论文部分内容阅读
中图分类号 R917 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2019）02-0188-05
DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.02.09
摘 要 目的：建立小金胶囊的高效液相色谱（HPLC）指纹图谱，并进行主成分分析。方法：采用HPLC法。色谱柱为Agilent TC-C18（2），流动相为乙腈-0.2%磷酸溶液（梯度洗脱），流速为1.0 mL/min，检测波长为240 nm，柱温为25 ℃，进样量为20 μL。以11-羰基-β-乙酰乳香酸為参照，绘制15批样品的HPLC图谱，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2004 A版）进行相似度评价，确定共有峰，并采用Minitab 17.0软件进行主成分分析。结果：有1批样品相似度小于0.800，且与其他14批样品比较缺13、14、15号共有峰，可能存在质量差异而未进行相关分析。其余14批样品的HPLC图谱有15个共有峰，指认了3个色谱峰，分别为槲皮素、穗花杉双黄酮、11-羰基-β-乙酰乳香酸；14批样品的相似度为0.889～0.990。经主成分分析，2个主成分因子的累积方差贡献率为94.4%，样品中8、9、11、12、14号共有峰（特别是8、9号共有峰）对应成分的含量变化是导致样品质量差异的重要原因。结论：所建指纹图谱及主成分分析结果可为小金胶囊的质量评价提供参考。
关键词 小金胶囊；高效液相色谱法；指纹图谱；主成分分析
ABSTRACT OBJECTIVE： To establish HPLC fingerprint of Xiaojin capsules， and to conduct principal component analysis. METHODS： HPLC method was adopted. The determination was performed on Agilent TC-C18（2） column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.2% formic acid solution （gradient elution） at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was 240 nm， and column temperature was 25 ℃. The sample size was 20 ?L. Acetyl-11-keto-β-boswellic acid was used as reference and HPLC fingerprints of 15 batches of Xiaojin capsules were determined. The similarity evaluation of common peaks was conducted by using the TCM Chromatographic Fingerprint Similarity Evaluation System （2004A edition） to confirm common peaks. Principal component analysis was conducted by using Minitab 17.0 software. RESULTS： The similarity of 1 batch of sample was lower than 0.800； there was no common peaks No. 13， 14， 15 in HPLC chromatogram of the batch， compared with other 14 batches. There were 15 common peaks in the HPLC fingerprints of 14 batches of samples and three chromatographic peaks were identified， such as quercetin，amentoflavone， acetyl-11-keto-β-boswellic acid. The similarity of 14 batches ranged 0.889-0.990. Through principal component analysis， accumulative contribution rate of 2 principal component factors was 94.4%. It was indicated that the content change of corresponding components of common peaks No. 8， 9， 11， 12， 14 in samples was an important reason for the quality difference of samples， especially common peaks No.8， 9. CONCLUSIONS： The established HPLC fingerprint and principal component analysis can provide reference for quality evaluation of Xiaojin capsules.
KEYWORDS Xiaojin capsules； HPLC； Fingerprint； Principal component analysis
小金胶囊处方源于中医经典名方“小金丹”[1]，主要由人工麝香、木鳖子、制草乌、枫香脂、乳香、没药、当归、五灵脂、地龙、香墨等10味中药材组成，具有散结消肿、化瘀止痛之功效，用于阴疽初起、皮色不变、肿硬作痛、多发性脓肿、瘿瘤、瘰疬、乳岩、乳癖等[2]。其作为疽证研究的代表方，临床上定位为疽证相关疾病的初期或是痈疽类疾病的慢性期，可用于治疗甲状腺结节、淋巴结核、子宫肌瘤、乳腺增生、乳腺癌、前列腺增生等症[3-4]。 中药具有多成分、多靶点协同作用的特点，这些特点决定了难以用其中单个或几个成分来准确、全面地表达中药的质量和疗效，需对中药质量进行全面控制和多种药效成分的综合评价[5-6]。2015年版《中国药典》（一部）对小金胶囊的质量控制仅规定了鉴别、杂质质量和麝香酮的含量测定[2]，但其作为复方制剂，现行质量标准存在较大局限性，难以全面地评价其质量。指纹图谱技术是整体表征中药所含成分及其质量的一种有效方法，是目前中药及中药制剂质量控制的有效手段之一[7-8]。因此，本课题组采用高效液相色谱法（HPLC）建立了小金胶囊的指纹图谱，并结合主成分分析进行综合评价，旨在为其质量控制提供参考。
1 材料
1.1 仪器
LC-2040C CN型HPLC仪，包括二极管阵列检测器、Labsolutions工作站（日本Shimadzu公司）；PGJ-10/20-AS型超纯水仪（武汉品冠仪器设备有限公司）；UA800-DH型超声波清洗仪（上海欧河机械设备有限公司）；ME203E型千分之一电子天平、ME104E型万分之一电子天平、CP225D型十万分之一电子天平[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]。
1.2 药品与试剂
穗花杉双黄酮对照品（批号：111902-201603，纯度：97.7%）、11-羰基-β-乙酰乳香酸对照品（批号：111760- 201502，纯度：99.3%）、槲皮素对照品（批号：100081- 201610，纯度：99.8%）均购自中国食品药品检定研究院；小金胶囊（健民药业集团股份有限公司，批号：160601、170101、170102、 170107、170117、170121、170123、170124、170329、170334、170336、170544、170554、170868、171126，编号：S1～S15，规格：0.35 g/粒）；乙腈、甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为纯化水。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱：Agilent TC-C18（2）（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.2%磷酸溶液（B），梯度洗脱（洗脱程序见表1）；流速：1.0 mL/min；检测波长：240 nm；柱温：25 ℃；进样量：20 ?L。
2.2 溶液的制备
2.2.1 对照品溶液 精密称取穗花杉双黄酮、11-羰基-β-乙酰乳香酸、槲皮素对照品适量，分别加甲醇制成穗花杉双黄酮50 ?g/mL、11-羰基-β-乙酰乳香酸50 ?g/mL、槲皮素50 ?g/mL的单一对照品溶液。
2.2.2 供试品溶液 取小金胶囊内容物适量，研细，精密称定2 g，置于具塞锥形瓶中，加甲醇25 mL，称定质量，水温25 ℃以下超声（功率：300 W，频率：40 Hz）处理30 min，放冷，再次称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
2.3 方法学考察
2.3.1 精密度试验 取“2.2.2”项下供试品溶液（批号：170101）适量，按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，以11-羰基-β-乙酰乳香酸峰的保留时间和峰面积为参照，记录各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果，15个共有峰相对保留时间的RSD均小于0.15%（n=6），相对峰面积的RSD均小于1.70%（n=6），表明本方法精密度良好。
2.3.2 稳定性试验 取“2.2.2”项下供试品溶液（批号：170101）适量，分别于室温下放置0、2.5、5、7.5、10、12.5、24 h时按“2.1”项下色谱条件进样测定，以11-羰基-β-乙酰乳香酸峰的保留时间和峰面积为参照，记录各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果，15个共有峰相对保留时间的RSD均小于0.50%（n=7），相对峰面积的RSD均小于1.60%（n=7），表明供试品溶液于室温下放置24 h内基本稳定。
2.3.3 重复性试验 取小金胶囊（批号：170101）内容物适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，共6份，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，以11-羰基-β-乙酰乳香酸峰的保留时间和峰面积为参照，记录各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果，15个共有峰相对保留时间的RSD均小于0.19%（n=6），相对峰面积的RSD均小于2.50%（n=6），表明本方法重复性良好。
2.4 HPLC指纹图谱的生成与相似度评价、共有峰的指认及相关分析
2.4.1 HPLC指纹图谱的生成 取15批小金胶囊内容物适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2004 A版）对15批样品的HPLC图谱进行分析，得HPLC指纹图谱，详见图1、图2。
2.4.2 相似度分析 采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2004 A版），以样品的HPLC对照指纹图谱为参照，进行整体相似度评价。结果显示，15批样品中有14批样品相似度大于0.880，其中13批样品的相似度大于0.900；仅有1批样品（批号：160601）相似度小于0.800，表明该批样品与其他样品间存在质量差异，详见表2。
2.4.3 共有峰的指认 分别取“2.2.1”项下穗花杉双黄酮、11-羰基-β-乙酰乳香酸、槲皮素单一对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，并与样品的HPLC对照指纹图谱进行对比指认。结果，共有峰中4、6、12号色谱峰分别指认为槲皮素、穗花杉双黄酮、11-羰基-β-乙酰乳香酸，详见图3。
2.4.4 共有峰的相关分析 14批样品共有15个共有峰，其峰面积总和占色谱峰总面积的85.7%，详见表3[因S1批样品与其他样品比较，缺13、14、15號共有峰，可能存在质量异常，故该批样品未进行后续相关分析，仅对其余14批（S2～S15）样品进行相关分析]。通过与对照品的HPLC图对比指认，12号峰11-羰基-β-乙酰乳香酸峰的峰面积较大、分离度较好，在HPLC图谱中较稳定，故以其保留时间和峰面积为参照，计算其他峰相对于12号峰的相对保留时间、相对峰面积及相对标准偏差（RSD），详见表4、表5。
DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.02.09
摘 要 目的：建立小金胶囊的高效液相色谱（HPLC）指纹图谱，并进行主成分分析。方法：采用HPLC法。色谱柱为Agilent TC-C18（2），流动相为乙腈-0.2%磷酸溶液（梯度洗脱），流速为1.0 mL/min，检测波长为240 nm，柱温为25 ℃，进样量为20 μL。以11-羰基-β-乙酰乳香酸為参照，绘制15批样品的HPLC图谱，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2004 A版）进行相似度评价，确定共有峰，并采用Minitab 17.0软件进行主成分分析。结果：有1批样品相似度小于0.800，且与其他14批样品比较缺13、14、15号共有峰，可能存在质量差异而未进行相关分析。其余14批样品的HPLC图谱有15个共有峰，指认了3个色谱峰，分别为槲皮素、穗花杉双黄酮、11-羰基-β-乙酰乳香酸；14批样品的相似度为0.889～0.990。经主成分分析，2个主成分因子的累积方差贡献率为94.4%，样品中8、9、11、12、14号共有峰（特别是8、9号共有峰）对应成分的含量变化是导致样品质量差异的重要原因。结论：所建指纹图谱及主成分分析结果可为小金胶囊的质量评价提供参考。
关键词 小金胶囊；高效液相色谱法；指纹图谱；主成分分析
ABSTRACT OBJECTIVE： To establish HPLC fingerprint of Xiaojin capsules， and to conduct principal component analysis. METHODS： HPLC method was adopted. The determination was performed on Agilent TC-C18（2） column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.2% formic acid solution （gradient elution） at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was 240 nm， and column temperature was 25 ℃. The sample size was 20 ?L. Acetyl-11-keto-β-boswellic acid was used as reference and HPLC fingerprints of 15 batches of Xiaojin capsules were determined. The similarity evaluation of common peaks was conducted by using the TCM Chromatographic Fingerprint Similarity Evaluation System （2004A edition） to confirm common peaks. Principal component analysis was conducted by using Minitab 17.0 software. RESULTS： The similarity of 1 batch of sample was lower than 0.800； there was no common peaks No. 13， 14， 15 in HPLC chromatogram of the batch， compared with other 14 batches. There were 15 common peaks in the HPLC fingerprints of 14 batches of samples and three chromatographic peaks were identified， such as quercetin，amentoflavone， acetyl-11-keto-β-boswellic acid. The similarity of 14 batches ranged 0.889-0.990. Through principal component analysis， accumulative contribution rate of 2 principal component factors was 94.4%. It was indicated that the content change of corresponding components of common peaks No. 8， 9， 11， 12， 14 in samples was an important reason for the quality difference of samples， especially common peaks No.8， 9. CONCLUSIONS： The established HPLC fingerprint and principal component analysis can provide reference for quality evaluation of Xiaojin capsules.
KEYWORDS Xiaojin capsules； HPLC； Fingerprint； Principal component analysis
小金胶囊处方源于中医经典名方“小金丹”[1]，主要由人工麝香、木鳖子、制草乌、枫香脂、乳香、没药、当归、五灵脂、地龙、香墨等10味中药材组成，具有散结消肿、化瘀止痛之功效，用于阴疽初起、皮色不变、肿硬作痛、多发性脓肿、瘿瘤、瘰疬、乳岩、乳癖等[2]。其作为疽证研究的代表方，临床上定位为疽证相关疾病的初期或是痈疽类疾病的慢性期，可用于治疗甲状腺结节、淋巴结核、子宫肌瘤、乳腺增生、乳腺癌、前列腺增生等症[3-4]。 中药具有多成分、多靶点协同作用的特点，这些特点决定了难以用其中单个或几个成分来准确、全面地表达中药的质量和疗效，需对中药质量进行全面控制和多种药效成分的综合评价[5-6]。2015年版《中国药典》（一部）对小金胶囊的质量控制仅规定了鉴别、杂质质量和麝香酮的含量测定[2]，但其作为复方制剂，现行质量标准存在较大局限性，难以全面地评价其质量。指纹图谱技术是整体表征中药所含成分及其质量的一种有效方法，是目前中药及中药制剂质量控制的有效手段之一[7-8]。因此，本课题组采用高效液相色谱法（HPLC）建立了小金胶囊的指纹图谱，并结合主成分分析进行综合评价，旨在为其质量控制提供参考。
1 材料
1.1 仪器
LC-2040C CN型HPLC仪，包括二极管阵列检测器、Labsolutions工作站（日本Shimadzu公司）；PGJ-10/20-AS型超纯水仪（武汉品冠仪器设备有限公司）；UA800-DH型超声波清洗仪（上海欧河机械设备有限公司）；ME203E型千分之一电子天平、ME104E型万分之一电子天平、CP225D型十万分之一电子天平[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]。
1.2 药品与试剂
穗花杉双黄酮对照品（批号：111902-201603，纯度：97.7%）、11-羰基-β-乙酰乳香酸对照品（批号：111760- 201502，纯度：99.3%）、槲皮素对照品（批号：100081- 201610，纯度：99.8%）均购自中国食品药品检定研究院；小金胶囊（健民药业集团股份有限公司，批号：160601、170101、170102、 170107、170117、170121、170123、170124、170329、170334、170336、170544、170554、170868、171126，编号：S1～S15，规格：0.35 g/粒）；乙腈、甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为纯化水。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱：Agilent TC-C18（2）（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.2%磷酸溶液（B），梯度洗脱（洗脱程序见表1）；流速：1.0 mL/min；检测波长：240 nm；柱温：25 ℃；进样量：20 ?L。
2.2 溶液的制备
2.2.1 对照品溶液 精密称取穗花杉双黄酮、11-羰基-β-乙酰乳香酸、槲皮素对照品适量，分别加甲醇制成穗花杉双黄酮50 ?g/mL、11-羰基-β-乙酰乳香酸50 ?g/mL、槲皮素50 ?g/mL的单一对照品溶液。
2.2.2 供试品溶液 取小金胶囊内容物适量，研细，精密称定2 g，置于具塞锥形瓶中，加甲醇25 mL，称定质量，水温25 ℃以下超声（功率：300 W，频率：40 Hz）处理30 min，放冷，再次称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
2.3 方法学考察
2.3.1 精密度试验 取“2.2.2”项下供试品溶液（批号：170101）适量，按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，以11-羰基-β-乙酰乳香酸峰的保留时间和峰面积为参照，记录各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果，15个共有峰相对保留时间的RSD均小于0.15%（n=6），相对峰面积的RSD均小于1.70%（n=6），表明本方法精密度良好。
2.3.2 稳定性试验 取“2.2.2”项下供试品溶液（批号：170101）适量，分别于室温下放置0、2.5、5、7.5、10、12.5、24 h时按“2.1”项下色谱条件进样测定，以11-羰基-β-乙酰乳香酸峰的保留时间和峰面积为参照，记录各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果，15个共有峰相对保留时间的RSD均小于0.50%（n=7），相对峰面积的RSD均小于1.60%（n=7），表明供试品溶液于室温下放置24 h内基本稳定。
2.3.3 重复性试验 取小金胶囊（批号：170101）内容物适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，共6份，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，以11-羰基-β-乙酰乳香酸峰的保留时间和峰面积为参照，记录各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果，15个共有峰相对保留时间的RSD均小于0.19%（n=6），相对峰面积的RSD均小于2.50%（n=6），表明本方法重复性良好。
2.4 HPLC指纹图谱的生成与相似度评价、共有峰的指认及相关分析
2.4.1 HPLC指纹图谱的生成 取15批小金胶囊内容物适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2004 A版）对15批样品的HPLC图谱进行分析，得HPLC指纹图谱，详见图1、图2。
2.4.2 相似度分析 采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2004 A版），以样品的HPLC对照指纹图谱为参照，进行整体相似度评价。结果显示，15批样品中有14批样品相似度大于0.880，其中13批样品的相似度大于0.900；仅有1批样品（批号：160601）相似度小于0.800，表明该批样品与其他样品间存在质量差异，详见表2。
2.4.3 共有峰的指认 分别取“2.2.1”项下穗花杉双黄酮、11-羰基-β-乙酰乳香酸、槲皮素单一对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，并与样品的HPLC对照指纹图谱进行对比指认。结果，共有峰中4、6、12号色谱峰分别指认为槲皮素、穗花杉双黄酮、11-羰基-β-乙酰乳香酸，详见图3。
2.4.4 共有峰的相关分析 14批样品共有15个共有峰，其峰面积总和占色谱峰总面积的85.7%，详见表3[因S1批样品与其他样品比较，缺13、14、15號共有峰，可能存在质量异常，故该批样品未进行后续相关分析，仅对其余14批（S2～S15）样品进行相关分析]。通过与对照品的HPLC图对比指认，12号峰11-羰基-β-乙酰乳香酸峰的峰面积较大、分离度较好，在HPLC图谱中较稳定，故以其保留时间和峰面积为参照，计算其他峰相对于12号峰的相对保留时间、相对峰面积及相对标准偏差（RSD），详见表4、表5。