探讨人抗原R在体外培养的小鼠心肌细胞自噬过程中对溶酶体酸化的作用。
方法取1～2 d龄C57BL/6小鼠(雌雄不限)20只，分离心脏培养原代心肌细胞，进行以下实验。(1)采用随机数字表法(分组方法下同)将细胞分为5组，即正常对照组和无糖无血清0.5、1.0、3.0、6.0 h组。正常对照组用DMEM/F12培养基常规培养(常规培养条件下同)54.0 h，无糖无血清0.5、1.0、3.0、6.0 h组常规培养53.5、53.0、51.0、48.0 h后更换无糖无血清培养基分别处理0.5、1.0、3.0、6.0 h，蛋白质印迹法检测细胞总蛋白中微管相关蛋白1轻链3Ⅱ(LC3Ⅱ)、自噬相关蛋白5、腺苷三磷酸酶V1区E1亚基(ATP6V1E1)蛋白表达。(2)将细胞分为正常对照组和无糖无血清3.0 h组，相应各组细胞处理同实验(1)，激光扫描共聚焦显微镜下观测细胞溶酶体酸化水平。(3)取2个批次细胞，均同实验(1)分组处理，蛋白质印迹法检测一个批次细胞总蛋白及另一个批次细胞胞质、胞核蛋白中人抗原R蛋白表达。(4)将细胞分为正常对照组、单纯对照小干扰RNA(siRNA)组、单纯人抗原R-siRNA1(HuR-siRNA1)组、单纯HuR-siRNA2组、无糖无血清3.0 h组、无糖无血清＋对照siRNA组、无糖无血清＋HuR-siRNA1组、无糖无血清＋HuR-siRNA2组。常规培养48 h后，单纯对照siRNA组及无糖无血清＋对照siRNA组加入阴性对照siRNA、单纯HuR-siRNA1组及无糖无血清＋HuR-siRNA1组加入HuR-siRNA1、单纯HuR-siRNA2组及无糖无血清＋HuR-siRNA2组加入HuR-siRNA2转染6 h，8组均继续常规培养48 h后，正常对照组及各单纯siRNA处理组更换DMEM/F12培养基、其余各组更换无糖无血清培养基培养3 h，蛋白质印迹法检测细胞总蛋白中人抗原R蛋白表达。(5)取2个批次细胞，均分为无糖无血清＋对照siRNA组、无糖无血清＋HuR-siRNA1组，相应各组细胞处理同实验(4)，免疫荧光法观测一个批次细胞人抗原R分布及表达，激光扫描共聚焦显微镜下观测另一批次细胞溶酶体酸化水平。(6)取3个批次细胞，均分为无糖无血清3.0 h组、无糖无血清＋对照siRNA组、无糖无血清＋HuR-siRNA1组、无糖无血清＋HuR-siRNA2组，相应各组细胞处理同实验(4)，蛋白质印迹法检测一个批次细胞总蛋白中组织蛋白酶D、一个批次细胞胞质蛋白中人抗原R及另一个批次细胞总蛋白中ATP6V1E1蛋白表达。(7)将细胞分为正常对照组、无糖无血清3.0 h组、无糖无血清＋对照siRNA组、无糖无血清＋HuR-siRNA1组，相应各组细胞处理同实验(4)，实时荧光定量反转录PCR法检测细胞ATP6V1E1 mRNA表达。各实验样本数均为3。对数据进行独立样本t检验、单因素方差分析、LSD-t检验、Bonferroni校正。
结果(1)与正常对照组比较，无糖无血清1.0、3.0、6.0 h组细胞总蛋白中LC3Ⅱ、ATP6V1E1蛋白表达显著增加(t＝12.16、4.05、4.82，11.64、3.29、8.37，P<0.05或P<0.01)，无糖无血清0.5、1.0、3.0、6.0 h组细胞总蛋白中自噬相关蛋白5蛋白表达显著增加(t＝6.88、10.56、5.76、9.91，P<0.05或P<0.01)。(2)与正常对照组的1.03±0.08比较，无糖无血清3.0 h组细胞溶酶体酸化水平(2.92±0.30)明显升高(t＝6.01，P<0.01)。(3)5组细胞总蛋白中人抗原R蛋白表达组间总体比较，差异无统计学意义(F＝1.09，P>0.05)。与正常对照组比较，无糖无血清1.0、3.0、6.0 h组细胞胞质蛋白中人抗原R蛋白表达显著增加(t＝43.05、11.07、5.39，P<0.05或P<0.01)，无糖无血清3.0、6.0 h组细胞胞核蛋白中人抗原R蛋白表达显著减少(t＝11.18、12.71，P<0.01)。(4)与单纯对照siRNA组比较，单纯HuR-siRNA1组、单纯HuR-siRNA2组细胞总蛋白中人抗原R蛋白表达显著减少(t＝4.82、4.44，P<0.05)。与无糖无血清＋对照siRNA组比较，无糖无血清＋HuR-siRNA1组、无糖无血清＋HuR-siRNA2组细胞总蛋白中人抗原R蛋白表达显著减少(t＝4.39、6.27，P<0.05)。(5)与无糖无血清＋对照siRNA组比较，无糖无血清＋HuR-siRNA1组细胞胞质中人抗原R分布减少、表达水平显著降低(t＝10.13，P<0.01)。与无糖无血清＋对照siRNA组的1.00±0.06比较，无糖无血清＋HuR-siRNA1组细胞溶酶体酸化水平(0.73±0.06)显著下降(t＝3.28，P<0.01)。(6)与无糖无血清＋对照siRNA组比较，无糖无血清＋HuR-siRNA1组、无糖无血清＋HuR-siRNA2组细胞总蛋白中组织蛋白酶D、胞质蛋白中人抗原R、总蛋白中ATP6V1E1蛋白表达均显著减少(t＝4.16、3.99，4.81、5.07，11.68、12.97，P<0.05或P<0.01)。(7)与正常对照组比较，无糖无血清3.0 h组细胞中ATP6V1E1 mRNA表达显著增加(t＝5.51，P<0.05)。与无糖无血清＋对照siRNA组比较，无糖无血清＋HuR-siRNA1组细胞中ATP6V1E1 mRNA表达显著减少(t＝5.97，P<0.05)。
结论小鼠原代心肌细胞在体外无糖无血清处理后自噬激活、溶酶体酸化增强、胞质中人抗原R表达增加，人抗原R功能激活并参与维持小鼠心肌细胞自噬过程中的溶酶体酸化。