论文部分内容阅读
摘 要：探讨保健品微生物检验新方法在菌落总数、大肠杆菌、霉菌和酵母菌、及金黄色葡萄球菌等致病菌的计数和定性检验中新方法应用的可能性。针对保健品目前的检验方法沿用食品检验方法和药品检验方法标准，分别对菌落总数、大肠杆菌、霉菌和酵母菌、及金黄色葡萄球菌、枯草杆菌等致病菌有明显的不同程度的抑制作用。简单按照食品微生物学检验方法的国家标准，不能如实反映产品质量，建议参照药品检验的标准方法采用新方法新技术改进方法标准，通过方法验证实验改进检验方法标准。
关键词：保健品；检验；新方法；应用
按现行管理要求，保健品微生物学检验方法应按照GB/ T4789-2010食品卫生微生物学检验方法标准进行。按《中国药典》2005年版中的检验方法标准检验，保健品微生物污染问题比较突出，仅从我们日常检验工作中微生物检验结果不合格的产品，占到总检驗批次10%左右。这说明保健品的微生物学检验是保证其产品品质和消费者食用安全的重要指标。按国标方法检验与采用验证过的方法检验结果迥异，其中包括菌落总数超标和致病菌检查不合格等情况。这说明革新检验技术的重要性。保健品常见类型包括口服液、剂、胶囊、茶剂等，完善保健品微生物检验方法是必要的，采用革新检验方法是更合理。
1 现有保健品检验方法分析
1.1 现有保健品检验方法概述
现有保健品检验标准采用国家标准，其中检验大肠杆菌采用的原理为涂片染色镜检，致病菌检测为分离培养及生化、血清鉴定，抗原测定以及动物试验等[1]。这些方法都有可能因为保健品中的药用成分导致计数和定性的不准确。
1.2 现有保健品检验方法局限性分析
由于保健食品通常含有功效成分、提取物或化学添加物有关，这些成分造成保健品与中成药的抑菌活性相似[2]。其处方中含叶黄素、蜂王浆冻干粉、维生素c、沙棘、山楂、蜂胶液等，这些成分本身或者所造成的环境，可能在检验条件下影响细菌生长，应该在检验过程中采用培养基稀释法或薄膜过滤法消除或降低抑菌活性，以使得检验结果更加科学、合理、可靠[3]。
2 保健品微生物检验新方法应用
2.1 金黄色葡萄球菌的检测：乳胶凝集反应
此方法利用抗原与抗体特异性结合的特性，加上人工大分子的乳胶颗粒而发生肉眼可见的凝集反应[4，5]。金黄色葡萄球菌的检测：该试剂盒中含有对免疫抗蛋了的基因探针与靶细胞杂交后能用特定的方法进行细菌蛋白AlgG和鞭毛蛋白敏感的聚苯乙烯乳胶粒子，细菌蛋白A和lgG结合，凝聚酶和鞭毛抗原结合，含有金黄色葡萄球菌的样品加入试剂盒中后l分钟内将产生凝集反应[6，7，8]。该法的灵敏度和特异性均非常高。能有效减少样品中的其他成分的干扰。
2.2 酶联免疫吸附法（IILSA）
这是用于定性或定量测定特异抗原体的一种技术，它多采用“夹心式”设计，即用抗体包被的聚苯乙烯孔捕获抗原，用另一个结合了酶的抗体与抗原结合形成抗原抗体复合物，再用一种生色酶底物通过肉眼观察或比色法记录结果[9，10]。
2.3 基因探针法
基因探针是能识别特异碱基序列（基因）的一段单链DNA或RNA分子，经标记了的基因探针与靶细胞杂交后能用特定的方法进行检测[11]。
2.4 聚合酶链反应（PCR）
它以待检测的核昔酸链为模板，由人工合成的寡核昔酸介导，通过核酸聚合酶促反应快速扩增核酸序列[12]。PCR技术在食品卫生微生物检验中的应用很广泛，可直接检测标本中的大肠杆菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、肉毒梭菌、乳酸杆菌等食品中常见的微生物[13，14]。利用PCR检测食品中的微生物，多数情况下因样品中存在着不同程度的干扰因子或抑制因子，影响PCR的扩增效率，导致假结果的产生[15，16]。
3 综述
上述情况表明，按国标GB/ T4789-2003食品卫生微生物学检验方法对保健食品进行微生物检验存在局限性，从保障对保健品服用者的安全性出发，应在保健食品卫生微生物检验中进行方法的有效性确认，尤其注册检验，要充分重视方法学研究，即方法验证；建议结合《中国药典》的有关要求，增加阳性对照菌株和方法验证的要求，采用方法乳胶凝集反应、酶联免疫吸附法（IILSA）、基因探针法、聚合酶链反应。
参考文献
[1]付玉生.1257份保健食品微生物污染状况及影响探讨[J].中国卫生检验杂志，2014，23（2）：489-491.
[2]王岚，刘建琪，张红，等.湖南省保健食品微生物检测结果分析[J].中国卫生检验杂志，2015，19（9）：2053-2054.
[3]Donald WW，Harrison B，Crawford C，et al. Current microbiologicalstatus of “ health foods” sold in Canada [J]. Int J Food Microbiol，2015，42：1-7.
[4]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.GB4789.2-2010食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测[5].北京：中国标准出版社，2015.
[5]Scazzocchio F，D'Auria F D，Alessandrini D，et al. Multifactorialaspects of antimicrobial activity of propolis [J]. Microbiol Res，2014，161（4）：327-333.
[6]Tim Cushnie T P，Lamb A J. Antimicrobial activity of flavonoids[J]. Int J Antimicrob Agents，2015，26（5）：343-356.
[7]Cutler R R，Wilson P. Antibacterial activity of a new，stable，aque-ous extract of allicin against methicillin-resistant Staphylococcus au-reus[J]. Br J Biomed Sci，2014，61（2）：1-4.
[8]Hammer K A，Carson C F，Riley T V，et al. Antimicrobial activity of essential oils and other plant extracts[J]. J Appl Microbiol，2014，86（6）：985-990.
[9]国家药典委员会.中国药典2005年版二部[M].北京：化学工业出版社，2015：109-115.
[10]王似锦，刘文杰，牛振东，等.金匮肾气丸微生物限度检查法的建立及检验结果分析[J].药物分析杂志，2014，32（2）：360-364.
[11]刘鹏，马仕洪，戴翚，等.普那霉素片微生物限度检查方法的建立[J].药物分析杂志，2010，30（2）：303-306.
[12]裴小捷，韩超，杜风梅，等.聚山梨酯80对盐酸布替萘芬乳膏微生物限度方法学验证影响的研究[J].食品与药品，2009，11（9）：31-33.
[13]特玉香，王文捷，祁文娟，等.保健（功能）食品卫生微生物学检验方法的探讨[J].中国药事，2008，22（7）：594-597.
[14]特玉香，古丽巴哈尔托乎提，杨洪森，等.保健食品微生物限度检查的方法学验证[J].药物分析杂志，2008，28（2）：270-274.
[15]高新贞，陈静，白秀萍，等.药品微生物限度检查验证方法在保健品中的应用研究[J].食品与药品，2010，12（11）：433-436.
[16]国家药典委员会.中国药典2010年版一部[M].北京：中国医药科技出版社，2010：附录80-附录86.
关键词：保健品；检验；新方法；应用
按现行管理要求，保健品微生物学检验方法应按照GB/ T4789-2010食品卫生微生物学检验方法标准进行。按《中国药典》2005年版中的检验方法标准检验，保健品微生物污染问题比较突出，仅从我们日常检验工作中微生物检验结果不合格的产品，占到总检驗批次10%左右。这说明保健品的微生物学检验是保证其产品品质和消费者食用安全的重要指标。按国标方法检验与采用验证过的方法检验结果迥异，其中包括菌落总数超标和致病菌检查不合格等情况。这说明革新检验技术的重要性。保健品常见类型包括口服液、剂、胶囊、茶剂等，完善保健品微生物检验方法是必要的，采用革新检验方法是更合理。
1 现有保健品检验方法分析
1.1 现有保健品检验方法概述
现有保健品检验标准采用国家标准，其中检验大肠杆菌采用的原理为涂片染色镜检，致病菌检测为分离培养及生化、血清鉴定，抗原测定以及动物试验等[1]。这些方法都有可能因为保健品中的药用成分导致计数和定性的不准确。
1.2 现有保健品检验方法局限性分析
由于保健食品通常含有功效成分、提取物或化学添加物有关，这些成分造成保健品与中成药的抑菌活性相似[2]。其处方中含叶黄素、蜂王浆冻干粉、维生素c、沙棘、山楂、蜂胶液等，这些成分本身或者所造成的环境，可能在检验条件下影响细菌生长，应该在检验过程中采用培养基稀释法或薄膜过滤法消除或降低抑菌活性，以使得检验结果更加科学、合理、可靠[3]。
2 保健品微生物检验新方法应用
2.1 金黄色葡萄球菌的检测：乳胶凝集反应
此方法利用抗原与抗体特异性结合的特性，加上人工大分子的乳胶颗粒而发生肉眼可见的凝集反应[4，5]。金黄色葡萄球菌的检测：该试剂盒中含有对免疫抗蛋了的基因探针与靶细胞杂交后能用特定的方法进行细菌蛋白AlgG和鞭毛蛋白敏感的聚苯乙烯乳胶粒子，细菌蛋白A和lgG结合，凝聚酶和鞭毛抗原结合，含有金黄色葡萄球菌的样品加入试剂盒中后l分钟内将产生凝集反应[6，7，8]。该法的灵敏度和特异性均非常高。能有效减少样品中的其他成分的干扰。
2.2 酶联免疫吸附法（IILSA）
这是用于定性或定量测定特异抗原体的一种技术，它多采用“夹心式”设计，即用抗体包被的聚苯乙烯孔捕获抗原，用另一个结合了酶的抗体与抗原结合形成抗原抗体复合物，再用一种生色酶底物通过肉眼观察或比色法记录结果[9，10]。
2.3 基因探针法
基因探针是能识别特异碱基序列（基因）的一段单链DNA或RNA分子，经标记了的基因探针与靶细胞杂交后能用特定的方法进行检测[11]。
2.4 聚合酶链反应（PCR）
它以待检测的核昔酸链为模板，由人工合成的寡核昔酸介导，通过核酸聚合酶促反应快速扩增核酸序列[12]。PCR技术在食品卫生微生物检验中的应用很广泛，可直接检测标本中的大肠杆菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、肉毒梭菌、乳酸杆菌等食品中常见的微生物[13，14]。利用PCR检测食品中的微生物，多数情况下因样品中存在着不同程度的干扰因子或抑制因子，影响PCR的扩增效率，导致假结果的产生[15，16]。
3 综述
上述情况表明，按国标GB/ T4789-2003食品卫生微生物学检验方法对保健食品进行微生物检验存在局限性，从保障对保健品服用者的安全性出发，应在保健食品卫生微生物检验中进行方法的有效性确认，尤其注册检验，要充分重视方法学研究，即方法验证；建议结合《中国药典》的有关要求，增加阳性对照菌株和方法验证的要求，采用方法乳胶凝集反应、酶联免疫吸附法（IILSA）、基因探针法、聚合酶链反应。
参考文献
[1]付玉生.1257份保健食品微生物污染状况及影响探讨[J].中国卫生检验杂志，2014，23（2）：489-491.
[2]王岚，刘建琪，张红，等.湖南省保健食品微生物检测结果分析[J].中国卫生检验杂志，2015，19（9）：2053-2054.
[3]Donald WW，Harrison B，Crawford C，et al. Current microbiologicalstatus of “ health foods” sold in Canada [J]. Int J Food Microbiol，2015，42：1-7.
[4]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.GB4789.2-2010食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测[5].北京：中国标准出版社，2015.
[5]Scazzocchio F，D'Auria F D，Alessandrini D，et al. Multifactorialaspects of antimicrobial activity of propolis [J]. Microbiol Res，2014，161（4）：327-333.
[6]Tim Cushnie T P，Lamb A J. Antimicrobial activity of flavonoids[J]. Int J Antimicrob Agents，2015，26（5）：343-356.
[7]Cutler R R，Wilson P. Antibacterial activity of a new，stable，aque-ous extract of allicin against methicillin-resistant Staphylococcus au-reus[J]. Br J Biomed Sci，2014，61（2）：1-4.
[8]Hammer K A，Carson C F，Riley T V，et al. Antimicrobial activity of essential oils and other plant extracts[J]. J Appl Microbiol，2014，86（6）：985-990.
[9]国家药典委员会.中国药典2005年版二部[M].北京：化学工业出版社，2015：109-115.
[10]王似锦，刘文杰，牛振东，等.金匮肾气丸微生物限度检查法的建立及检验结果分析[J].药物分析杂志，2014，32（2）：360-364.
[11]刘鹏，马仕洪，戴翚，等.普那霉素片微生物限度检查方法的建立[J].药物分析杂志，2010，30（2）：303-306.
[12]裴小捷，韩超，杜风梅，等.聚山梨酯80对盐酸布替萘芬乳膏微生物限度方法学验证影响的研究[J].食品与药品，2009，11（9）：31-33.
[13]特玉香，王文捷，祁文娟，等.保健（功能）食品卫生微生物学检验方法的探讨[J].中国药事，2008，22（7）：594-597.
[14]特玉香，古丽巴哈尔托乎提，杨洪森，等.保健食品微生物限度检查的方法学验证[J].药物分析杂志，2008，28（2）：270-274.
[15]高新贞，陈静，白秀萍，等.药品微生物限度检查验证方法在保健品中的应用研究[J].食品与药品，2010，12（11）：433-436.
[16]国家药典委员会.中国药典2010年版一部[M].北京：中国医药科技出版社，2010：附录80-附录86.