，利用MITE转座元件作为遗传标记，已在水稻、烟草、大麦以及剪股颖等植物的遗传分析中得到应用。在花生方面，Shirasawa等研究了AhMITE1的特征，根据其两端序列开发了一系列AhMITE1引物，并构建了花生高密度遗传图谱。王洁等利用13对AhMITE1分子标记对6个花生杂交组合F.代植株进行鉴定，鉴定结果与表型鉴定结果完全符合，证实AhMITE1分子标记用于花生杂种鉴定的可靠性。王辉等利用33对AhMITE1分子标记对115份花生栽培种及高世代材料进行分析，其中31对引物获得较好的扩增效果，每对引物可扩增1～3条带，在所有分析材料中共扩增产生57条带，其中多态性条带数为54，多态性条带比率为96.49%。这些研究结果均表明AhMITE1分子标记作为一种新型的分子标记，具有操作性强、多态性高、带型简单稳定等其它标记无可比拟的优点，可广泛应用于花生品种鉴定、遗传图谱构建以及分子标记辅助育种等方面的研究。
目前报道的利用分子标记检测花生杂交F1代真伪杂种的方法均是利用F1代植株叶片DNA进行检测，这就要求必须将全部F1代杂交种种植，并待出苗后方能够进行检测。本研究旨在建立起一套在不影响花生种子活力的前提下提取花生F1代杂交种子子叶DNA，并结合AhMITE1分子标记鉴定技术，在播种前对花生F1代杂交种子真伪进行鉴定的技术，以提升花生品种的选育效率。
1 材料与方法
1.1 试验材料
本研究共选用12份花生材料及以其作为亲本杂交收获的F1代种子（表1）。上述亲本及F1代种子均收获于山东省花生研究所莱西实验农场。
1.2 试验方法
1.2.1 基因组DNA提取将12份花生亲本及Fi代种子编号后，在保证不破坏种子结构的情况下用刀片分别从每个种子远胚端切取约0.5mm厚子叶，置于对应编号的2mL离心管中，加入液氮后用研磨棒研磨成粉末。基因组DNA提取采用改良小量CTAB法。向每个装有花生子叶粉末的离心管中加入400μL已经预热到65℃的CTAB提取液，充分混匀后65℃水浴20min。然后加入400μL体积比为25： 24：1的酚一氯仿一异戊醇溶液或体积比为24：1的氯仿一异戊醇溶液（比较其纯化效果），颠倒混匀，12000r/min离心10min后，转移上清液到新的1.5mL离心管中。加入-20C预冷的异丙醇400μL，混匀后- 20℃沉淀20min。12000r/min离心10min后，用70%乙醇清洗，室温干燥DNA后加入TE溶液50μL，并置于-20℃保存待用。
1.2.2 PCR扩增体系及程序 AhMITEl-PCR反应体系为10μL，含2×Taq PCR MasterMix[天根生化科技（北京）有限公司]5μL、正向和反向引物（10μmol/L）各0.4μL、DNA 20ng。PCR程序为940C预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s.72℃延伸45s，共38个循环；72℃最后延伸10min。检测所使用的10对AhMITE1分子标记引物（表2）均来自Shirasawa等。
1.2.3 PCR扩增产物的电泳检测 PCR产物使用2%琼脂糖凝胶进行电泳（电泳缓冲液0.5×TBE，电压120V，时间45min），凝胶成像系统（上海天能科技有限公司）观察并拍照。
1.3 真伪杂种鉴定标准
在分子鉴定中，表现父母本杂合带型的F1代种子为真杂种，仅表现母本带型的为伪杂种。 2 结果与分析
2.1 DNA质量检测
本试验提取花生种子基因组DNA采用改良小量CTAB法，纯化过程分别使用酚一氯仿一异戊醇（25： 24：1）和氯仿一异戊醇（24：1）进行纯化。前者上清液加入异丙醇后析出少量沉淀，70%乙醇漂洗晾干加入TE溶液后完全溶解；而后者上清液加入异丙醇后析出大量沉淀，加入TE溶液后沉淀无法完全溶解。琼脂糖凝胶电泳结果（图1）显示，酚一氯仿一异戊醇纯化的DNA杂质较少，而氯仿一异戊醇纯化的DNA中含有大量的蛋白质等杂质。后续试验发现用前者DNA为模板可以成功地进行PCR扩增检测，而用后者DNA作为模板无法进行PCR检测，将后者DNA样品用酚一氯仿一异戊醇重新抽提沉淀并溶解后作为模板可以正常进行PCR检测。这是由于花生子叶中含有大量的蛋白质及脂肪等物质，单纯使用氯仿一异戊醇抽提得到的DNA样品中含有大量杂质，抑制Taq酶活性导致PCR扩增受阻，因此没有扩增产物，而酚一氯仿一异戊醇去除蛋白质等杂质的能力更强，因此在提取花生种子DNA的过程中必须使用酚一氯仿一异戊醇进行纯化。
2.2 亲本间AhMITE1标记多态性分析
利用12个亲本材料对本实验室已合成的部分AhMITE1标记引物进行筛选（图2），选取扩增条带清晰、片段大小在100～500bp之间、父母本间存在明显差异的共显性标记用于F1代杂种鉴定。分子标记筛选结果见表1。
2.3 F1代杂交种AhMITE1标记分析
按表1所示，利用不同的AhMITE1标记引物分别对11个杂交组合的F1代种子进行鉴定，部分鉴定图谱见图3。对各杂交组合的鉴定图谱进行分析，仅表现为母本带型的为伪杂种，表现出父母本杂合带型的为真杂种，计算得到各杂交组合的真杂种率（表3）。其中A1、A2、A6、A8真杂种率较高，达到50%以上，其余组合真杂种率均在50%以下，A10组合真杂种率最低，仅为3.2%。本研究还对同一双仁果中的不同籽仁进行比较，A1、A4、A6、A8、A10、A11组合双仁果中的两个Fi种子均表现为同样的带型，即同为真杂种或伪杂种；而A3、A5组合及A2、A7、A9组合分别有1个或2个双仁果中的两个Fi种子带型不相同，即一个为真杂种另一个为伪杂种。这种结果可能是由于杂交前母本去雄不彻底造成的。
3 结论与讨论
杂交技术在现今的花生育种以及遗传群体构建过程中已广泛使用，但由于各种因素影响，花生Fi代杂交种真杂种率较低。目前对花生F1代杂交种进行鉴定的方法均使用F1代植株叶片DNA，需要将所有杂交种子种植，待出苗后方能进行检测。本研究采用小量CTAB法从花生种子子叶中提取DNA，在不影响种子活力的前提下提取F1代杂交种子DNA，并结合AhMITE1分子标记鉴定技术，在播种前对杂交种子真伪进行鉴定，可以提前去除假杂种，显著提高F1代去杂的准确率，大大降低花生材料的取样及种植成本。
花生子房内有一至数个胚珠，胚珠横生。史春艳等通过对四粒红花生双受精过程进行观察发现，胚珠受精的顺序是从上到下，不是同时受精。这说明花生同一子房中的不同胚珠受精过程是相互独立的。本研究重点针对同一双仁果中不同籽仁进行分析，其中大部分双仁果中的两个F1代杂交种子均同为真杂种或伪杂种，但仍有小部分双仁果中两个F1代杂交种子一真一伪。这种情况可能是由于授粉前去雄不彻底等原因造成母本与父本花粉同时结合在母本柱头上，进入子房，并分别进入不同的胚珠。因此，在对花生F1代杂交种子进行真伪鉴定时，应对每一个F1代杂交种子进行编号检测。