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摘 要 本研究以金线莲组培苗茎段为试材，采用“二加二”法，即“两步诱导”（1. 利用暗培养诱导出白化茎段;2. 由白化茎段诱导类原球茎）加“两步增殖”（1. 新诱导的类原球茎在诱导培养基上培养3周;2. 利用L16（45）正交试验优选增殖培养方案）的方法，研究外植体来源、外植体处理方式、暗培养时间、培养基及附加成分对类原球茎诱导的影响，以及培养时间、光照强度、紫外光照射时间对类原球茎增殖的影响，并比较“二加二”法与传统单步法的培养效果。结果表明，适宜白化茎段诱导类原球茎的培养基为MS + 2.5 mg/L 6-BA +0.2 mg/L NAA +1.0 mg/L S3307。黑暗腋生白化茎段是最佳外植体，最佳处理方式为整个茎段平放，3周暗培养得到的白化茎段能够显著提高类原球茎的诱导率。增殖培养5个因素对结果的影响顺序为：NH4+/NO3?>NAA浓度>6-BA浓度>S3307浓度>蔗糖浓度。最佳配比为MS+0.5 mg/L S3307+4.0 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA+ NH4+/NO3?（15 mmol∶45 mmol）+ 蔗糖40 g/L，可获得增殖鲜重为246.90 g/L。增殖培养最佳时间6周。光照强度500 lx和253.7 nm紫外光每天照射6 h连续6周适宜类原球茎的增殖和总黄酮的积累。利用“二加二”法建立了金线莲类原球茎高效培养新体系，该体系诱导率、初始材料扩大倍数、增殖倍数均高于传统单步诱导法。92%的类原球茎能够稳定增殖，不发生分化和愈伤组织化。
关键词 金线莲;类原球茎;高效体系;诱导;总黄酮
中图分类号 Q 949.9;S567.239 文献标识码 A
金线莲（金线兰），学名花叶开唇兰[Anoecto chilus roxburghii （Wall.） Lindl.]，是兰科开唇兰属珍稀药用植物。近年来，其保肝护肝、抗氧化、抗衰老、提高机体免疫力等药用价值，已引起人们的广泛关注[1-3]。自然环境的恶化和人们的过度采挖，使得野生金線莲资源严重匮乏，药材资源供不应求。原球茎是兰科等科属的植物繁殖过程中的一种特殊的胚状结构，组织培养可培育类似原球茎的结构，称为“类原球茎”（protocorm-like bodies，PLBs）。类原球茎培养具有繁殖效率较高，培养周期短的优点。利用组织培养的方法培养类原球茎并从中提取药用植物有效成分是扩大药材资源，拓展药材利用的有效手段。
金线莲类原球茎组织培养已有部分研究[4-6]，研究内容局限于类原球茎的诱导与增殖的培养基配方[7]，以及不同添加物和不同培养条件对类原球茎诱导的影响[8-9]，近年来拓展到用类原球茎生产次生代谢产物的研究[10]。以往研究都是通过单步直接诱导，大致分为两种途径：一种是从种子直接获得原球茎[6-7]再进行增殖，但金线莲资源不足，种子量有限，大量应用难以满足生产需求;第二种是从组培苗茎段或茎节直接诱导类原球茎[5， 8]。此途径应用较广，但仍存在许多问题：如初代诱导困难，诱导率低[8， 11-12]。王建勤等[12]利用茎节做接种材料诱导率仅为66%。封应丽等[8]的研究中诱导率提升至73%。韩晓红等[13]以茎段切片为外植体，初步提高材料利用率，诱导率为81%，但仍不够理想。此外，类原球茎增殖培养中常遇到“类原球茎稳定性较差，易分化，易愈伤组织化”的问题[11， 13-14]，严重降低其增殖效率，限制类原球茎培养体系在生产次生代谢产物领域的应用。因此，本研究拟探索一种新的方法，即“两步诱导”加“两步增殖”的方法，简称“二加二”法，先诱导白化茎段再诱导类原球茎并使其高效增殖，以期提高诱导率，同时数倍提高初始材料利用率，并进一步构建能够稳定增殖的类原球茎培养系统，为金线莲类原球茎生产药用成分的研究奠定基础，也作为兰科植物的原球茎培养等相关研究的参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料 金线莲品种为“福建尖叶”，带根组培植株采购于福建金草公司，切取茎段后在本实验室经过连续1 a的继代培养，获得长势基本一致的金线莲组培继代植株。
1.1.2 试剂 植物生长调节剂6-苄氨基腺嘌呤（6-Benzylaminopurine，6-BA）、萘乙酸（1-Naphthaleneacetic acid，NAA）、玉米素（Zeatin，ZT）、2，4-二氯苯氧乙酸（2，4- Dichlorophenoxyacet ic acid，2，4-D）、激动素（Kinetin，KT）、噻苯隆（Thiazuron，TDZ）、烯效唑（Uniconazole， S3307），购自上海生工生物工程有限公司。对照品为芦丁（BBI），化学试剂亚硝酸钠（科密欧），硝酸铝（科密欧）。
1.1.3 仪器 苏净安泰SW-CJ-2FD型超净台，苏州安泰空气技术有限公司;SJC-Ⅱ型紫外线杀菌车，北京好特光紫外线科技有限公司;SPX-250I-G型微电脑人工气候箱，上海博讯实业有限公司;ZHWY-1102C型恒温培养振荡器，上海智诚分析仪器制造有限公司;UV-5200型紫外-可见分光光度计，上海元析仪器有限公司。
1.2 方法
1.2.1 “两步诱导”法诱导类原球茎 第一步：外植体的获得。切取金线莲组培继代植株的茎段（外植体来源实验除外），每茎段带1至2个节，放置于B1培养基（MS + 6-BA 2.0 mg/L +NAA 1.0 mg/L，蔗糖30 g/L，琼脂8 g/L）中，温度27 ℃，黑暗培养3周后（黑暗培养时间试验除外），收获白化茎段。 第二步：类原球茎的诱导。切取长度為1 cm的白化茎段（每茎段带一个节），放置于培养基Y1～Y9（待筛选）中，每瓶放置外植体14个，每处理6瓶，重复3次。光照500 lx，光照时间12 h，培养4周，收获类原球茎。Y培养基的筛选：比较9种不同的诱导培养基（表1），4周后比较类原球茎的诱导率和诱导个数。诱导率=每处理诱导出类原球茎的外植体数/接种外植体数×100%;平均诱导PLB个数=每处理诱导类原球茎的个数/接种外植体数。
1.2.2 “两步增殖”法使类原球茎增殖 第一步，将“两步诱导”法得到的类原球茎切分为单个小球，接种到新的诱导培养基（Y）中培养3周;第二步，将增殖培养第一步得到的类原球茎切割为直径5 mm左右的小块，将其放置于液体培养基中，每150 mL三角瓶接种50 g，每处理6瓶，采用L16（45）正交试验设计对培养基中激素含量、蔗糖含量以及N素比（NH4+∶NO3?）进行比较，筛选适宜的增殖培养基配方。6周后统计类原球茎的鲜重增长量，鲜重增长量（g）=[每处理获得的类原球茎质量（g）?每处理起始类原球茎接种质量（g）]/每处理样本数。正交试验的表头设计见表2。
1.2.3 外植体的不同来源比较试验 分别选用普通组培苗茎段，经暗处理3周的组培苗茎段，光照条件下腋生茎段，黑暗3周后腋生的白化茎段，4种不同的外植体来源进行比较，按照1.2.1第二步的培养基Y进行培养，再4周后，统计类原球茎的诱导率。
1.2.4 诱导培养中黑暗处理时间试验 采用0、1、2、3、4、5周的暗培养，诱导出白化茎段，将白化茎段放置于培养基为Y1，再4周后比较各处理的诱导效率和总黄酮得率。
1.2.5 外植体不同处理方式试验 将外植体分别采用整个茎段平放、整个茎段斜插、整个茎段埋入、茎段纵切半平放、茎段纵切半斜插、茎段纵切半埋入、茎片平放、茎片斜插、茎片埋入9种方法，放入培养基，按照1.2.1第二步的方法进行诱导，4周后统计诱导率。
1.2.6 增殖培养时间的确定 分别在0、1、2、3、4、5、6、7、8周，每周统计类原球茎的鲜重和干重增长量，确定最适宜生物量增长的培养时间。
1.2.7 光强对金线莲类原球茎增殖培养和总黄酮得率的影响 增殖培养中使用黑暗、弱光（500 lx）、较强光（1000 lx）和强光（2000 lx）4种处理，比较光照强度对类原球茎增殖和总黄酮得率的影响。
1.2.8 紫外光不同处理时间试验 在增殖培养过程中，在光周期中光培养阶段紫外灯（SJC-Ⅱ型，60 w，波长253.7 nm）每天照射6 h，分别照射7、14、21、28、35、42、48、56 d。紫外灯不照射的光培养时段日光灯照射（光照时间和强度同1.2.1）。接种量为150 mL三角瓶中接种50 g鲜重类原球茎，8周后测定所得材料的总生物增长量和总黄酮含量，总生物量增长量分为鲜重增长量（g）和干重增长量（g）。干重增长量（g）=[每处理获得的类原球茎干重（g）–每处理接种时类原球茎干重（g）]/每处理样本数。总黄酮得率=样品中总黄酮质量（g）/样品质量（g）×100%。
1.2.9 总黄酮的测量 将培养好的金线莲类原球茎收集，在烘箱60 ℃干燥3 h后，80 ℃干燥0.5 h，并研成粉末。总黄酮的测量采用亚硝酸钠-硝酸铝法[15]。分别精确量取芦丁标准溶液（0.12 g/L）0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，用30%的乙醇溶液补充至5.0 mL。依次加入0.5%亚硝酸钠溶液0.5 mL，10%硝酸铝溶液0.3 mL，1.0 mol/L NaOH溶液4.0 mL，每加入新的试剂混匀后静置10 min。取混合溶液4.0 mL，分光光度计510 nm测定吸光度。空白溶液为对照，以质量浓度为横坐标，以吸光度纵坐标，绘制标准曲线。得出线性方程。将金线莲类原球茎干燥粉末过40目筛，取0.5 g溶于95%乙醇浓度，提取时间24 h，料液比1∶100。取上清液2.0 mL，用30%乙醇补充至5.0 mL，按照标准品同样的反应程序，最终取反应完的溶液4.0 mL测定510 nm处吸光度。代入线性方程即可得到总黄酮的含量。总黄酮得率=样品中总黄酮质量（g）/样品质量（g）×100%。
1.2.10 与传统单步诱导法效率比较 将本研究所用的“二加二”法获得的诱导率、初始材料扩大倍数、增殖倍数、增殖鲜重、总效率和稳定率分别与传统单步法获得的数据进行比较。初始材料扩大倍数=每处理获得的白化茎段个数/接种外植体数×100%，增殖倍数=每处理获得的类原球茎个数/起始接种类原球茎个数×100%，总效率=诱导率×初始材料扩大倍数×增殖倍数。稳定率=每处理未分化、未愈伤组织化的类原球茎个数/收获的类原球茎总个数×100%。
1.3 数据处理
数据采用Excel 2010软件和DPS7.05软件进行统计分析，采用Duncan’s新复极差法检验差异显著性。
2 结果与分析
2.1 外植体来源对金线莲类原球茎诱导的影响
结果表明，4种不同的外植体，以黑暗腋生白化茎段的平均诱导率最高，可达88.33%，与其他处理差异显著（p<0.05）。经过黑暗培养的两个处理比光照条件下的2个处理的诱导率都高，并且差异显著（图1）。结果说明，黑暗培养3周能够显著促进金线莲类原球茎的诱导。
2.2 类原球茎的诱导过程
金线莲组培茎段经暗培养3周，获得腋生白化茎段（图2A）。白化茎段接种后2周，已有部 不同小写字母表示处理间差异显著（p<0.05）。1：普通組培苗茎段;2：经暗处理的组培苗茎段;3：光照腋生茎段;
4：黑暗腋生白化茎段。
分茎段萌发出直径1～2 mm的白色小球（图2B）。3周后，白色小球逐渐膨大成为球状或椭圆形的类原球茎，直径约3 mm;原球茎个数逐渐增多，并且继续有新的类原球茎萌发（图2C）。4周后，类原球茎的萌发量最多，以后基本不再有新的类原球茎形成（图2D）。
有的类原球茎为比较规则的球形，有的为椭圆形，有的为棒状，有的为不规则形。后续观察发现，黑暗腋生茎段诱导的类原球茎为球形，颜色洁白，生长速度快，增殖率高，质量最好（图2E）。椭圆形的类原球茎颜色偏黄，多数带有小芽，可用于诱导类原球茎再生植株;而棒状和不规则形的，在生长后期多数为膨大增殖，而且类原球茎生长拥挤变形，有些还发生了玻璃化，不利于后续增殖培养。
与普通组培苗茎段诱导的类原球茎相比，利用腋生白化茎段诱导类原球茎，诱导速度快（2周已有50%以上外植体萌发出类原球茎，而普通茎段此时只有1/3萌发），质量好（图2B～图2D，图2F～图2H）。
2.3 诱导培养培养基的确定
供试的9种培养基中，以Y5和Y8的培养基类原球茎诱导率和平均诱导PLB个数显著高于其他处理。Y8培养基诱导出的类原球茎呈圆形，质量好，后期增殖速度快;Y5培养基诱导率虽然较高，但是长出的原球茎“球”状不明显，不够典型，个别后期培养时增殖缓慢，增殖方式多为膨大，而原球茎个数增加不显著，并且初期诱导的原球茎体积越大后期越不圆，有伸长分化的趋势，并且有些发生了玻璃化。因而，Y8培养基最适于诱导类原球茎，效率高，效果好。比较Y1、Y2两种培养基，两者在诱导率和平均出芽数方面均没有明显差异，说明Y2添加2.0 mg/L KT没有提高Y1的诱导效果。比较Y1与Y3培养基，Y3的2个指标都低于Y1培养基，可以推测在与6-BA、ZT配比时，NAA比2，4-D更利于类原球茎的诱导。比较培养基Y1、Y2、和Y7、Y9，在没有6-BA的作用下，Y7和Y9中细胞分裂素ZT的诱导效果明显降低，即使在Y9中将ZT浓度提升至1.0 mg/L也没有达到好的诱导效果，推测6-BA较为适宜诱导金线莲类原球茎，而ZT并不适宜其诱导。比较Y4、Y5、Y6、Y7发现，TDZ作为细胞分裂素加入培养基，与6-BA配合（Y4）不能提高诱导效果;TDZ单独使用，只有在加入1.0 mg/L S3307（Y5）时显著提高了诱导效果，而其余3种效果均不理想。诱导效果较好的Y5和Y8中的都含有1.0 mg/L S3307，说明添加1.0 mg/L S3307能够显著提高类原球茎诱导效率（图3）。
不同小写字母表示平均诱导率的差异显著（p<0.05），不同大写字母表示平均诱导个数的差异显著（p<0.05）。
2.4 外植体处理和接种方式对金线莲类原球茎诱导的影响
整个茎段平放是类原球茎诱导率最高的处理方式，诱导率为81.67%，显著高于其他处理。而3种茎片的诱导处理方式诱导率在9种处理中显著低于其他处理，说明将茎段切片的处理方式不适宜诱导类原球茎（图4）。
2.5 暗培养时间对金线莲类原球茎诱导的影响
与对照相比3周以上的暗培养能够显著促进类原球茎的诱导效率。然而，对培养出的类原球茎的总黄酮得率进行测定，发现暗培养4、5周，类原球茎总黄酮得率有所降低。因而推测，“两步诱导”阶段，适宜类原球茎诱导的初始暗培养时间为3周（图5）。
2.6 增殖培养培养基的确定
结果表明供试的16个处理中，处理13的鲜重增长量为35.91 g，且与其他处理差异显著（表3）。本研究初始接种量为鲜重50 g/150 mL，理论上可获得类原球茎增殖鲜重239.4 g/L。根据正交试验极差分析结果显示，对类原球茎增殖培养中鲜重的增加，培养基中NH4+/NO3是影响最大
不同小写字母表示差异显著（p<0.05）。1：整个茎段平放;2：整个茎段斜插;3：整个茎段埋入;4：茎段纵切半平放;5：茎段纵切半斜插;6：茎段纵切半埋入;7：茎片平放;8：茎片斜插;9：茎片埋入。的因素，其次是NAA浓度，再次是6-BA浓度、S3307浓度，影响最小的是蔗糖浓度。最佳实验配比为：A1B4C4D2E2，即MS+0.5 mg/L S3307+4.0 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA + NH4+/NO3?（15 mm ol∶45 mmol）+蔗糖40 g/L（表4）。经验证，按最佳实验配比得到的类原球茎增殖鲜重为246.90 g/L。正交试验方差分析结果显示，对于鲜重的增加，5个因素对结果的影响大小顺序与极差分析结果一致。并且，各因素p值均小于0.01，各因素对实验结果的影响均达到极显著水平（表5）。
2.7 增殖培养时间的确定
每周统计类原球茎的鲜重和干重增长量，0～6周生物量增长量显著增高，7～8周较6周有所下降，所以6周是最适宜生物量增长的培养时间（图6）。
不同小写字母表示平均诱导率的差异显著（p<0.05），不同大写字母表示总黄酮得率的差异显著（p<0.05）。
2.8 光强对金线莲类原球茎增殖培养和总黄酮得率的影响
对于鲜重增长量和干重增长量，光照处理的结果均显著高于黑暗处理;对于总黄酮得率，弱光（500 lx）和较强光（1000 lx）处理显著高于黑暗培养处理和强光处理（2000 lx）（表6）。而弱光和较强光处理的3个指标差异均不显著（表6）。因此，根据经济原则选择500 lx的弱光培养有助于类原球茎增殖过程中总黄酮的积累。 2.9 紫外光处理时间对金线莲类原球茎增殖培养和总黄酮得率的影响
紫外光处理7～42 d，鲜重增长量与对照没有显著性差异，而随着紫外光处理时间的延长，48 d和56 d的紫外光处理明显降低了鲜重的增长量（表7）。而对于干重的增长量，紫外光处理只有一个相对降低的趋势，但差异并不显著。总黄酮得率受紫外光处理的影响呈现升高的趋势，42、48、56 d的紫外光照射有利于总黄酮的积累，显著高于其他处理。因而，为获得较高的生物量和较高的总黄酮得率，选择42 d的紫外光照射综合效果较好（表7）。
2.10 “二加二”法和传统单步诱导增殖法的培养效果比较
“二加二”法获得的诱导率、初始材料扩大倍数、增殖倍数、增殖鲜重、总效率和稳定率均比传统单步法获得的数据有显著提升（表8）。诱导率提升至88%的同时，初始材料扩大8.9倍，总效率可提升至27.76。增殖培养中92%的类原球茎不会发生分化和愈伤组织化（表8）。
3 讨论
本研究是在普通单步诱导法茎段诱导途径的基础上进行改进。其优势和创新点包括：诱导培养第一步，每个组培茎段可萌发出多个白化茎段作为诱导材料;诱导培养第二步，与传统单步法所用的普通组培苗茎段相比，黑暗腋生白化茎段诱导效率更高（88.33%），类原球茎发生早，特征典型，质量更好，本方法在提高诱导率的同时数倍提高初始材料利用率（8.9倍），这也是本方法与传统单步法的本质区别;增殖培养第一步，将诱导出的类原球茎在原诱导培养基上继代一次，保证了稳定的生长增殖环境，同时，不需要多次继代即可达到较好的状态，缩短了继代周期;增殖培养第二步，液体悬浮培养增加了类原球茎与培养液和空气的接触面积，使生物量显著增加。正交设计优选的培养基成分配比保证了分化和愈伤组织化的类原球茎比例显著下降，92%的类原球茎能够保持稳定增殖。
经暗处理获得白化茎段的方式，能够显著提高类原球茎的诱导效率。前人在不定芽再生研究中也有类似结论[6， 16-17]。但要在第二步诱导培养时转入光下，因为持续黑暗处理则会影响类原球茎次生物质的积累，总黄酮含量会受到抑制。而弱光下能够促进总黄酮的积累，这和郑连金等[18]的研究结果一致。前期暗处理能够促进诱导率，提高类原球茎的获得效率，而后期必须要一定强度的光照才能实现类原球茎的生物量和总黄酮的积累。这就要求后期继续探讨如何找到合适的临界点，使得诱导率和总黄酮积累达到最大化，从而高效获得总黄酮。本研究得到的适宜类原球茎增殖的光照强度低于文献[19]中适宜金线莲组培植株光照强度，推测原因可能是类原球茎本身的生理特点决定的，类原球茎组织材料相比完整组培植株较为幼化，因而诱导类原球茎所需的光照强度较弱。不同类型的光照对金线莲的生长和总黄酮等药用成分的积累有显著影响[20-21]。在周一鸣的研究中发现，C区紫外光（波长200～280 nm）显著促进苦荞总黄酮的积累[22]。而本研究使用的紫外灯车发射的紫外光正是C区紫外光（波长253.7 nm），每天6 h，连续42 d，同样对总黄酮积累达到了良好的促进效果。
对于外植体来源，以往研究中采用的有：种子、组培苗的茎段、茎段切半、茎段切片等[4]。本研究采用的是黑暗处理的腋生茎段，取材方便，获得率高，而且与种子直接诱导类原球茎相比，材料更多，诱导效率更高。与腋芽诱导的侧芽茎尖外植体相比，材料的获得率高（一个侧芽只有一个茎尖，而白化茎段的茎节具有多个）。与茎片相比，操作简便，并且效率高，获得的类原球茎质量好。这和韩晓红等[13]的茎片诱导研究结果不同，其原因可能是，本研究中虽然茎段切片与培养基的接触面积增加，但破坏了茎段功能的完整性，反而抑制了类原球茎的萌发。此外，产地来源对金线莲组织培养效果有较大影响[4]。本研究材料为“福建尖叶”，仅比较了该品种利用传统单步诱导法和“二加二”法的培养效果。今后的研究可擴展到其他品种。
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关键词 金线莲;类原球茎;高效体系;诱导;总黄酮
中图分类号 Q 949.9;S567.239 文献标识码 A
金线莲（金线兰），学名花叶开唇兰[Anoecto chilus roxburghii （Wall.） Lindl.]，是兰科开唇兰属珍稀药用植物。近年来，其保肝护肝、抗氧化、抗衰老、提高机体免疫力等药用价值，已引起人们的广泛关注[1-3]。自然环境的恶化和人们的过度采挖，使得野生金線莲资源严重匮乏，药材资源供不应求。原球茎是兰科等科属的植物繁殖过程中的一种特殊的胚状结构，组织培养可培育类似原球茎的结构，称为“类原球茎”（protocorm-like bodies，PLBs）。类原球茎培养具有繁殖效率较高，培养周期短的优点。利用组织培养的方法培养类原球茎并从中提取药用植物有效成分是扩大药材资源，拓展药材利用的有效手段。
金线莲类原球茎组织培养已有部分研究[4-6]，研究内容局限于类原球茎的诱导与增殖的培养基配方[7]，以及不同添加物和不同培养条件对类原球茎诱导的影响[8-9]，近年来拓展到用类原球茎生产次生代谢产物的研究[10]。以往研究都是通过单步直接诱导，大致分为两种途径：一种是从种子直接获得原球茎[6-7]再进行增殖，但金线莲资源不足，种子量有限，大量应用难以满足生产需求;第二种是从组培苗茎段或茎节直接诱导类原球茎[5， 8]。此途径应用较广，但仍存在许多问题：如初代诱导困难，诱导率低[8， 11-12]。王建勤等[12]利用茎节做接种材料诱导率仅为66%。封应丽等[8]的研究中诱导率提升至73%。韩晓红等[13]以茎段切片为外植体，初步提高材料利用率，诱导率为81%，但仍不够理想。此外，类原球茎增殖培养中常遇到“类原球茎稳定性较差，易分化，易愈伤组织化”的问题[11， 13-14]，严重降低其增殖效率，限制类原球茎培养体系在生产次生代谢产物领域的应用。因此，本研究拟探索一种新的方法，即“两步诱导”加“两步增殖”的方法，简称“二加二”法，先诱导白化茎段再诱导类原球茎并使其高效增殖，以期提高诱导率，同时数倍提高初始材料利用率，并进一步构建能够稳定增殖的类原球茎培养系统，为金线莲类原球茎生产药用成分的研究奠定基础，也作为兰科植物的原球茎培养等相关研究的参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料 金线莲品种为“福建尖叶”，带根组培植株采购于福建金草公司，切取茎段后在本实验室经过连续1 a的继代培养，获得长势基本一致的金线莲组培继代植株。
1.1.2 试剂 植物生长调节剂6-苄氨基腺嘌呤（6-Benzylaminopurine，6-BA）、萘乙酸（1-Naphthaleneacetic acid，NAA）、玉米素（Zeatin，ZT）、2，4-二氯苯氧乙酸（2，4- Dichlorophenoxyacet ic acid，2，4-D）、激动素（Kinetin，KT）、噻苯隆（Thiazuron，TDZ）、烯效唑（Uniconazole， S3307），购自上海生工生物工程有限公司。对照品为芦丁（BBI），化学试剂亚硝酸钠（科密欧），硝酸铝（科密欧）。
1.1.3 仪器 苏净安泰SW-CJ-2FD型超净台，苏州安泰空气技术有限公司;SJC-Ⅱ型紫外线杀菌车，北京好特光紫外线科技有限公司;SPX-250I-G型微电脑人工气候箱，上海博讯实业有限公司;ZHWY-1102C型恒温培养振荡器，上海智诚分析仪器制造有限公司;UV-5200型紫外-可见分光光度计，上海元析仪器有限公司。
1.2 方法
1.2.1 “两步诱导”法诱导类原球茎 第一步：外植体的获得。切取金线莲组培继代植株的茎段（外植体来源实验除外），每茎段带1至2个节，放置于B1培养基（MS + 6-BA 2.0 mg/L +NAA 1.0 mg/L，蔗糖30 g/L，琼脂8 g/L）中，温度27 ℃，黑暗培养3周后（黑暗培养时间试验除外），收获白化茎段。 第二步：类原球茎的诱导。切取长度為1 cm的白化茎段（每茎段带一个节），放置于培养基Y1～Y9（待筛选）中，每瓶放置外植体14个，每处理6瓶，重复3次。光照500 lx，光照时间12 h，培养4周，收获类原球茎。Y培养基的筛选：比较9种不同的诱导培养基（表1），4周后比较类原球茎的诱导率和诱导个数。诱导率=每处理诱导出类原球茎的外植体数/接种外植体数×100%;平均诱导PLB个数=每处理诱导类原球茎的个数/接种外植体数。
1.2.2 “两步增殖”法使类原球茎增殖 第一步，将“两步诱导”法得到的类原球茎切分为单个小球，接种到新的诱导培养基（Y）中培养3周;第二步，将增殖培养第一步得到的类原球茎切割为直径5 mm左右的小块，将其放置于液体培养基中，每150 mL三角瓶接种50 g，每处理6瓶，采用L16（45）正交试验设计对培养基中激素含量、蔗糖含量以及N素比（NH4+∶NO3?）进行比较，筛选适宜的增殖培养基配方。6周后统计类原球茎的鲜重增长量，鲜重增长量（g）=[每处理获得的类原球茎质量（g）?每处理起始类原球茎接种质量（g）]/每处理样本数。正交试验的表头设计见表2。
1.2.3 外植体的不同来源比较试验 分别选用普通组培苗茎段，经暗处理3周的组培苗茎段，光照条件下腋生茎段，黑暗3周后腋生的白化茎段，4种不同的外植体来源进行比较，按照1.2.1第二步的培养基Y进行培养，再4周后，统计类原球茎的诱导率。
1.2.4 诱导培养中黑暗处理时间试验 采用0、1、2、3、4、5周的暗培养，诱导出白化茎段，将白化茎段放置于培养基为Y1，再4周后比较各处理的诱导效率和总黄酮得率。
1.2.5 外植体不同处理方式试验 将外植体分别采用整个茎段平放、整个茎段斜插、整个茎段埋入、茎段纵切半平放、茎段纵切半斜插、茎段纵切半埋入、茎片平放、茎片斜插、茎片埋入9种方法，放入培养基，按照1.2.1第二步的方法进行诱导，4周后统计诱导率。
1.2.6 增殖培养时间的确定 分别在0、1、2、3、4、5、6、7、8周，每周统计类原球茎的鲜重和干重增长量，确定最适宜生物量增长的培养时间。
1.2.7 光强对金线莲类原球茎增殖培养和总黄酮得率的影响 增殖培养中使用黑暗、弱光（500 lx）、较强光（1000 lx）和强光（2000 lx）4种处理，比较光照强度对类原球茎增殖和总黄酮得率的影响。
1.2.8 紫外光不同处理时间试验 在增殖培养过程中，在光周期中光培养阶段紫外灯（SJC-Ⅱ型，60 w，波长253.7 nm）每天照射6 h，分别照射7、14、21、28、35、42、48、56 d。紫外灯不照射的光培养时段日光灯照射（光照时间和强度同1.2.1）。接种量为150 mL三角瓶中接种50 g鲜重类原球茎，8周后测定所得材料的总生物增长量和总黄酮含量，总生物量增长量分为鲜重增长量（g）和干重增长量（g）。干重增长量（g）=[每处理获得的类原球茎干重（g）–每处理接种时类原球茎干重（g）]/每处理样本数。总黄酮得率=样品中总黄酮质量（g）/样品质量（g）×100%。
1.2.9 总黄酮的测量 将培养好的金线莲类原球茎收集，在烘箱60 ℃干燥3 h后，80 ℃干燥0.5 h，并研成粉末。总黄酮的测量采用亚硝酸钠-硝酸铝法[15]。分别精确量取芦丁标准溶液（0.12 g/L）0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，用30%的乙醇溶液补充至5.0 mL。依次加入0.5%亚硝酸钠溶液0.5 mL，10%硝酸铝溶液0.3 mL，1.0 mol/L NaOH溶液4.0 mL，每加入新的试剂混匀后静置10 min。取混合溶液4.0 mL，分光光度计510 nm测定吸光度。空白溶液为对照，以质量浓度为横坐标，以吸光度纵坐标，绘制标准曲线。得出线性方程。将金线莲类原球茎干燥粉末过40目筛，取0.5 g溶于95%乙醇浓度，提取时间24 h，料液比1∶100。取上清液2.0 mL，用30%乙醇补充至5.0 mL，按照标准品同样的反应程序，最终取反应完的溶液4.0 mL测定510 nm处吸光度。代入线性方程即可得到总黄酮的含量。总黄酮得率=样品中总黄酮质量（g）/样品质量（g）×100%。
1.2.10 与传统单步诱导法效率比较 将本研究所用的“二加二”法获得的诱导率、初始材料扩大倍数、增殖倍数、增殖鲜重、总效率和稳定率分别与传统单步法获得的数据进行比较。初始材料扩大倍数=每处理获得的白化茎段个数/接种外植体数×100%，增殖倍数=每处理获得的类原球茎个数/起始接种类原球茎个数×100%，总效率=诱导率×初始材料扩大倍数×增殖倍数。稳定率=每处理未分化、未愈伤组织化的类原球茎个数/收获的类原球茎总个数×100%。
1.3 数据处理
数据采用Excel 2010软件和DPS7.05软件进行统计分析，采用Duncan’s新复极差法检验差异显著性。
2 结果与分析
2.1 外植体来源对金线莲类原球茎诱导的影响
结果表明，4种不同的外植体，以黑暗腋生白化茎段的平均诱导率最高，可达88.33%，与其他处理差异显著（p<0.05）。经过黑暗培养的两个处理比光照条件下的2个处理的诱导率都高，并且差异显著（图1）。结果说明，黑暗培养3周能够显著促进金线莲类原球茎的诱导。
2.2 类原球茎的诱导过程
金线莲组培茎段经暗培养3周，获得腋生白化茎段（图2A）。白化茎段接种后2周，已有部 不同小写字母表示处理间差异显著（p<0.05）。1：普通組培苗茎段;2：经暗处理的组培苗茎段;3：光照腋生茎段;
4：黑暗腋生白化茎段。
分茎段萌发出直径1～2 mm的白色小球（图2B）。3周后，白色小球逐渐膨大成为球状或椭圆形的类原球茎，直径约3 mm;原球茎个数逐渐增多，并且继续有新的类原球茎萌发（图2C）。4周后，类原球茎的萌发量最多，以后基本不再有新的类原球茎形成（图2D）。
有的类原球茎为比较规则的球形，有的为椭圆形，有的为棒状，有的为不规则形。后续观察发现，黑暗腋生茎段诱导的类原球茎为球形，颜色洁白，生长速度快，增殖率高，质量最好（图2E）。椭圆形的类原球茎颜色偏黄，多数带有小芽，可用于诱导类原球茎再生植株;而棒状和不规则形的，在生长后期多数为膨大增殖，而且类原球茎生长拥挤变形，有些还发生了玻璃化，不利于后续增殖培养。
与普通组培苗茎段诱导的类原球茎相比，利用腋生白化茎段诱导类原球茎，诱导速度快（2周已有50%以上外植体萌发出类原球茎，而普通茎段此时只有1/3萌发），质量好（图2B～图2D，图2F～图2H）。
2.3 诱导培养培养基的确定
供试的9种培养基中，以Y5和Y8的培养基类原球茎诱导率和平均诱导PLB个数显著高于其他处理。Y8培养基诱导出的类原球茎呈圆形，质量好，后期增殖速度快;Y5培养基诱导率虽然较高，但是长出的原球茎“球”状不明显，不够典型，个别后期培养时增殖缓慢，增殖方式多为膨大，而原球茎个数增加不显著，并且初期诱导的原球茎体积越大后期越不圆，有伸长分化的趋势，并且有些发生了玻璃化。因而，Y8培养基最适于诱导类原球茎，效率高，效果好。比较Y1、Y2两种培养基，两者在诱导率和平均出芽数方面均没有明显差异，说明Y2添加2.0 mg/L KT没有提高Y1的诱导效果。比较Y1与Y3培养基，Y3的2个指标都低于Y1培养基，可以推测在与6-BA、ZT配比时，NAA比2，4-D更利于类原球茎的诱导。比较培养基Y1、Y2、和Y7、Y9，在没有6-BA的作用下，Y7和Y9中细胞分裂素ZT的诱导效果明显降低，即使在Y9中将ZT浓度提升至1.0 mg/L也没有达到好的诱导效果，推测6-BA较为适宜诱导金线莲类原球茎，而ZT并不适宜其诱导。比较Y4、Y5、Y6、Y7发现，TDZ作为细胞分裂素加入培养基，与6-BA配合（Y4）不能提高诱导效果;TDZ单独使用，只有在加入1.0 mg/L S3307（Y5）时显著提高了诱导效果，而其余3种效果均不理想。诱导效果较好的Y5和Y8中的都含有1.0 mg/L S3307，说明添加1.0 mg/L S3307能够显著提高类原球茎诱导效率（图3）。
不同小写字母表示平均诱导率的差异显著（p<0.05），不同大写字母表示平均诱导个数的差异显著（p<0.05）。
2.4 外植体处理和接种方式对金线莲类原球茎诱导的影响
整个茎段平放是类原球茎诱导率最高的处理方式，诱导率为81.67%，显著高于其他处理。而3种茎片的诱导处理方式诱导率在9种处理中显著低于其他处理，说明将茎段切片的处理方式不适宜诱导类原球茎（图4）。
2.5 暗培养时间对金线莲类原球茎诱导的影响
与对照相比3周以上的暗培养能够显著促进类原球茎的诱导效率。然而，对培养出的类原球茎的总黄酮得率进行测定，发现暗培养4、5周，类原球茎总黄酮得率有所降低。因而推测，“两步诱导”阶段，适宜类原球茎诱导的初始暗培养时间为3周（图5）。
2.6 增殖培养培养基的确定
结果表明供试的16个处理中，处理13的鲜重增长量为35.91 g，且与其他处理差异显著（表3）。本研究初始接种量为鲜重50 g/150 mL，理论上可获得类原球茎增殖鲜重239.4 g/L。根据正交试验极差分析结果显示，对类原球茎增殖培养中鲜重的增加，培养基中NH4+/NO3是影响最大
不同小写字母表示差异显著（p<0.05）。1：整个茎段平放;2：整个茎段斜插;3：整个茎段埋入;4：茎段纵切半平放;5：茎段纵切半斜插;6：茎段纵切半埋入;7：茎片平放;8：茎片斜插;9：茎片埋入。的因素，其次是NAA浓度，再次是6-BA浓度、S3307浓度，影响最小的是蔗糖浓度。最佳实验配比为：A1B4C4D2E2，即MS+0.5 mg/L S3307+4.0 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA + NH4+/NO3?（15 mm ol∶45 mmol）+蔗糖40 g/L（表4）。经验证，按最佳实验配比得到的类原球茎增殖鲜重为246.90 g/L。正交试验方差分析结果显示，对于鲜重的增加，5个因素对结果的影响大小顺序与极差分析结果一致。并且，各因素p值均小于0.01，各因素对实验结果的影响均达到极显著水平（表5）。
2.7 增殖培养时间的确定
每周统计类原球茎的鲜重和干重增长量，0～6周生物量增长量显著增高，7～8周较6周有所下降，所以6周是最适宜生物量增长的培养时间（图6）。
不同小写字母表示平均诱导率的差异显著（p<0.05），不同大写字母表示总黄酮得率的差异显著（p<0.05）。
2.8 光强对金线莲类原球茎增殖培养和总黄酮得率的影响
对于鲜重增长量和干重增长量，光照处理的结果均显著高于黑暗处理;对于总黄酮得率，弱光（500 lx）和较强光（1000 lx）处理显著高于黑暗培养处理和强光处理（2000 lx）（表6）。而弱光和较强光处理的3个指标差异均不显著（表6）。因此，根据经济原则选择500 lx的弱光培养有助于类原球茎增殖过程中总黄酮的积累。 2.9 紫外光处理时间对金线莲类原球茎增殖培养和总黄酮得率的影响
紫外光处理7～42 d，鲜重增长量与对照没有显著性差异，而随着紫外光处理时间的延长，48 d和56 d的紫外光处理明显降低了鲜重的增长量（表7）。而对于干重的增长量，紫外光处理只有一个相对降低的趋势，但差异并不显著。总黄酮得率受紫外光处理的影响呈现升高的趋势，42、48、56 d的紫外光照射有利于总黄酮的积累，显著高于其他处理。因而，为获得较高的生物量和较高的总黄酮得率，选择42 d的紫外光照射综合效果较好（表7）。
2.10 “二加二”法和传统单步诱导增殖法的培养效果比较
“二加二”法获得的诱导率、初始材料扩大倍数、增殖倍数、增殖鲜重、总效率和稳定率均比传统单步法获得的数据有显著提升（表8）。诱导率提升至88%的同时，初始材料扩大8.9倍，总效率可提升至27.76。增殖培养中92%的类原球茎不会发生分化和愈伤组织化（表8）。
3 讨论
本研究是在普通单步诱导法茎段诱导途径的基础上进行改进。其优势和创新点包括：诱导培养第一步，每个组培茎段可萌发出多个白化茎段作为诱导材料;诱导培养第二步，与传统单步法所用的普通组培苗茎段相比，黑暗腋生白化茎段诱导效率更高（88.33%），类原球茎发生早，特征典型，质量更好，本方法在提高诱导率的同时数倍提高初始材料利用率（8.9倍），这也是本方法与传统单步法的本质区别;增殖培养第一步，将诱导出的类原球茎在原诱导培养基上继代一次，保证了稳定的生长增殖环境，同时，不需要多次继代即可达到较好的状态，缩短了继代周期;增殖培养第二步，液体悬浮培养增加了类原球茎与培养液和空气的接触面积，使生物量显著增加。正交设计优选的培养基成分配比保证了分化和愈伤组织化的类原球茎比例显著下降，92%的类原球茎能够保持稳定增殖。
经暗处理获得白化茎段的方式，能够显著提高类原球茎的诱导效率。前人在不定芽再生研究中也有类似结论[6， 16-17]。但要在第二步诱导培养时转入光下，因为持续黑暗处理则会影响类原球茎次生物质的积累，总黄酮含量会受到抑制。而弱光下能够促进总黄酮的积累，这和郑连金等[18]的研究结果一致。前期暗处理能够促进诱导率，提高类原球茎的获得效率，而后期必须要一定强度的光照才能实现类原球茎的生物量和总黄酮的积累。这就要求后期继续探讨如何找到合适的临界点，使得诱导率和总黄酮积累达到最大化，从而高效获得总黄酮。本研究得到的适宜类原球茎增殖的光照强度低于文献[19]中适宜金线莲组培植株光照强度，推测原因可能是类原球茎本身的生理特点决定的，类原球茎组织材料相比完整组培植株较为幼化，因而诱导类原球茎所需的光照强度较弱。不同类型的光照对金线莲的生长和总黄酮等药用成分的积累有显著影响[20-21]。在周一鸣的研究中发现，C区紫外光（波长200～280 nm）显著促进苦荞总黄酮的积累[22]。而本研究使用的紫外灯车发射的紫外光正是C区紫外光（波长253.7 nm），每天6 h，连续42 d，同样对总黄酮积累达到了良好的促进效果。
对于外植体来源，以往研究中采用的有：种子、组培苗的茎段、茎段切半、茎段切片等[4]。本研究采用的是黑暗处理的腋生茎段，取材方便，获得率高，而且与种子直接诱导类原球茎相比，材料更多，诱导效率更高。与腋芽诱导的侧芽茎尖外植体相比，材料的获得率高（一个侧芽只有一个茎尖，而白化茎段的茎节具有多个）。与茎片相比，操作简便，并且效率高，获得的类原球茎质量好。这和韩晓红等[13]的茎片诱导研究结果不同，其原因可能是，本研究中虽然茎段切片与培养基的接触面积增加，但破坏了茎段功能的完整性，反而抑制了类原球茎的萌发。此外，产地来源对金线莲组织培养效果有较大影响[4]。本研究材料为“福建尖叶”，仅比较了该品种利用传统单步诱导法和“二加二”法的培养效果。今后的研究可擴展到其他品种。
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