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摘 要 以胡桃楸的成熟合子胚为外植体，采用不同消毒方式和培养方式进行组织培养研究，分析了污染率和愈伤组织诱导率。结果表明：紫外线直射15 min灭菌效果最好，污染率及褐化率均最低，分别为15.82%和22.93%;暗培养时间长利于愈伤组织的诱导，以15 d左右为佳。
关键词 胡桃楸;外植体;诱导;愈伤组织
中图分类号：S723.1 文献标识码：A doi：10.13601/j.issn.1005-5215.2021.05.013
Abstract Taking mature zygotic embryos of Juglans mandshurica as explants，using different disinfection methods and culture methods for tissue culture research，and the pollution rate and induction of callus were analyzed.Result shows that the sterilization effect of direct ultraviolet radiation for 15 minutes is the optimal，and the pollution rate and browning rate are the lowest，which are 15.82% & 22.93%;the dark culture time is optimal for the induction of callus，preferably around 15 d.
Key words Juglans mandshurica;explants;induction;callus
胡桃楸（Juglans mandshurica）属胡桃科胡桃属的落叶乔木，在我国北方地区是一类果材兼具用珍贵树种，果实具有很高的食用价值，营养丰富，根茎叶有很高的药用价值，木材性状优良，在家具等行业也得到广泛应用。由此可知胡桃楸的栽植应用前景广阔。胡桃楸传统育苗方式主要采取播种繁殖，其种子具有深度休眠的特性，此种繁殖方法存在需要对休眠的种子进行处理且后代无法持续地将母树优良性状保存下来等问题，因此，发展无性繁殖方式优越性更加明显。
目前，胡桃楸无性繁殖方式中采取的主要方式是组织培养、扦插等，学者对胡桃楸的扦插[1，2]、组织培养[3，4]方面开展了一系列的研究，相对来说组织培养的优势更加明显，需要的空间小，不受到时间的限制，具有较大的扩繁系数，因此，本研究选择组织培养的方法，外植体选择成熟的合子胚，经过消毒、培养预处理后进行不定芽萌发效果的研究，为胡桃楸不定芽诱导植株再生体系的建立、实现育种技术的改良等方面提供一定的基础。
1 材料与方法
1.1 试验地点与材料
試验所需种子采集于辽宁省凌源市青龙河国家自然保护区，地理坐标为18°51′58″—119°09′39″ E，40°46′21″—40°53′02″ N，处于凌源市的燕山东段暖温带北缘。保护区主要保护人参、紫椴、黄檗、野大豆等珍稀濒危野生植物及其生境，保护天然侧柏林、天然胡桃楸、天然蒙古栎林等典型的原生植被和黑鹳、东方白鹳、金雕、大鸨等珍稀濒危野生动物及其栖息地。
青龙河保护区内胡桃楸天然林面积较大，采集保护区内胡桃楸优良母树种子，经过晾晒、外皮清理后放在干燥、通风、温度20～25 ℃条件下备用。在接种前敲碎外壳，将种子尖部的合子胚（带子叶少量）取出作为外植体用于不定芽的诱导试验。
1.2 试验方法
1.2.1 外植体消毒预处理试验
外植体消毒试验共设6个预处理，分别为：0.2%氯化汞溶液处理5 min、10 min;2%次氯酸钠溶液处理10 min、15 min;紫外线直射10 min、15 min。预处理前先取合子胚置于75%酒精溶液中，30 min后捞出按照不同的预处理方案实施消毒处理，用无菌水冲洗4～5遍，最后在培养基上接种。所选择的培养基为改良版的DKW空白培养基，其中每L培养基中另外添加了琼脂6 g、蔗糖30 g，pH控制在5.8左右。6个处理均设置3次重复，每次重复内有外植体8个。接种后2周进行污染率、褐化率调查统计。
1.2.2 外植体培养方法预处理试验
试验中外植体经过消毒后（选择1.2.1试验中效果最好的消毒预处理方式），转移到暗环境中进行培养。培养时间共设6个处理，分别为暗培养3、6、9、12、15、18 d。培养基选择改良后的DKW培养基（每L培养基中另外添加了蔗糖30 g、琼脂6 g、6-BA 2.0 mg、吲哚乙酸0.01 mg，pH控制在5.8左右），对不同暗培养时间愈伤诱导率进行调查。每个处理3次重复，每个重复内安排10个外植体。
按照不同时间处理后，将外植体接种到改良的DKW培养基上进行光培养，在控制温度25 ℃、光照强度1 500 lx、光照周期为14 h光照10 h黑暗的条件下培养。对培养后不定芽诱导情况进行统计分析。
1.3 调查统计方法
利用Excel、DPS进行数据处理。愈伤组织诱导率（%）=外植体中产生愈伤组织的个数/外植体接种总个数×100;不定芽诱导率（%）=外植体中产生不定芽的个数/外植体接种总个数×100。各处理取3次重复平均值。
2 结果与分析
2.1 不同消毒预处理方法对胡桃楸外植体消毒效果的影响
植物外植体消毒处理的效果直接影响后期组织培养的效果。本试验不同消毒预处理方法胡桃楸外植体污染率及褐化率见表1。根据表1可知，选择胡桃楸的成熟胚作为外植体，消毒预处理的方法不同，污染率及褐化率表现也不同：0.2%氯化汞溶液处理5 min的污染率最高，达到70.23%，极显著高于其他处理;其次是2%次氯酸钠溶液处理10 min，污染率为47.28%，与0.2%氯化汞溶液处理10 min、2%次氯酸钠溶液处理15 min的2个处理差异不显著，但极显著高于紫外线直射的2个处理;紫外线处理的污染率最低，且随着直射时间的延长，污染率极显著降低。根据表1可知，褐化率以0.2%氯化汞溶液处理10 min最高，达到62.12%，极显著高于其他处理;其次是2%次氯酸钠溶液的2个处理，但这2个处理之间差异不显著;以紫外线直射的褐化率最低，为20%以下，且直射时间越长，褐化率越低。 2.2 不同培养预处理方法对胡桃楸外植体愈伤诱导率及不定芽诱导效果的影响
胡桃楸成熟胚经过消毒预处理后，暗培养的时间不同，外植体愈伤诱导率、不定芽诱导率表现出不同程度的差异，结果见表2。根据表2可知，随着暗培养时间的延长，愈伤组织的诱导率逐渐增加，暗培养时间在12 d以内时，随着时间的延长诱导率明显增加，超过12 d后诱导率虽然有所增加，但是增加趋势不明显;在暗培养时间15 d以内时，外植体不定芽诱导率逐渐增加，15 d时达到最大，为36.8%，与暗培养12 d的处理差异显著，这2个处理极显著高于其他处理，超过15 d后，随着暗培养时间的延长，不定芽诱导率有所降低。
3 结论与讨论
在植物的组织培养中，外植体的预处理对培养的效果影响较大，目前在花楸[5]、非洲菊[6]等植物的组织培养中均有相关报道。预处理的方式多样，包括低温处理、暗培养、渗透压条件的改变[7]等。本试验以胡桃楸成熟的合子胚作为外植体开展研究，分析比较了不同消毒预处理方式、暗培养不同时间处理对胡桃楸外植体的污染率、愈伤组织诱导率、不定芽诱导率的差异，结果表明，紫外线直射的灭菌效果最好、污染率最低、褐化率最低，显著或极显著低于其他处理，这一结果与赵丽蒙等[8]学者的研究结论一致;随着暗培养时间的延长，胡桃楸外植体愈伤组织诱导率逐渐增加，先以极显著的差异增加，而后增加趋势减缓，差异不显著;不定芽诱导率变化趋势表现为先增加后降低，在暗培养15 d时达到最大值，为36.8%。
参考文献：
[1] 葛文志，刘忠玲，张海峰，等.胡桃楸嫩枝扦插繁殖影响因子研究[J].安徽农业科学，2015，133（2）：8-12
[2] 葛文志，刘建明，李业娟，等.胡桃楸嫩枝扦插技术及营养物质含量变化研究[J].森林工程，2011，32（5）：13-15
[3] 王杨洋，于海洋.核桃楸组织培养技术研究[J].防护林科技，2017（12）：13-14
[4] 张建瑛，邢亚娟，白卉，等.胡桃楸最佳初代组织培养选择的研究[J].林业科技，2011，36（6）：5-6
[5] 沈海龙，高翔翔，杨玲.甘露醇、蔗糖和低温预处理对花楸体细胞胚诱导的影响[J].植物生理学报，2008，44（4）：677-681
[6] 單芹丽，李绅崇，王继华，等.基因型和预处理对非洲菊胚珠离体培养的影响[J].江西农业学报，2015，27（7）：44-47
[7] 高振宇，黄大年.影响籼稻愈伤组织形成和植株再生能力的因素[J].植物生理学通讯，1999，35（3）：227-230
[8] 赵丽蒙，陆秀君，张丽杰，等.卫矛茎段组织培养中消毒方法及不定芽诱导[J].东北林业大学学报，2016，44（12）：21-25
关键词 胡桃楸;外植体;诱导;愈伤组织
中图分类号：S723.1 文献标识码：A doi：10.13601/j.issn.1005-5215.2021.05.013
Abstract Taking mature zygotic embryos of Juglans mandshurica as explants，using different disinfection methods and culture methods for tissue culture research，and the pollution rate and induction of callus were analyzed.Result shows that the sterilization effect of direct ultraviolet radiation for 15 minutes is the optimal，and the pollution rate and browning rate are the lowest，which are 15.82% & 22.93%;the dark culture time is optimal for the induction of callus，preferably around 15 d.
Key words Juglans mandshurica;explants;induction;callus
胡桃楸（Juglans mandshurica）属胡桃科胡桃属的落叶乔木，在我国北方地区是一类果材兼具用珍贵树种，果实具有很高的食用价值，营养丰富，根茎叶有很高的药用价值，木材性状优良，在家具等行业也得到广泛应用。由此可知胡桃楸的栽植应用前景广阔。胡桃楸传统育苗方式主要采取播种繁殖，其种子具有深度休眠的特性，此种繁殖方法存在需要对休眠的种子进行处理且后代无法持续地将母树优良性状保存下来等问题，因此，发展无性繁殖方式优越性更加明显。
目前，胡桃楸无性繁殖方式中采取的主要方式是组织培养、扦插等，学者对胡桃楸的扦插[1，2]、组织培养[3，4]方面开展了一系列的研究，相对来说组织培养的优势更加明显，需要的空间小，不受到时间的限制，具有较大的扩繁系数，因此，本研究选择组织培养的方法，外植体选择成熟的合子胚，经过消毒、培养预处理后进行不定芽萌发效果的研究，为胡桃楸不定芽诱导植株再生体系的建立、实现育种技术的改良等方面提供一定的基础。
1 材料与方法
1.1 试验地点与材料
試验所需种子采集于辽宁省凌源市青龙河国家自然保护区，地理坐标为18°51′58″—119°09′39″ E，40°46′21″—40°53′02″ N，处于凌源市的燕山东段暖温带北缘。保护区主要保护人参、紫椴、黄檗、野大豆等珍稀濒危野生植物及其生境，保护天然侧柏林、天然胡桃楸、天然蒙古栎林等典型的原生植被和黑鹳、东方白鹳、金雕、大鸨等珍稀濒危野生动物及其栖息地。
青龙河保护区内胡桃楸天然林面积较大，采集保护区内胡桃楸优良母树种子，经过晾晒、外皮清理后放在干燥、通风、温度20～25 ℃条件下备用。在接种前敲碎外壳，将种子尖部的合子胚（带子叶少量）取出作为外植体用于不定芽的诱导试验。
1.2 试验方法
1.2.1 外植体消毒预处理试验
外植体消毒试验共设6个预处理，分别为：0.2%氯化汞溶液处理5 min、10 min;2%次氯酸钠溶液处理10 min、15 min;紫外线直射10 min、15 min。预处理前先取合子胚置于75%酒精溶液中，30 min后捞出按照不同的预处理方案实施消毒处理，用无菌水冲洗4～5遍，最后在培养基上接种。所选择的培养基为改良版的DKW空白培养基，其中每L培养基中另外添加了琼脂6 g、蔗糖30 g，pH控制在5.8左右。6个处理均设置3次重复，每次重复内有外植体8个。接种后2周进行污染率、褐化率调查统计。
1.2.2 外植体培养方法预处理试验
试验中外植体经过消毒后（选择1.2.1试验中效果最好的消毒预处理方式），转移到暗环境中进行培养。培养时间共设6个处理，分别为暗培养3、6、9、12、15、18 d。培养基选择改良后的DKW培养基（每L培养基中另外添加了蔗糖30 g、琼脂6 g、6-BA 2.0 mg、吲哚乙酸0.01 mg，pH控制在5.8左右），对不同暗培养时间愈伤诱导率进行调查。每个处理3次重复，每个重复内安排10个外植体。
按照不同时间处理后，将外植体接种到改良的DKW培养基上进行光培养，在控制温度25 ℃、光照强度1 500 lx、光照周期为14 h光照10 h黑暗的条件下培养。对培养后不定芽诱导情况进行统计分析。
1.3 调查统计方法
利用Excel、DPS进行数据处理。愈伤组织诱导率（%）=外植体中产生愈伤组织的个数/外植体接种总个数×100;不定芽诱导率（%）=外植体中产生不定芽的个数/外植体接种总个数×100。各处理取3次重复平均值。
2 结果与分析
2.1 不同消毒预处理方法对胡桃楸外植体消毒效果的影响
植物外植体消毒处理的效果直接影响后期组织培养的效果。本试验不同消毒预处理方法胡桃楸外植体污染率及褐化率见表1。根据表1可知，选择胡桃楸的成熟胚作为外植体，消毒预处理的方法不同，污染率及褐化率表现也不同：0.2%氯化汞溶液处理5 min的污染率最高，达到70.23%，极显著高于其他处理;其次是2%次氯酸钠溶液处理10 min，污染率为47.28%，与0.2%氯化汞溶液处理10 min、2%次氯酸钠溶液处理15 min的2个处理差异不显著，但极显著高于紫外线直射的2个处理;紫外线处理的污染率最低，且随着直射时间的延长，污染率极显著降低。根据表1可知，褐化率以0.2%氯化汞溶液处理10 min最高，达到62.12%，极显著高于其他处理;其次是2%次氯酸钠溶液的2个处理，但这2个处理之间差异不显著;以紫外线直射的褐化率最低，为20%以下，且直射时间越长，褐化率越低。 2.2 不同培养预处理方法对胡桃楸外植体愈伤诱导率及不定芽诱导效果的影响
胡桃楸成熟胚经过消毒预处理后，暗培养的时间不同，外植体愈伤诱导率、不定芽诱导率表现出不同程度的差异，结果见表2。根据表2可知，随着暗培养时间的延长，愈伤组织的诱导率逐渐增加，暗培养时间在12 d以内时，随着时间的延长诱导率明显增加，超过12 d后诱导率虽然有所增加，但是增加趋势不明显;在暗培养时间15 d以内时，外植体不定芽诱导率逐渐增加，15 d时达到最大，为36.8%，与暗培养12 d的处理差异显著，这2个处理极显著高于其他处理，超过15 d后，随着暗培养时间的延长，不定芽诱导率有所降低。
3 结论与讨论
在植物的组织培养中，外植体的预处理对培养的效果影响较大，目前在花楸[5]、非洲菊[6]等植物的组织培养中均有相关报道。预处理的方式多样，包括低温处理、暗培养、渗透压条件的改变[7]等。本试验以胡桃楸成熟的合子胚作为外植体开展研究，分析比较了不同消毒预处理方式、暗培养不同时间处理对胡桃楸外植体的污染率、愈伤组织诱导率、不定芽诱导率的差异，结果表明，紫外线直射的灭菌效果最好、污染率最低、褐化率最低，显著或极显著低于其他处理，这一结果与赵丽蒙等[8]学者的研究结论一致;随着暗培养时间的延长，胡桃楸外植体愈伤组织诱导率逐渐增加，先以极显著的差异增加，而后增加趋势减缓，差异不显著;不定芽诱导率变化趋势表现为先增加后降低，在暗培养15 d时达到最大值，为36.8%。
参考文献：
[1] 葛文志，刘忠玲，张海峰，等.胡桃楸嫩枝扦插繁殖影响因子研究[J].安徽农业科学，2015，133（2）：8-12
[2] 葛文志，刘建明，李业娟，等.胡桃楸嫩枝扦插技术及营养物质含量变化研究[J].森林工程，2011，32（5）：13-15
[3] 王杨洋，于海洋.核桃楸组织培养技术研究[J].防护林科技，2017（12）：13-14
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[5] 沈海龙，高翔翔，杨玲.甘露醇、蔗糖和低温预处理对花楸体细胞胚诱导的影响[J].植物生理学报，2008，44（4）：677-681
[6] 單芹丽，李绅崇，王继华，等.基因型和预处理对非洲菊胚珠离体培养的影响[J].江西农业学报，2015，27（7）：44-47
[7] 高振宇，黄大年.影响籼稻愈伤组织形成和植株再生能力的因素[J].植物生理学通讯，1999，35（3）：227-230
[8] 赵丽蒙，陆秀君，张丽杰，等.卫矛茎段组织培养中消毒方法及不定芽诱导[J].东北林业大学学报，2016，44（12）：21-25