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摘 要 通过分离鉴定、回接及盆栽试验，筛选出能高效结瘤、具有高效固氮酶活性，能有效提高紫云英生物量的紫云英根瘤菌作为目标菌株，制备液体菌剂应用于田间试验并测定其效果。结果表明，本试验筛选出的3株目标菌株均发挥了根瘤菌优越的生物固氮作用，增加了根瘤菌数量，提高了紫云英的生物学产量，并以GL-L-6菌株表现为最优。
关键词 根瘤菌；紫云英；生物固氮
中图分类号：S154 文献标志码：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2018.18.102
我国耕地面积占全球的7%，而年消耗氮肥占世界的30%，氮肥利用率仅10%～30%。人工施用化学氮肥流失率往往大于50%，多余的氮素会导致土壤酸化，破坏土壤和微生物原先的氮循环能力，因此微生物的生物固氮作用对于改善植物氮素营养、降低化肥的使用、减少环境污染、并保持可持续发展具有重要的意义[1]。豆科植物-根瘤菌共生体系的固氮功能发挥了极大的作用，全球每年生物固氮量约2.0亿吨，豆科植物-根瘤菌的共生固氮体系占了65%～80%；为共生的豆科植物提供所需氮肥的50%～100%，因此豆科植物-根瘤菌间的共生固氮是自然界植物氮素最经济、最有效的来源[2]。
紫云英是一种绿肥作物，富含有机质，有利于改良土壤、培肥地力、减少化肥用量，并改善农田生态环境，提高农产品产量和品质，降低农业生产成本。用冬闲田地种植紫云英是充分利用冬季温光资源解决耕地冬季闲置的有效途径。紫云英一直是我国南方各省稻田主要绿肥肥源之一，种植面积较大，紫云英与优良的根瘤菌菌株拌种使用可以大幅度提高紫云英亩产量。我国南方广大地区长期以来就通过种植紫云英作物绿肥改善土壤理化状况，提高土壤氮素营养，因此，大力发展紫云英种植对南方地区的农业生产具有重要的意义[3-4]。
根瘤菌具有较强的宿主专一性，其共生固氮过程需要有合适的宿主，同时由于其属于革兰阴性菌，其环境生存能力低于芽孢杆菌，因此在紫云英根瘤菌的应用推广中，菌种的选育改良、优化发酵工艺、采用合适的保存方法提高其存活率，对其应用至关重要[5]。
1 材料与方法
1.1 根瘤的采集与根瘤菌分离鉴定
从生长状况良好的紫云英植株根部选择肥大、饱满、粉红色的根瘤，用水冲洗干净，再用无菌水冲洗，滤纸吸干后，用75%乙醇浸泡2 min、0.1%氯化汞浸泡2～5 min，无菌水冲洗5～6次后，在无菌条件下，用镊子将根瘤压碎。将挤出液接种至选择性平板上，28 ℃培养，挑取长出的单菌落，再次进行划线，分离后获得的单菌落移至斜面上保存，并进行革兰染色和形态学鉴定，此为获得初步分离的根瘤菌菌株[6]。
1.2 根瘤菌回接试验
将分离到的紫云英根瘤菌培养后接种到经催芽的紫云英种子上，在无氮培养液中培养，同时以不接种的紫云英作为对照。待接种处理后的紫云英结瘤，根据根瘤的大小、瘤重、有效瘤数量等指标判断根瘤菌菌种的优劣。将保存结瘤能力较好的根瘤菌作为备选的菌株。
1.3 盆栽试验
进一步进行盆栽试验，对根瘤菌菌株进行筛选。选择大小相近的紫云英种子，播种在盛有灭菌蛭石的塑料盆（15 cm×13 cm）中，每盆5颗种子，分别接种供试根瘤菌悬液1 mL，以不接种为对照，每个处理设3个重复。将植株置于白天28～30 ℃、夜间15～20 ℃、每天光照8 h的温室中培养，依据结瘤情况及紫云英生长性状选择比较优良的根瘤菌菌株。随后以土培法对第二轮筛选得到的根瘤菌菌株进行进一步筛选，选择在多个紫云英品种上都能高效结瘤，并能有效提高紫云英生物量的根瘤菌为目标菌株。
1.4 固氮酶活測定
紫云英的根瘤较小，为避免根瘤离体后影响真实酶活性，取紫云英完整根系置于10mL的小瓶子内，采用乙炔还原法测定固氮酶活性，重复3次。
1.5 田间试验
将筛选得到的菌种在YMA培养基中扩大培养，得到紫云英根瘤菌液体菌剂，平板计数测定活菌数与杂菌率。按每1 kg紫云英种子加75 mL根瘤菌的比例拌种晾干后马上播种。收获时，观察结瘤比例、数量、饱满度、颜色等，测定紫云英产量增加情况。
1.6 植株总氮含量测定
植株含氮量测定按照农业行业标准《有机肥料》（NY 525-2012）中总氮含量测定方法进行[8]。
2 结果与分析
2.1 分离纯化获得的根瘤菌
选取肥大、饱满、粉红色的有效紫云英根瘤15个，利用平板分区划线法分离获得单菌落11个，分别命名为GL-L-1、GL-L-2、GL-L-3、GL-L-4、GL-L-5、GL-L-6、GL-L-7、GL-L-8、GL-L-9、GL-L-10和GL-L-11。革兰染色镜检均为大小一致的革兰阴性杆菌。经28 ℃培养3 d，出现肉眼可见单菌落，直径2～8 mm，水泡状、透明水润，生长旺盛时可见流动胶质，具备一般根瘤菌形态特征。
2.2 根瘤菌回接及盆栽试验结果
将初步分离到的11株紫云英根瘤菌进行回接及盆栽试验，计数结瘤情况，计量根瘤鲜重、株鲜重、株干重，结果见表1。如表1所示，结果表明接种选育的根瘤菌对紫云英结瘤及长势上都有明显的促进作用。未接种根瘤菌的植株没有结瘤，接种根瘤菌的紫云英植株均明显结瘤，结瘤数在15.1～26.2个/株；在植株鲜重上，接种根瘤菌的全部实现增产，增幅73.91%～141.24%；其中菌株GL-L-5、GL-L-6和GL-L-9在结瘤数目及鲜重增重上较其他株更有上佳表现，故确定为目标菌株，后续试验将围绕这3个菌株开展研究。
2.3 固氮酶活性测定结果
判断是否具有固氮作用，必须进行固氮酶活性检测。采用乙炔还原法测定根瘤还原乙炔为乙烯的浓度从而间接测定菌株是否有固氮酶活性及其高低。目标菌株GL-L-5、GL-L-6和GL-L-9固氮酶活性测定结果如表2所示，3株菌株均有固氮酶活性，并综上试验结果，其中GL-L-6固氮酶活性最强，植株产量也最高。 2.4 田间效果试验
将3株目标菌株分别制得的紫云英根瘤菌液体菌剂经田间试验，收获时观察，可见结瘤数量多，根瘤饱满，均以粉红色有效根瘤为主。测定植株鲜重反映紫云英产量，并以未添加根瘤菌液培养的紫云英植株鲜重作为对照，其植株鲜重和计算得出的增幅见表3，分别经GL-L-5、GL-L-6和GL-L-9菌液拌种播种培养后，紫云英产量增幅明显，达91.5%以上，并以GL-L-6菌液拌种培养紫云英产量增幅最大，达121.88%。
2.5 植株总氮含量测定结果
测定3株目标菌株的总氮含量，记录于表4中。如表所示，经GL-L-5、GL-L-6和GL-L-9菌液拌种培养后对提高紫云英植株的含氮量有明显效果，增幅达68.66%以上，并以GL-L-6增幅最大，达82.59%。
3 讨论
比较了不同紫云英根瘤菌对紫云英的结瘤性、固氮酶活性、含氮量及提高紫云英产量的作用。试验结果肯定了GL-L-5、GL-L-6和GL-L-9菌株较其他8株根瘤菌优越，在紫云英上接种选定的这3株目标根瘤菌剂，均发挥了根瘤菌的生物固氮作用，增加了根瘤菌数量，提高了紫云英的生物学产量，并以GL-L-6菌株表现为最优。选育出优良性状的根瘤菌菌株，制备微生物肥料应用于农业生产中，对改善土壤结构、提高土壤氮素营养、保护土壤生态环境具有重要的意义。
优化发酵条件，研究根瘤菌剂作为微生物肥料在土壤中的競争状况和存活时间，探究影响微生物肥料发挥作用的因素等问题，在与促进豆科植物结瘤固氮方面的功能进行更细致的研究，才能为微生物肥料应用于生产实践奠定更为坚实的理论基础。同时，加快成果转化，加强高校、科研院所与企业的合作步伐，并切实加大推广面积和创新力度，才能为全面实现农业生产可持续发展起到积极的推进作用[9]。
参考文献：
[1] 郑会明，翟娜娜.紫云英根瘤菌不同菌株间结瘤竞争能力的比较[J].江苏农业科学，2014，42（11）：403-406.
[2] 李欣欣，许锐能.大豆共生固氮在农业减肥增效中的贡献及应用潜力[J].大豆科学，2016，35（4）：13-17.
[3] 陈海荣，郭照辉.紫云英根瘤菌培养基的选择与优化[J].湖南农业科学，2011，41（1）：13-15.
[4] 朱旭娟.旌德县紫云英接种根瘤菌剂种植试验[J].安徽农学通报，2013，19（14）：79.
[5] 龙则军.紫云英应用根瘤菌剂种植技术大田展示[J].现代农业科技，2017，46（15）：178-184.
[6] 管凤贞，钟少杰.紫云英根瘤菌的分离与鉴定[J].福建农业学报，2012，27（5）：524-532.
[7] 刘丽，马鸣超，姜昕，等.根瘤菌与促生菌双接种对大豆生长和土壤酶活的影响[J].植物营养与肥料学报，2015，21（3）：644-654.
[8] 张晓荣，于仁宗.有机肥料总氮含量测定过程应注意的问题[J].南方农业，2014，8（27）：177-178.
[9] 许景钢，孙涛.我国微生物肥料的研发及其在农业生产中的应用[J].作物杂志，2016，32（1）：1-6.
（责任编辑：刘昀）
关键词 根瘤菌；紫云英；生物固氮
中图分类号：S154 文献标志码：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2018.18.102
我国耕地面积占全球的7%，而年消耗氮肥占世界的30%，氮肥利用率仅10%～30%。人工施用化学氮肥流失率往往大于50%，多余的氮素会导致土壤酸化，破坏土壤和微生物原先的氮循环能力，因此微生物的生物固氮作用对于改善植物氮素营养、降低化肥的使用、减少环境污染、并保持可持续发展具有重要的意义[1]。豆科植物-根瘤菌共生体系的固氮功能发挥了极大的作用，全球每年生物固氮量约2.0亿吨，豆科植物-根瘤菌的共生固氮体系占了65%～80%；为共生的豆科植物提供所需氮肥的50%～100%，因此豆科植物-根瘤菌间的共生固氮是自然界植物氮素最经济、最有效的来源[2]。
紫云英是一种绿肥作物，富含有机质，有利于改良土壤、培肥地力、减少化肥用量，并改善农田生态环境，提高农产品产量和品质，降低农业生产成本。用冬闲田地种植紫云英是充分利用冬季温光资源解决耕地冬季闲置的有效途径。紫云英一直是我国南方各省稻田主要绿肥肥源之一，种植面积较大，紫云英与优良的根瘤菌菌株拌种使用可以大幅度提高紫云英亩产量。我国南方广大地区长期以来就通过种植紫云英作物绿肥改善土壤理化状况，提高土壤氮素营养，因此，大力发展紫云英种植对南方地区的农业生产具有重要的意义[3-4]。
根瘤菌具有较强的宿主专一性，其共生固氮过程需要有合适的宿主，同时由于其属于革兰阴性菌，其环境生存能力低于芽孢杆菌，因此在紫云英根瘤菌的应用推广中，菌种的选育改良、优化发酵工艺、采用合适的保存方法提高其存活率，对其应用至关重要[5]。
1 材料与方法
1.1 根瘤的采集与根瘤菌分离鉴定
从生长状况良好的紫云英植株根部选择肥大、饱满、粉红色的根瘤，用水冲洗干净，再用无菌水冲洗，滤纸吸干后，用75%乙醇浸泡2 min、0.1%氯化汞浸泡2～5 min，无菌水冲洗5～6次后，在无菌条件下，用镊子将根瘤压碎。将挤出液接种至选择性平板上，28 ℃培养，挑取长出的单菌落，再次进行划线，分离后获得的单菌落移至斜面上保存，并进行革兰染色和形态学鉴定，此为获得初步分离的根瘤菌菌株[6]。
1.2 根瘤菌回接试验
将分离到的紫云英根瘤菌培养后接种到经催芽的紫云英种子上，在无氮培养液中培养，同时以不接种的紫云英作为对照。待接种处理后的紫云英结瘤，根据根瘤的大小、瘤重、有效瘤数量等指标判断根瘤菌菌种的优劣。将保存结瘤能力较好的根瘤菌作为备选的菌株。
1.3 盆栽试验
进一步进行盆栽试验，对根瘤菌菌株进行筛选。选择大小相近的紫云英种子，播种在盛有灭菌蛭石的塑料盆（15 cm×13 cm）中，每盆5颗种子，分别接种供试根瘤菌悬液1 mL，以不接种为对照，每个处理设3个重复。将植株置于白天28～30 ℃、夜间15～20 ℃、每天光照8 h的温室中培养，依据结瘤情况及紫云英生长性状选择比较优良的根瘤菌菌株。随后以土培法对第二轮筛选得到的根瘤菌菌株进行进一步筛选，选择在多个紫云英品种上都能高效结瘤，并能有效提高紫云英生物量的根瘤菌为目标菌株。
1.4 固氮酶活測定
紫云英的根瘤较小，为避免根瘤离体后影响真实酶活性，取紫云英完整根系置于10mL的小瓶子内，采用乙炔还原法测定固氮酶活性，重复3次。
1.5 田间试验
将筛选得到的菌种在YMA培养基中扩大培养，得到紫云英根瘤菌液体菌剂，平板计数测定活菌数与杂菌率。按每1 kg紫云英种子加75 mL根瘤菌的比例拌种晾干后马上播种。收获时，观察结瘤比例、数量、饱满度、颜色等，测定紫云英产量增加情况。
1.6 植株总氮含量测定
植株含氮量测定按照农业行业标准《有机肥料》（NY 525-2012）中总氮含量测定方法进行[8]。
2 结果与分析
2.1 分离纯化获得的根瘤菌
选取肥大、饱满、粉红色的有效紫云英根瘤15个，利用平板分区划线法分离获得单菌落11个，分别命名为GL-L-1、GL-L-2、GL-L-3、GL-L-4、GL-L-5、GL-L-6、GL-L-7、GL-L-8、GL-L-9、GL-L-10和GL-L-11。革兰染色镜检均为大小一致的革兰阴性杆菌。经28 ℃培养3 d，出现肉眼可见单菌落，直径2～8 mm，水泡状、透明水润，生长旺盛时可见流动胶质，具备一般根瘤菌形态特征。
2.2 根瘤菌回接及盆栽试验结果
将初步分离到的11株紫云英根瘤菌进行回接及盆栽试验，计数结瘤情况，计量根瘤鲜重、株鲜重、株干重，结果见表1。如表1所示，结果表明接种选育的根瘤菌对紫云英结瘤及长势上都有明显的促进作用。未接种根瘤菌的植株没有结瘤，接种根瘤菌的紫云英植株均明显结瘤，结瘤数在15.1～26.2个/株；在植株鲜重上，接种根瘤菌的全部实现增产，增幅73.91%～141.24%；其中菌株GL-L-5、GL-L-6和GL-L-9在结瘤数目及鲜重增重上较其他株更有上佳表现，故确定为目标菌株，后续试验将围绕这3个菌株开展研究。
2.3 固氮酶活性测定结果
判断是否具有固氮作用，必须进行固氮酶活性检测。采用乙炔还原法测定根瘤还原乙炔为乙烯的浓度从而间接测定菌株是否有固氮酶活性及其高低。目标菌株GL-L-5、GL-L-6和GL-L-9固氮酶活性测定结果如表2所示，3株菌株均有固氮酶活性，并综上试验结果，其中GL-L-6固氮酶活性最强，植株产量也最高。 2.4 田间效果试验
将3株目标菌株分别制得的紫云英根瘤菌液体菌剂经田间试验，收获时观察，可见结瘤数量多，根瘤饱满，均以粉红色有效根瘤为主。测定植株鲜重反映紫云英产量，并以未添加根瘤菌液培养的紫云英植株鲜重作为对照，其植株鲜重和计算得出的增幅见表3，分别经GL-L-5、GL-L-6和GL-L-9菌液拌种播种培养后，紫云英产量增幅明显，达91.5%以上，并以GL-L-6菌液拌种培养紫云英产量增幅最大，达121.88%。
2.5 植株总氮含量测定结果
测定3株目标菌株的总氮含量，记录于表4中。如表所示，经GL-L-5、GL-L-6和GL-L-9菌液拌种培养后对提高紫云英植株的含氮量有明显效果，增幅达68.66%以上，并以GL-L-6增幅最大，达82.59%。
3 讨论
比较了不同紫云英根瘤菌对紫云英的结瘤性、固氮酶活性、含氮量及提高紫云英产量的作用。试验结果肯定了GL-L-5、GL-L-6和GL-L-9菌株较其他8株根瘤菌优越，在紫云英上接种选定的这3株目标根瘤菌剂，均发挥了根瘤菌的生物固氮作用，增加了根瘤菌数量，提高了紫云英的生物学产量，并以GL-L-6菌株表现为最优。选育出优良性状的根瘤菌菌株，制备微生物肥料应用于农业生产中，对改善土壤结构、提高土壤氮素营养、保护土壤生态环境具有重要的意义。
优化发酵条件，研究根瘤菌剂作为微生物肥料在土壤中的競争状况和存活时间，探究影响微生物肥料发挥作用的因素等问题，在与促进豆科植物结瘤固氮方面的功能进行更细致的研究，才能为微生物肥料应用于生产实践奠定更为坚实的理论基础。同时，加快成果转化，加强高校、科研院所与企业的合作步伐，并切实加大推广面积和创新力度，才能为全面实现农业生产可持续发展起到积极的推进作用[9]。
参考文献：
[1] 郑会明，翟娜娜.紫云英根瘤菌不同菌株间结瘤竞争能力的比较[J].江苏农业科学，2014，42（11）：403-406.
[2] 李欣欣，许锐能.大豆共生固氮在农业减肥增效中的贡献及应用潜力[J].大豆科学，2016，35（4）：13-17.
[3] 陈海荣，郭照辉.紫云英根瘤菌培养基的选择与优化[J].湖南农业科学，2011，41（1）：13-15.
[4] 朱旭娟.旌德县紫云英接种根瘤菌剂种植试验[J].安徽农学通报，2013，19（14）：79.
[5] 龙则军.紫云英应用根瘤菌剂种植技术大田展示[J].现代农业科技，2017，46（15）：178-184.
[6] 管凤贞，钟少杰.紫云英根瘤菌的分离与鉴定[J].福建农业学报，2012，27（5）：524-532.
[7] 刘丽，马鸣超，姜昕，等.根瘤菌与促生菌双接种对大豆生长和土壤酶活的影响[J].植物营养与肥料学报，2015，21（3）：644-654.
[8] 张晓荣，于仁宗.有机肥料总氮含量测定过程应注意的问题[J].南方农业，2014，8（27）：177-178.
[9] 许景钢，孙涛.我国微生物肥料的研发及其在农业生产中的应用[J].作物杂志，2016，32（1）：1-6.
（责任编辑：刘昀）