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【摘要】 目的：探讨围绝经期综合征中医肝郁分级与舌苔脱落细胞EGFR表达的相关性。方法：以30例健康妇女作为对照组，100例围绝经期综合征患者作为观察组，采用证素辨证进行中医肝郁病理分级，免疫组化检测舌苔脱落细胞EGFR的细胞着色强度值及阳性率。结果：观察组舌苔脱落细胞EGFR的细胞着色强度值及阳性率显著高于对照组（P<0.05）；观察组不同舌苔组和不同舌质组间EGFR差异无明显规律；观察组舌苔脱落细胞EGFR表达阳性率与肝郁病理分级呈正相关。结论：围绝经期综合症患者舌苔脱落细胞EGFR可以作为判断肝郁病变程度的重要参考。
【关键词】 围绝经期综合征； 肝郁分级； 舌苔脱落细胞； EGFR
围绝经期综合征（Perimenopausal Syndrome），是指绝经前后的妇女，由于卵巢功能衰退乃至消失，雌激素分泌降低，所导致的自主神经功能紊乱和内分泌失调的一系列症状。中医药对于围绝经期综合征的治疗具有独特的疗效和优势，近年来受到越来越多的关注。围绝经期综合征在中医学范畴属于“经断前后诸证”、“绝经前后诸证”，其形成机制与绝经前后的生理特点有重要关系，而其中肝郁是其主要的病机之一。
舌苔脱落细胞作为舌苔的主要组成成分，其凋亡可能是影响舌苔变化的重要因素之一。EGFR作为表皮生长因子受体家族成员，与许多肿瘤细胞的增殖、血管生成及细胞凋亡的抑制有密切关系。有研究发现舌苔的厚薄与唾液中EGF的含量有关[1]。本研究对围绝经期综合征患者舌苔脱落细胞EGFR表达情况及中医肝郁分级情况进行了调查，并对两者之间的关系进行关联性研究，旨在探明舌苔变化与肝郁病理的内在联系，为中医舌诊的现代化、客观化研究提供理论参考。
1 资料与方法
1.1 一般资料 选取2012年5月-2013年3月在福建省立医院就诊的围绝经期患者共100例为观察组，年龄42～58岁，平均（47.11±4.35）岁，病程3.5～9.7个月；对照组为在福建省立医院健康体检中心进行体检的健康女性30例，年龄41～59岁，平均（48.13±2.81）岁。两组受试者年龄比较差异无统计学意义（P<0.05），具有可比性。
1.2 围绝经期综合征诊断标准及纳入、排除标准
1.2.1 诊断标准及纳入标准 围绝经期综合征西医诊断标准参照《妇产科学》[2]。观察组纳入标准：符合围绝经期综合征西医诊断标准且未经过雌、孕激素替代治疗者。对照组纳入标准：年龄40～59岁的健康妇女，月经周期规律。所有参与调查者均自愿签署《知情同意书》。
1.2.2 排除标准 凡不符合围绝经期综合征纳入标准者；乳腺肿瘤、侧卵巢切除、卵巢器质性病变、卵巢功能早衰者；原因不明的阴道不规则出血未治愈者；精神病患者；合并心脑血管、肝、肾、造血系统等严重疾病者。
1.3 试验方法 对所有患者进行四诊资料的采集，进行舌苔脱落细胞标本的采集和EGFR的检测；通过证素辩证计算肝郁积分，并对观察组患者按肝郁积分进行分级，其具体的方法如下。
1.3.1 四诊资料采集 按中医传统四诊方法进行资料的收集，将“600种常见症状的辨证意义”进行分解制定获得规范量表。由经过规范培训的中医专业人员进行四诊资料的采集，尽量确保资料的客观与准确性[3]。
1.3.2 证素辨证计算肝郁积分 参照“600种常见症状的辨证意义”[3]，将临床表现中属于肝郁要素的贡献度进行累积相加并求和，作为肝郁证素积分。积分<70，为0级，说明无肝郁病理改变；70≤积分<100，为1级，说明肝郁病理发生轻度改变；100≤积分<150，为2级，说明肝郁病理发生中度改变；积分≥150，为3级，说明肝郁病理发生重度改变。
1.3.3 舌象诊断 根据《中医诊断学》舌诊诊断标准，仔细观察受试者舌质和舌苔情况。根据观察结果，舌质分为淡白、淡红、红色、紫色4种，舌苔分为薄白、薄黄、白厚、黄厚4种。将观察组及对照组的舌质及舌苔情况记录填写在专用的临床观察表上。
1.3.4 舌苔脱落细胞采集 受试者空腹采集样本，患者将舌自然伸出，采集者用经消毒无菌的牙签平行于舌面取舌中部舌苔，置于盛有PBS缓冲液的15 mL离心管中，重复取舌苔上皮细胞3次，离心1000 r/min，5 min，收集沉淀，生理盐水混悬，然后涂片于经明胶处理的载玻片上。
1.3.5 舌苔脱落细胞EGFR检测
1.3.5.1 主要试剂 兔抗人EGFR单克隆抗体（武汉博士德生物工程有限公司）、浓缩型DAB显色试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）、0.01 mol/L磷酸盐缓冲液（PBS）（北京中杉金桥生物技术有限公司）、即用型SABC免疫组化染色试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）、4%多聚甲醛、H2O2、甲醇。
1.3.5.2 染色方法 涂片经4%多聚甲醛固定60～90 min后，双蒸水洗涤3次。于涂片上滴加30%H2O2甲醇+蒸馏水10份混合液，室温5～10 min灭活内源酶，双蒸水洗涤3次。滴加5%BSA封闭液，室温20 min，不洗。滴加兔抗人EGFR一抗，1：100稀释，4 ℃过夜。滴加生物素化羊抗兔IgG，37 ℃ 20 min，滴加SABC，37 ℃ 20 min，每步骤间均用0.01 mol/L PBS洗涤2～5 min，共3次。DAB显色，室温避光10 min，双蒸水充分洗涤。苏木素轻度复染1 min，DW水洗，干燥后镜下观察。
1.3.5.3 观察 EGFR免疫组化染色的着色部位为细胞膜和细胞浆。在20×10倍镜下随机观察5个视野，记录阳性细胞率和细胞着色强度值。阳性细胞率为阳性细胞和总计数细胞总数的比值。细胞着色强度根据着色程度进行分级，评分标准为：-（无）、±（淡黄）、+（棕黄）、++（棕褐），分别以1、2、3、4级表示其积分，对每个观察细胞进行分级，计数不同等级细胞数目，并计算各级细胞数目评分总和值和计数细胞的比值为细胞着色强度值。 1.4 统计学处理 应用SPSS 15.0统计学软件对数据进行处理，计量资料以（x±s）表示，比较采用One-way ANOVA方差分析，两因素之间的相关性采用spearman相关分析法，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 不同舌苔组的舌苔脱落细胞EGFR的表达比较 对照组的细胞着色强度值明显低于观察组不同舌苔组（P<0.05）；观察组中剥胎组细胞着色强度明显低于其他不同舌苔组（P<0.05）；黄厚胎组、薄黄胎组EGFR的细胞着色强度明显高于白厚胎组和薄白胎组（P<0.05）。各组EGFR的阳性细胞率比较结果如下：对照组阳性细胞率明显低于围绝经期不同舌苔组（P<0.05）；剥胎组阳性细胞率明显低于其他不同舌苔组（P<0.05）；黄厚胎组EGFR的阳性细胞率明显高于其他各组（P<0.05），见表1。
*与对照组比较，P<0.01；△与剥胎组比较，P<0.05；﹟与白厚胎组、薄白胎组比较，P<0.05；※与黄厚胎组比较，P<0.01
2.2 不同舌质组舌苔脱落细胞EGFR的表达比较 观察组不同舌质组EGFR的细胞着色强度值、阳性细胞率均高于对照组（P<0.05）；紫色舌质组EGFR的细胞着色强度值明显高于其他各舌质组（P<0.05）；其余各舌质组细胞着色强度值、阳性细胞率均无明显差异，见表2。
*与对照组比较，P<0.01；△与紫色舌质组比较，P<0.05
2.3 观察组EGFR表达与肝郁分级关系 对照组及观察组肝郁各级阳性细胞率为：对照组30例为（10.12±3.03）%；观察组肝郁0级27例为（43.74±5.11）%，肝郁1级22例为（47.89±2.14）%，肝郁2级33例为（48.65±3.66）%，肝郁3级18例为（55.86±4.31）%。观察组舌苔脱落细胞EGFR表达阳性率伴随肝郁等级的增加逐渐升高，两者呈正相关（R=0.375，P=0.000）。
3 讨论
表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）是原癌基因cerbB1/EGFR基因编码的Src族跨膜受体酪氨酸蛋白激酶。其主要位于细胞质膜上，当结合配体后二聚化并激活酪氨酸激酶活性，开启下游细胞信号转导通路，最终实现信号的跨膜转导。EGFR的分布十分广泛，不仅在哺乳动物的上皮细胞、人成纤维细胞、胶质、角质等细胞有表达等，还在多种肿瘤细胞中过度表达[4-6]。有研究发现，消化系统肿瘤患者EGFR浓度表达高的组别中，舌苔脱落细胞的直径明显增大，反映了EGFR在人体内对细胞分裂增殖有一定的促进作用[1]。
舌苔，是由于胃气蒸腾，脾湿上潮于舌所产生的一层位于舌体表面的苔状物[7]。当舌上皮细胞代谢旺盛时，角化层细胞脱落及时，则表现为正常的薄润舌苔。当由于生理性、病理性原因所导致的代谢异常情况发生时，角化层细胞会发生不完全角化或延迟脱落，舌象上则表现为异常厚苔。有学者发现健康薄白苔组和病理薄白苔组其舌面pH值呈中性或弱碱性，而病理厚苔组和剥落苔组则呈弱酸性。舌上皮细胞的增殖、分化、凋亡对于正常舌苔的形成并维持正常的生理学功能中发挥了重要作用，舌上皮细胞的异常增殖、分化、凋亡是影响舌苔变化的重要因素[8-9]。
本实验表明，围绝经期综合征患者舌苔脱落细胞EGFR细胞着色强度值及阳性率显著高于对照组，围绝经期患者舌苔脱落细胞EGFR表达阳性率与肝郁病理分级呈正相关，说明围绝经期患者舌苔脱落细胞EGFR的表达可以作为判断肝郁病变程度的重要参考。在今后的研究中，可以继续从基因、蛋白水平进行其相关性的研究，为进一步探讨舌苔变化与肝郁病理的关联，揭示舌苔的形成机制，为中医舌诊的临床研究提供理论参考。
参考文献
[1]侯亮，王瑞平，詹瑧，等.消化系统肿瘤患者舌苔脱落细胞EGFR表达及唾液EGFR含量研究[J].南京中医药大学学报（自然科学版），2003，5（19）：141-143.
[2]乐杰.妇产科学[M].北京：人民卫生出版社，2004：350-351.
[3]朱文锋.证素辨证学[M].北京：人民卫生出版社，2008：36-77.
[4] Engelman J A，Janne P A.Factors predicting response to EGFR tyrosine kinase inhibitoors[J].Seminars in respiratory and critical care medicine，2005，26（1）：314-322.
[5] Bazley L A，Gullick W J.The Epidermal growth factor receptor family[J].Endocr Relat Cancer，2005，12（1）：17-27.
[6] Scagliotti G V，Selvaggi G，Novello S，et al.The biology of epidermal growth factor receptor in lung cancer[J].Clinical Cancer Research，2004，10（2）：4227-4232.
[7]李灿东，高碧珍，兰启防，等.原发性不孕症舌印片与阴道脱落细胞的对照观察[J].福建中医药大学学报，2004，14（2）：3-6.
[8]吴正治，郭振球，李新华，等.七种常见舌苔的细胞化学计量诊断研究[J].北京中医药大学学报，1996，19（3）：57.
[9] Ahmed M M.Expression profile of apoptotic mediators and proliferative markers in oral squamous cell carcinoma[J].J Egypt Natl Canc Inst，2009，21（2）：85-92.
（收稿日期：2013-09-16） （本文编辑：蔡元元）
【关键词】 围绝经期综合征； 肝郁分级； 舌苔脱落细胞； EGFR
围绝经期综合征（Perimenopausal Syndrome），是指绝经前后的妇女，由于卵巢功能衰退乃至消失，雌激素分泌降低，所导致的自主神经功能紊乱和内分泌失调的一系列症状。中医药对于围绝经期综合征的治疗具有独特的疗效和优势，近年来受到越来越多的关注。围绝经期综合征在中医学范畴属于“经断前后诸证”、“绝经前后诸证”，其形成机制与绝经前后的生理特点有重要关系，而其中肝郁是其主要的病机之一。
舌苔脱落细胞作为舌苔的主要组成成分，其凋亡可能是影响舌苔变化的重要因素之一。EGFR作为表皮生长因子受体家族成员，与许多肿瘤细胞的增殖、血管生成及细胞凋亡的抑制有密切关系。有研究发现舌苔的厚薄与唾液中EGF的含量有关[1]。本研究对围绝经期综合征患者舌苔脱落细胞EGFR表达情况及中医肝郁分级情况进行了调查，并对两者之间的关系进行关联性研究，旨在探明舌苔变化与肝郁病理的内在联系，为中医舌诊的现代化、客观化研究提供理论参考。
1 资料与方法
1.1 一般资料 选取2012年5月-2013年3月在福建省立医院就诊的围绝经期患者共100例为观察组，年龄42～58岁，平均（47.11±4.35）岁，病程3.5～9.7个月；对照组为在福建省立医院健康体检中心进行体检的健康女性30例，年龄41～59岁，平均（48.13±2.81）岁。两组受试者年龄比较差异无统计学意义（P<0.05），具有可比性。
1.2 围绝经期综合征诊断标准及纳入、排除标准
1.2.1 诊断标准及纳入标准 围绝经期综合征西医诊断标准参照《妇产科学》[2]。观察组纳入标准：符合围绝经期综合征西医诊断标准且未经过雌、孕激素替代治疗者。对照组纳入标准：年龄40～59岁的健康妇女，月经周期规律。所有参与调查者均自愿签署《知情同意书》。
1.2.2 排除标准 凡不符合围绝经期综合征纳入标准者；乳腺肿瘤、侧卵巢切除、卵巢器质性病变、卵巢功能早衰者；原因不明的阴道不规则出血未治愈者；精神病患者；合并心脑血管、肝、肾、造血系统等严重疾病者。
1.3 试验方法 对所有患者进行四诊资料的采集，进行舌苔脱落细胞标本的采集和EGFR的检测；通过证素辩证计算肝郁积分，并对观察组患者按肝郁积分进行分级，其具体的方法如下。
1.3.1 四诊资料采集 按中医传统四诊方法进行资料的收集，将“600种常见症状的辨证意义”进行分解制定获得规范量表。由经过规范培训的中医专业人员进行四诊资料的采集，尽量确保资料的客观与准确性[3]。
1.3.2 证素辨证计算肝郁积分 参照“600种常见症状的辨证意义”[3]，将临床表现中属于肝郁要素的贡献度进行累积相加并求和，作为肝郁证素积分。积分<70，为0级，说明无肝郁病理改变；70≤积分<100，为1级，说明肝郁病理发生轻度改变；100≤积分<150，为2级，说明肝郁病理发生中度改变；积分≥150，为3级，说明肝郁病理发生重度改变。
1.3.3 舌象诊断 根据《中医诊断学》舌诊诊断标准，仔细观察受试者舌质和舌苔情况。根据观察结果，舌质分为淡白、淡红、红色、紫色4种，舌苔分为薄白、薄黄、白厚、黄厚4种。将观察组及对照组的舌质及舌苔情况记录填写在专用的临床观察表上。
1.3.4 舌苔脱落细胞采集 受试者空腹采集样本，患者将舌自然伸出，采集者用经消毒无菌的牙签平行于舌面取舌中部舌苔，置于盛有PBS缓冲液的15 mL离心管中，重复取舌苔上皮细胞3次，离心1000 r/min，5 min，收集沉淀，生理盐水混悬，然后涂片于经明胶处理的载玻片上。
1.3.5 舌苔脱落细胞EGFR检测
1.3.5.1 主要试剂 兔抗人EGFR单克隆抗体（武汉博士德生物工程有限公司）、浓缩型DAB显色试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）、0.01 mol/L磷酸盐缓冲液（PBS）（北京中杉金桥生物技术有限公司）、即用型SABC免疫组化染色试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）、4%多聚甲醛、H2O2、甲醇。
1.3.5.2 染色方法 涂片经4%多聚甲醛固定60～90 min后，双蒸水洗涤3次。于涂片上滴加30%H2O2甲醇+蒸馏水10份混合液，室温5～10 min灭活内源酶，双蒸水洗涤3次。滴加5%BSA封闭液，室温20 min，不洗。滴加兔抗人EGFR一抗，1：100稀释，4 ℃过夜。滴加生物素化羊抗兔IgG，37 ℃ 20 min，滴加SABC，37 ℃ 20 min，每步骤间均用0.01 mol/L PBS洗涤2～5 min，共3次。DAB显色，室温避光10 min，双蒸水充分洗涤。苏木素轻度复染1 min，DW水洗，干燥后镜下观察。
1.3.5.3 观察 EGFR免疫组化染色的着色部位为细胞膜和细胞浆。在20×10倍镜下随机观察5个视野，记录阳性细胞率和细胞着色强度值。阳性细胞率为阳性细胞和总计数细胞总数的比值。细胞着色强度根据着色程度进行分级，评分标准为：-（无）、±（淡黄）、+（棕黄）、++（棕褐），分别以1、2、3、4级表示其积分，对每个观察细胞进行分级，计数不同等级细胞数目，并计算各级细胞数目评分总和值和计数细胞的比值为细胞着色强度值。 1.4 统计学处理 应用SPSS 15.0统计学软件对数据进行处理，计量资料以（x±s）表示，比较采用One-way ANOVA方差分析，两因素之间的相关性采用spearman相关分析法，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 不同舌苔组的舌苔脱落细胞EGFR的表达比较 对照组的细胞着色强度值明显低于观察组不同舌苔组（P<0.05）；观察组中剥胎组细胞着色强度明显低于其他不同舌苔组（P<0.05）；黄厚胎组、薄黄胎组EGFR的细胞着色强度明显高于白厚胎组和薄白胎组（P<0.05）。各组EGFR的阳性细胞率比较结果如下：对照组阳性细胞率明显低于围绝经期不同舌苔组（P<0.05）；剥胎组阳性细胞率明显低于其他不同舌苔组（P<0.05）；黄厚胎组EGFR的阳性细胞率明显高于其他各组（P<0.05），见表1。
*与对照组比较，P<0.01；△与剥胎组比较，P<0.05；﹟与白厚胎组、薄白胎组比较，P<0.05；※与黄厚胎组比较，P<0.01
2.2 不同舌质组舌苔脱落细胞EGFR的表达比较 观察组不同舌质组EGFR的细胞着色强度值、阳性细胞率均高于对照组（P<0.05）；紫色舌质组EGFR的细胞着色强度值明显高于其他各舌质组（P<0.05）；其余各舌质组细胞着色强度值、阳性细胞率均无明显差异，见表2。
*与对照组比较，P<0.01；△与紫色舌质组比较，P<0.05
2.3 观察组EGFR表达与肝郁分级关系 对照组及观察组肝郁各级阳性细胞率为：对照组30例为（10.12±3.03）%；观察组肝郁0级27例为（43.74±5.11）%，肝郁1级22例为（47.89±2.14）%，肝郁2级33例为（48.65±3.66）%，肝郁3级18例为（55.86±4.31）%。观察组舌苔脱落细胞EGFR表达阳性率伴随肝郁等级的增加逐渐升高，两者呈正相关（R=0.375，P=0.000）。
3 讨论
表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）是原癌基因cerbB1/EGFR基因编码的Src族跨膜受体酪氨酸蛋白激酶。其主要位于细胞质膜上，当结合配体后二聚化并激活酪氨酸激酶活性，开启下游细胞信号转导通路，最终实现信号的跨膜转导。EGFR的分布十分广泛，不仅在哺乳动物的上皮细胞、人成纤维细胞、胶质、角质等细胞有表达等，还在多种肿瘤细胞中过度表达[4-6]。有研究发现，消化系统肿瘤患者EGFR浓度表达高的组别中，舌苔脱落细胞的直径明显增大，反映了EGFR在人体内对细胞分裂增殖有一定的促进作用[1]。
舌苔，是由于胃气蒸腾，脾湿上潮于舌所产生的一层位于舌体表面的苔状物[7]。当舌上皮细胞代谢旺盛时，角化层细胞脱落及时，则表现为正常的薄润舌苔。当由于生理性、病理性原因所导致的代谢异常情况发生时，角化层细胞会发生不完全角化或延迟脱落，舌象上则表现为异常厚苔。有学者发现健康薄白苔组和病理薄白苔组其舌面pH值呈中性或弱碱性，而病理厚苔组和剥落苔组则呈弱酸性。舌上皮细胞的增殖、分化、凋亡对于正常舌苔的形成并维持正常的生理学功能中发挥了重要作用，舌上皮细胞的异常增殖、分化、凋亡是影响舌苔变化的重要因素[8-9]。
本实验表明，围绝经期综合征患者舌苔脱落细胞EGFR细胞着色强度值及阳性率显著高于对照组，围绝经期患者舌苔脱落细胞EGFR表达阳性率与肝郁病理分级呈正相关，说明围绝经期患者舌苔脱落细胞EGFR的表达可以作为判断肝郁病变程度的重要参考。在今后的研究中，可以继续从基因、蛋白水平进行其相关性的研究，为进一步探讨舌苔变化与肝郁病理的关联，揭示舌苔的形成机制，为中医舌诊的临床研究提供理论参考。
参考文献
[1]侯亮，王瑞平，詹瑧，等.消化系统肿瘤患者舌苔脱落细胞EGFR表达及唾液EGFR含量研究[J].南京中医药大学学报（自然科学版），2003，5（19）：141-143.
[2]乐杰.妇产科学[M].北京：人民卫生出版社，2004：350-351.
[3]朱文锋.证素辨证学[M].北京：人民卫生出版社，2008：36-77.
[4] Engelman J A，Janne P A.Factors predicting response to EGFR tyrosine kinase inhibitoors[J].Seminars in respiratory and critical care medicine，2005，26（1）：314-322.
[5] Bazley L A，Gullick W J.The Epidermal growth factor receptor family[J].Endocr Relat Cancer，2005，12（1）：17-27.
[6] Scagliotti G V，Selvaggi G，Novello S，et al.The biology of epidermal growth factor receptor in lung cancer[J].Clinical Cancer Research，2004，10（2）：4227-4232.
[7]李灿东，高碧珍，兰启防，等.原发性不孕症舌印片与阴道脱落细胞的对照观察[J].福建中医药大学学报，2004，14（2）：3-6.
[8]吴正治，郭振球，李新华，等.七种常见舌苔的细胞化学计量诊断研究[J].北京中医药大学学报，1996，19（3）：57.
[9] Ahmed M M.Expression profile of apoptotic mediators and proliferative markers in oral squamous cell carcinoma[J].J Egypt Natl Canc Inst，2009，21（2）：85-92.
（收稿日期：2013-09-16） （本文编辑：蔡元元）