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摘要：利用载体沉积法制备a-细辛脑前体脂质体，以包封率为考察指标，采用Box-Behnken Design-响应面优化法（BBD-RSM）优化最佳制备工艺；以渗漏率为指标分别考察a-细辛脑前体脂质体的固体粉末和溶液在4℃和室温6个月内的稳定性.优化后的最佳工艺为：卵磷脂用量1.90 g，卵磷脂与胆固醇的重比为6.63：1，卵磷脂与a-细辛脑重比为27.08：1，药物的包封率为93.36%.a-细辛脑前体脂质体固体粉末4℃和25℃放置都较稳定，其体外释放规律符合Hignchi方程.该优化工艺稳定可靠，a-细辛脑前体脂质体固体粉末可在室温条件下贮存，其在体外具有良好的缓释作用。
关键词：a-细辛脑；前体脂质体；响应面优化；稳定性；体外释放
0引言
a-细辛脑（asarone），即（2，4，5-三甲氧基-1-丙烯基苯）是天南星科植物石菖蒲的主要有效成分之一，又名a-细辛醚，可用于止咳、化痰、平喘，对肺炎、慢性气管炎均有较好的疗效，a-细辛脑熔点低、脂溶性强，制成生物利用度高的口服固体制剂有一定困难。
脂质体是临床应用较多的药物靶向传递系统之一，但普通脂质体大多数情况下以混悬液的形式存在，长时间存放不稳定，易发生分层、凝聚、沉降、分解、药物渗漏等情况前体脂质体（prolipo-somes）是将脂质体膜材和药物的混合液在减压搅拌下逐步分布到一种可溶性固体载体表面，从而形成自由流动的粉体状制剂即为前体脂质体，可解决普通脂质体存在的凝聚、渗漏等问题.国内外学者对前体脂质体的制备和质量评价都进行了深入研究，除本课题组前期制备的a-细辛脑前体脂质体之外，目前鲜见其他关于a-细辛脑前体脂质体的报道.本文在课题组前期制备的基础上，采取Box-Behnken Design-响应面优化法（BBD-RSM），优化了a-细辛脑前体脂质体的制备工艺，考察了前体脂质体的稳定性及体外释放度，为把a-细辛脑前体脂质体开发成新药打下良好的基础。
1材料与仪器
1.1药品与试剂
a-细辛脑（广西亿康药业，批号080626，含量98.6%）；胆固醇（AR，国药集团试剂公司）；卵磷脂（AR，德国利宝益）；甘露醇（AR，国药集团试剂公司）；甲醇（色谱纯，国药集团试剂公司）；维生素E（AR，国药集团试剂公司）；其他试剂均为分析纯.
1.2仪器
Agilent-1260型高效液相色谱仪（Agilent）；Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18液相色谱柱（150 mmx4.6mm，5 μm）（Agilent）；Millipore超纯水仪Direct-Q3 UV（默克化工技术有限公司）；EYELA N-1300v-WB旋转蒸发仪（岛津公司）；Microcon YM-50离心超滤管（50KDa，0.5 mL，美国Milipore）；智能溶出度测试仪RC-3（天津市新天光分析仪器技术有限公司）等。
2方法与结果
2.1a-细辛脑前体脂质体的制备工艺
在本课题组前期实验的基础上，甘露醇载体沉积法制备a-细辛脑前体脂质体.称取处方量的a-细辛脑、胆固醇、卵磷脂溶于无水乙醇中，称取少量维生素E溶解于上述无水乙醇中（维生素E与卵磷脂重比为1：50），超声分散获得类脂质澄明溶液.然后称取处方量的甘露醇粉末加入上述类脂质溶液于旋转蒸发仪减压蒸干，干燥即得a-细辛脑前体脂质体。
2.2a-细辛脑含量的测定
色谱条件：色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18（150 mmX4.6 mm，5 um）；流动相：甲醇一水（65：35，V/V）；流速1.0mL/min；检测波长：313 nm；进样量：20μL；柱温30℃。
a-细辛脑在20～100μg/mL范围内与峰面积Y呈良好的线性关系，回归方程Y=41.49x+16.38（r=0.990 3）；相对标准偏差（RSD，relative standarddeviation）为0.44%（n=5）；低、中和高3种剂量平均回收率分别为99.05%、101.20%和101.50%，RSD分别为1.44%、0.69%和0.80%（n=3），符合试验测定要求。
2.3脂质体包封率的测定
称取a-细辛脑前体脂质体固体粉末溶解在生理盐水中得一定浓度的a-细辛脑前体脂质体混悬液，经破乳、过膜、离心后可得细辛脑前体脂质体离心液和混悬液，加甲醇溶解定容.精密量取20μL注入高效液相色谱仪，计算药物总浓度及离心液中游离药物浓度，根据下式计算药物包封率（E）。
2.4 BBD-RSM优化a-细辛脑前体脂质体试验
在本课题组前期实验的基础上，选3个对包封率影响较大的因素为自变量：卵磷脂用量（A）、卵磷脂与胆固醇重比（B）、卵磷脂与a-细辛脑重比（C），采用Dseign-Expert 8.0.6.1软件进行试验设计，以包封率（E）为响应值，共设计了17组试验，因素水平见表1，测定结果见表2。
2.5响应面法优化a-细辛脑的实验结果及模型拟合
采用Dseign-Expert 8.0.6.1对表2的数据进行分析，模型的方差分析表见表3，得二次多项式回归方程Y=92.39+3.21A+1.72B+2.30C+1.14AB-1.64AC-1.69BC-4.06A2-4.65B2-4.75C2（R2=0.976 7，P<0.0001，F=32.56，失拟度检验p=0.093 6>0.05，F=4.38）。
由表3可知试验设计所选择的3个因素（A、B、C）对a-细辛脑包封率均有显著的影响，其中AC、BC对a-细辛脑包封率也有显著的影響.模型F值较高（32.56），P<0.000 1，说明拟合模型高度显著；失拟项F值较小（4.38），P>0.05，失拟项不显著，该模型的信噪比高（16.608），方程的决定系数R2=0.9767>0.95，表明实测值与预测值之间有高度的相关性；其校正决定系数R2为0.9467，表明模型响应值的变化有94.67%来源于所选自变量，说明模型在回归区域拟合良好，符合实验要求，可用该回归模型对实验结果进行统计分析。 2.6参数优化及模型预测
为确定a-细辛脑的最佳制备优化工艺，构建了三维曲面图，图1-图3显示了影响a-细辛脑包封率的自变量及交互影响.
图1示出了在固定的卵磷脂与胆固醇重比（B）条件下，a-细辛脑包封率在卵磷脂用量（A）及卵磷脂与a一细辛脑重比（C）的交互影响.随着A和C的增加，响应值a-细辛脑包封率均先升后降，3D图为一曲面.在卵磷脂用量（A）为1.90 g时a-细辛脑包封率最高，分析可能的原因为：随着卵磷脂量的增加，磷脂所形成的脂质双分子层包裹的药物增加，从而包封率增加，但卵磷脂量继续增加，双分子膜的通透性和不对称性也会增大，可能导致药物渗漏增多从而包封率下降。
图2示出了在固定的卵磷脂用量（A）条件下，a-细辛脑包封率在卵磷脂与胆固醇重比（B）及卵磷脂与a-细辛脑重比（C）的交互影响.随着B和C的增加，响应值a-细辛脑包封率均先升后降，3D图为一曲面.在卵磷脂与胆固醇重比（B）为6.63：1时，a-细辛脑包封率最高，过低的胆固醇浓度会影响脂质体成膜，胆固醇量增加，膜中双分子排列的紧密程度也增加，从而起到稳定双分子膜的作用，但是胆固醇量继续增加可能会使脂质体膜的刚性也增加，总表面积减少，所包裹的药物量减少，从而包封率降低，胆固醇量的增加也会影响脂质体的稳定性。
图3示出了在固定的卵磷脂与a-细辛脑重比（C）条件下，a-细辛脑包封率在卵磷脂用量（A）及卵磷脂与胆固醇重比（B）的交互影响.随着A和B的增加，响应值a-细辛脑包封率均先升后降，3D图为一曲面。由图1-图3可以看出，图1一图2的3D图坡度比图3陡，这说明AC、BC交互作用对a-细辛脑包封率的影响比AB大，这与表3方差分析的结果一致。
软件预测的最佳卵磷脂质量1.90g，卵磷脂与胆固醇重比6.63：1，卵磷脂与a-细辛脑重比为27.08：1.该软件预测的优化包封率为93.36%.根据实际实验情况，在卵磷脂质量1.90g，卵磷脂与胆固醇重比6.6：1，卵磷脂与a-细辛脑重比为27.1：1的条件下进行模型的验证实验，实验结果表明：a-细辛脑平均包封率为94.53%.该结果表明：该优化工艺稳定可靠，实验值与建立的模型预测值基本一致。
2.7脂质体稳定性的考察
将制备的a-细辛脑前体脂质体固体粉末1g置于封口袋中，a-细辛脑前体脂质体固体粉末1g溶解后置于具塞试管中，每组设3个平行，将其分别放在层析柜（4℃）和室温（25℃）保存6个月，分别在1、2、3、4、5、6个月时取样进行渗漏率和包封率的测定.包封率的测定按照式（1）进行，渗漏率的测定按照式（2），稳定性实验结果如表4所示。
式中，E为未放置之前的药物的包封率，E为放置一段时间之后的包封率.
由表1的结果可知，a-细辛脑前体脂质体固体粉末4℃下放置6个月比较稳定，25℃放置6个月之后的渗漏率仍在10%之内.而25℃下a-细辛脑前体脂质体溶液渗漏率到第3个月已经达到20.74%，之后脂质体水溶液开始出现絮状沉淀，随着时间的延长絮状沉淀开始发黑，说明脂质体已经发生霉变和絮凝，而在4℃条件下无论脂质体的粉末还是水溶液都没有出现霉变和絮凝的状态.结果表明：a-细辛脑前体脂质体固体粉末4℃和25℃放置都较稳定。
2.8体外释放度的考察
取3批a-细辛脑前体脂质体的固体粉末溶解在生理盐水中，参照中国药典2015版溶出度的测定法——转篮法，以人工胃液（900 mL）为溶出介质，37℃下恒温振摇，100 r/min转速下每间隔1 h取样（同时补足等量人工胃液）、稀释、过膜注入高效液相色谱仪，进行a-细辛脑含量的测定，计算累计释放率（3批样品平均值）.以时间为横坐标，样品各时间点的累积释放率为纵坐标绘制曲线，如图4所示.由图可知，在0-12h内药物释放速度相对缓慢，12 h累积释药量90.21%.说明自制的a-细辛脑前体脂质体具有一定的缓释作用，能夠为临床提供相对平稳的血药浓度，减少副作用的发生及给药次数.
将a-细辛脑的累积释放度（M/M）或待释放度（1-M/M）与时间（t）分别按零级方程、一级方程和Higuchi方程进行拟合，其零级拟合方程：M/M=0.066 5 t+0.233 1，r2=0.884 1；一级拟合方程：ln（1 M/M）=-0.1988 t-0.074 6，r2=0.950 4；Higuehi拟合方程：M/M=0.272 3 t+0.019 6，r2=0.992 1.结果表明Higuchi方程拟合的相关系数最大，R2>0.99，因此采用Higuchi拟合的方程相关性最好。
3结论
前体脂质体是指将脂质材料吸附于载体上制备成的粉末状制剂，可提高制剂的稳定性，避免了用传统方法制备脂质体所存在的问题本研究采用载体沉积法制备a-细辛脑前体脂质体，以卵磷脂、胆固醇为膜材，甘露醇为载体，以包封率作为评价指标，采用Box-Behnken Design-响应面法对工艺条件进行优化，优化后的最佳工艺条件：卵磷脂质量1.90g，卵磷脂与胆固醇重比6.63：1，卵磷脂与a-细辛脑重比为27.08：1.a-细辛脑前体脂质体固体粉末4℃和25℃放置都较稳定，其体外释放规律符合Higuchi方程.该优化工艺稳定可靠，a-细辛脑前体脂质体固体粉末可在室温条件下贮存，其在体外具有良好的缓释作用。
关键词：a-细辛脑；前体脂质体；响应面优化；稳定性；体外释放
0引言
a-细辛脑（asarone），即（2，4，5-三甲氧基-1-丙烯基苯）是天南星科植物石菖蒲的主要有效成分之一，又名a-细辛醚，可用于止咳、化痰、平喘，对肺炎、慢性气管炎均有较好的疗效，a-细辛脑熔点低、脂溶性强，制成生物利用度高的口服固体制剂有一定困难。
脂质体是临床应用较多的药物靶向传递系统之一，但普通脂质体大多数情况下以混悬液的形式存在，长时间存放不稳定，易发生分层、凝聚、沉降、分解、药物渗漏等情况前体脂质体（prolipo-somes）是将脂质体膜材和药物的混合液在减压搅拌下逐步分布到一种可溶性固体载体表面，从而形成自由流动的粉体状制剂即为前体脂质体，可解决普通脂质体存在的凝聚、渗漏等问题.国内外学者对前体脂质体的制备和质量评价都进行了深入研究，除本课题组前期制备的a-细辛脑前体脂质体之外，目前鲜见其他关于a-细辛脑前体脂质体的报道.本文在课题组前期制备的基础上，采取Box-Behnken Design-响应面优化法（BBD-RSM），优化了a-细辛脑前体脂质体的制备工艺，考察了前体脂质体的稳定性及体外释放度，为把a-细辛脑前体脂质体开发成新药打下良好的基础。
1材料与仪器
1.1药品与试剂
a-细辛脑（广西亿康药业，批号080626，含量98.6%）；胆固醇（AR，国药集团试剂公司）；卵磷脂（AR，德国利宝益）；甘露醇（AR，国药集团试剂公司）；甲醇（色谱纯，国药集团试剂公司）；维生素E（AR，国药集团试剂公司）；其他试剂均为分析纯.
1.2仪器
Agilent-1260型高效液相色谱仪（Agilent）；Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18液相色谱柱（150 mmx4.6mm，5 μm）（Agilent）；Millipore超纯水仪Direct-Q3 UV（默克化工技术有限公司）；EYELA N-1300v-WB旋转蒸发仪（岛津公司）；Microcon YM-50离心超滤管（50KDa，0.5 mL，美国Milipore）；智能溶出度测试仪RC-3（天津市新天光分析仪器技术有限公司）等。
2方法与结果
2.1a-细辛脑前体脂质体的制备工艺
在本课题组前期实验的基础上，甘露醇载体沉积法制备a-细辛脑前体脂质体.称取处方量的a-细辛脑、胆固醇、卵磷脂溶于无水乙醇中，称取少量维生素E溶解于上述无水乙醇中（维生素E与卵磷脂重比为1：50），超声分散获得类脂质澄明溶液.然后称取处方量的甘露醇粉末加入上述类脂质溶液于旋转蒸发仪减压蒸干，干燥即得a-细辛脑前体脂质体。
2.2a-细辛脑含量的测定
色谱条件：色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18（150 mmX4.6 mm，5 um）；流动相：甲醇一水（65：35，V/V）；流速1.0mL/min；检测波长：313 nm；进样量：20μL；柱温30℃。
a-细辛脑在20～100μg/mL范围内与峰面积Y呈良好的线性关系，回归方程Y=41.49x+16.38（r=0.990 3）；相对标准偏差（RSD，relative standarddeviation）为0.44%（n=5）；低、中和高3种剂量平均回收率分别为99.05%、101.20%和101.50%，RSD分别为1.44%、0.69%和0.80%（n=3），符合试验测定要求。
2.3脂质体包封率的测定
称取a-细辛脑前体脂质体固体粉末溶解在生理盐水中得一定浓度的a-细辛脑前体脂质体混悬液，经破乳、过膜、离心后可得细辛脑前体脂质体离心液和混悬液，加甲醇溶解定容.精密量取20μL注入高效液相色谱仪，计算药物总浓度及离心液中游离药物浓度，根据下式计算药物包封率（E）。
2.4 BBD-RSM优化a-细辛脑前体脂质体试验
在本课题组前期实验的基础上，选3个对包封率影响较大的因素为自变量：卵磷脂用量（A）、卵磷脂与胆固醇重比（B）、卵磷脂与a-细辛脑重比（C），采用Dseign-Expert 8.0.6.1软件进行试验设计，以包封率（E）为响应值，共设计了17组试验，因素水平见表1，测定结果见表2。
2.5响应面法优化a-细辛脑的实验结果及模型拟合
采用Dseign-Expert 8.0.6.1对表2的数据进行分析，模型的方差分析表见表3，得二次多项式回归方程Y=92.39+3.21A+1.72B+2.30C+1.14AB-1.64AC-1.69BC-4.06A2-4.65B2-4.75C2（R2=0.976 7，P<0.0001，F=32.56，失拟度检验p=0.093 6>0.05，F=4.38）。
由表3可知试验设计所选择的3个因素（A、B、C）对a-细辛脑包封率均有显著的影响，其中AC、BC对a-细辛脑包封率也有显著的影響.模型F值较高（32.56），P<0.000 1，说明拟合模型高度显著；失拟项F值较小（4.38），P>0.05，失拟项不显著，该模型的信噪比高（16.608），方程的决定系数R2=0.9767>0.95，表明实测值与预测值之间有高度的相关性；其校正决定系数R2为0.9467，表明模型响应值的变化有94.67%来源于所选自变量，说明模型在回归区域拟合良好，符合实验要求，可用该回归模型对实验结果进行统计分析。 2.6参数优化及模型预测
为确定a-细辛脑的最佳制备优化工艺，构建了三维曲面图，图1-图3显示了影响a-细辛脑包封率的自变量及交互影响.
图1示出了在固定的卵磷脂与胆固醇重比（B）条件下，a-细辛脑包封率在卵磷脂用量（A）及卵磷脂与a一细辛脑重比（C）的交互影响.随着A和C的增加，响应值a-细辛脑包封率均先升后降，3D图为一曲面.在卵磷脂用量（A）为1.90 g时a-细辛脑包封率最高，分析可能的原因为：随着卵磷脂量的增加，磷脂所形成的脂质双分子层包裹的药物增加，从而包封率增加，但卵磷脂量继续增加，双分子膜的通透性和不对称性也会增大，可能导致药物渗漏增多从而包封率下降。
图2示出了在固定的卵磷脂用量（A）条件下，a-细辛脑包封率在卵磷脂与胆固醇重比（B）及卵磷脂与a-细辛脑重比（C）的交互影响.随着B和C的增加，响应值a-细辛脑包封率均先升后降，3D图为一曲面.在卵磷脂与胆固醇重比（B）为6.63：1时，a-细辛脑包封率最高，过低的胆固醇浓度会影响脂质体成膜，胆固醇量增加，膜中双分子排列的紧密程度也增加，从而起到稳定双分子膜的作用，但是胆固醇量继续增加可能会使脂质体膜的刚性也增加，总表面积减少，所包裹的药物量减少，从而包封率降低，胆固醇量的增加也会影响脂质体的稳定性。
图3示出了在固定的卵磷脂与a-细辛脑重比（C）条件下，a-细辛脑包封率在卵磷脂用量（A）及卵磷脂与胆固醇重比（B）的交互影响.随着A和B的增加，响应值a-细辛脑包封率均先升后降，3D图为一曲面。由图1-图3可以看出，图1一图2的3D图坡度比图3陡，这说明AC、BC交互作用对a-细辛脑包封率的影响比AB大，这与表3方差分析的结果一致。
软件预测的最佳卵磷脂质量1.90g，卵磷脂与胆固醇重比6.63：1，卵磷脂与a-细辛脑重比为27.08：1.该软件预测的优化包封率为93.36%.根据实际实验情况，在卵磷脂质量1.90g，卵磷脂与胆固醇重比6.6：1，卵磷脂与a-细辛脑重比为27.1：1的条件下进行模型的验证实验，实验结果表明：a-细辛脑平均包封率为94.53%.该结果表明：该优化工艺稳定可靠，实验值与建立的模型预测值基本一致。
2.7脂质体稳定性的考察
将制备的a-细辛脑前体脂质体固体粉末1g置于封口袋中，a-细辛脑前体脂质体固体粉末1g溶解后置于具塞试管中，每组设3个平行，将其分别放在层析柜（4℃）和室温（25℃）保存6个月，分别在1、2、3、4、5、6个月时取样进行渗漏率和包封率的测定.包封率的测定按照式（1）进行，渗漏率的测定按照式（2），稳定性实验结果如表4所示。
式中，E为未放置之前的药物的包封率，E为放置一段时间之后的包封率.
由表1的结果可知，a-细辛脑前体脂质体固体粉末4℃下放置6个月比较稳定，25℃放置6个月之后的渗漏率仍在10%之内.而25℃下a-细辛脑前体脂质体溶液渗漏率到第3个月已经达到20.74%，之后脂质体水溶液开始出现絮状沉淀，随着时间的延长絮状沉淀开始发黑，说明脂质体已经发生霉变和絮凝，而在4℃条件下无论脂质体的粉末还是水溶液都没有出现霉变和絮凝的状态.结果表明：a-细辛脑前体脂质体固体粉末4℃和25℃放置都较稳定。
2.8体外释放度的考察
取3批a-细辛脑前体脂质体的固体粉末溶解在生理盐水中，参照中国药典2015版溶出度的测定法——转篮法，以人工胃液（900 mL）为溶出介质，37℃下恒温振摇，100 r/min转速下每间隔1 h取样（同时补足等量人工胃液）、稀释、过膜注入高效液相色谱仪，进行a-细辛脑含量的测定，计算累计释放率（3批样品平均值）.以时间为横坐标，样品各时间点的累积释放率为纵坐标绘制曲线，如图4所示.由图可知，在0-12h内药物释放速度相对缓慢，12 h累积释药量90.21%.说明自制的a-细辛脑前体脂质体具有一定的缓释作用，能夠为临床提供相对平稳的血药浓度，减少副作用的发生及给药次数.
将a-细辛脑的累积释放度（M/M）或待释放度（1-M/M）与时间（t）分别按零级方程、一级方程和Higuchi方程进行拟合，其零级拟合方程：M/M=0.066 5 t+0.233 1，r2=0.884 1；一级拟合方程：ln（1 M/M）=-0.1988 t-0.074 6，r2=0.950 4；Higuehi拟合方程：M/M=0.272 3 t+0.019 6，r2=0.992 1.结果表明Higuchi方程拟合的相关系数最大，R2>0.99，因此采用Higuchi拟合的方程相关性最好。
3结论
前体脂质体是指将脂质材料吸附于载体上制备成的粉末状制剂，可提高制剂的稳定性，避免了用传统方法制备脂质体所存在的问题本研究采用载体沉积法制备a-细辛脑前体脂质体，以卵磷脂、胆固醇为膜材，甘露醇为载体，以包封率作为评价指标，采用Box-Behnken Design-响应面法对工艺条件进行优化，优化后的最佳工艺条件：卵磷脂质量1.90g，卵磷脂与胆固醇重比6.63：1，卵磷脂与a-细辛脑重比为27.08：1.a-细辛脑前体脂质体固体粉末4℃和25℃放置都较稳定，其体外释放规律符合Higuchi方程.该优化工艺稳定可靠，a-细辛脑前体脂质体固体粉末可在室温条件下贮存，其在体外具有良好的缓释作用。