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摘要 [目的]采用生物信息学方法分析双歧杆菌BB12菌株的Sec途径分泌系统及预测底物蛋白。[方法]以双歧杆菌BB12菌株基因组注释的蛋白氨基酸序列为研究对象，在NCBI中以Fasta形式下载，采用一系列生物信息学软件分析该基因组中Sec分泌途径及底物蛋白行使的功能，同时采用COG功能数据库对这些蛋白进行功能注释和聚类分析。[结果]通过分析发现双歧杆菌BB12菌株Sec分泌途径相关的蛋白基因共有9个，其中5个是Sec分泌途径构建蛋白基因，2个信号肽酶识别基因，1个脂蛋白信号肽识别基因和1个信号肽识别蛋白编码基因。Sec底物蛋白分析发现该菌共含1 583个蛋白，经过Sec分泌途径到细胞外的蛋白有57个，35个具有COG功能，占61%，其中被Spase I型信号肽酶识别的有37个，被Spase Ⅱ 型信号肽酶识别的有20个。[结论]COG功能注释显示一些蛋白没有功能，有功能的蛋白主要与氨基酸运输和代谢、碳水化合物的运输和代谢、功能细胞壁/膜和无机离子运输和代谢功能有关。
关键词 双歧杆菌BB12;基因组;分泌蛋白;功能分析
中图分类号 TS201文献标识码 A
文章编号 0517-6611（2019）19-0175-03
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.19.051
Abstract [Objective]To study the Sec pathway secretion system of Bifidobacterium BB12 by bioinformatics and predict substrate protein.[Method]The protein amino acid sequence of the Bifidobacterium BB12 strain genome was used as the research object.A series of bioinformatics software was used to analyze the Sec secretion pathway and substrate protein function in this genome，and functional annotation and cluster analysis of these proteins were performed using COG function database.[Result]It was found that there were 9 protein genes related to the Sec secretion pathway of Bifidobacterium BB12 strain，which included 5 Sec secretion pathway constructs protein gene，2 signal peptidase gene，1 Lipoprotein signal peptide recognition gene and 1 signal peptide recognition protein gene.Results of substrate proteins of Sec pathway showed there were 1 583 proteins，57 proteins that passed through the Sec secretion pathway to the extracellular space，35 of which had COG function，accounting for 61%，of which 37 were identified by Spase type Ⅰ signal peptidase and 20 by Spase type Ⅱ signal peptidase.[Conclusion]The COG function annotation shows that some proteins have no function.The functional proteins are mainly related to amino acid transport and metabolism，carbohydrate transport and metabolism，functional cell wall/membrane and inorganic ion transport and metabolism functions.
Key words Bifidobacterium BB12;Genome;Secreted protein;Functional analysis
雙歧杆菌（Bifidobacterium）代表益生菌的一大类，是一种能代谢产生多种生物活性物质并具有一系列特殊保健功能的人体肠道内优势益生菌。双歧杆菌常以益生菌的形式添加到多种食品及保健品中以发挥其益生功能，通过饮食到达人体肠道后，由于其表面有相关的黏附定殖蛋白，可以提高菌体在肠道内的时间，使菌体发挥功能的时间增长，从而起到改善肠道菌群变化、解决便秘等作用，宿主的疾病和健康都与它息息相关[1]。双歧杆菌外表面分泌蛋白在菌体本身与宿主细胞黏附定殖和对宿主产生的影响方面起着非常重要的作用[2-3]。分泌系统是细菌发挥致病作用的一个关键途径，细菌通过不同的分泌系统向细胞外分泌不同的蛋白来维持细胞结构和生理功能，分泌蛋白是在细胞内经过一系列化学反应合成后，在相关酶的作用下跨过细胞膜分泌到细胞外发挥相应功能的蛋白质。细菌Sec分泌途径是蛋白分泌到细胞外最常见的分泌方式，是由多种蛋白组成的转运酶复合体，主要转运折叠之前的蛋白，具有边转运边折叠的特点，转运到胞外的蛋白一部分附着在细胞壁上，一部分到组织细胞中发挥功能。Sec分泌途径含有的构建蛋白有SecY、SecE、SecG、SecD、SecF、YajC、YidC、SecA、SecB、SecM、Ffh、Ffs、FtsY等[4]，分别被Spase I型和Spase Ⅱ 型信号肽识别，双精氨酸分泌途径主要转运已经折叠的蛋白，该课题研究的菌株没有该转运途径。 双歧杆菌BB12于2007年通过我国卫生部安全性评估，并于2011年被国家卫生和计划生育委员会列入《可用于婴幼儿配方食品的菌种名单》中[5]，同时已证实具有诱发肠道免疫、润肠通便和调节肠道微生态平衡等一系列保健功能，现已广泛添加在我国乳制品和饮料中，但是对于该菌分泌系统和底物蛋白的分析尚无系统性的报道。2008年该菌株完成了全基因组测序和功能注释，共1 659个基因，蛋白数目为1 583个，基因长度为1.942 2 Mb，CG含量为60.5%。该研究从NCBI中以Fasta形式下载双歧杆菌BB12菌株基因组注释的蛋白氨基酸序列，查找该菌株基因组中编码Sec途径的分泌装置蛋白，然后用Signal P 4.0、TMHMM 2.0、LipoP软件分析该基因组中Sec分泌途径和跨膜螺旋数，同时采用COG功能数据库对预测的底物蛋白进行功能注释和聚类分析，了解蛋白基因在分泌过程中行使的功能。
该菌株基因组序列的获得使利用基因组学和蛋白质组学数据进行功能性分析得以实现，如菌体分泌蛋白、外表面蛋白的分析。由于双歧杆菌是当前应用最广泛的商业菌株之一，所以对双歧杆菌的研究日益增多。如1969年Malyoth等[6]将双歧杆菌应用于发酵乳制品，探究双歧杆菌代谢产物在发酵乳液中发挥的作用，也开拓了其在饮食行业中的地位[7]。
潘伟好[8]通过研究双歧杆菌的表面疏水性及对人肠道上皮一细胞的黏附性，结果显示同一菌株在疏水性及黏附性上存在着一定的对应关系，说明测定菌株的表面疏水性可作为筛选黏附性双歧杆菌的初筛标准之一，而不同菌株对肠道上皮细胞黏附特点不同。邢咏梅等[9]通过研究热灭活状态和活菌状态双歧杆菌对结肠癌细胞系HT-29的黏附性进行了对比分析，发现活菌与灭活菌对肠上皮细胞均具有较强的黏附性，增大了双歧杆菌的使用范围。葛常辉等[10]研究了双歧杆菌DM9227菌株对培养的大肠癌细胞系CCL-187细胞的黏附作用以及影响黏附的因素，初步建立了体外双歧杆菌的黏附模型。目前，关于双歧杆菌BB12外表面蛋白的全基因测序和功能性分析国内外鲜有报道。该研究以双歧杆菌BB12菌株全基因组编码蛋白序列为研究对象，采用生物信息学的手段大规模预测分析菌体分泌蛋白，具有一定的创新性和理论性，为益生菌与宿主相互作用的分子研究提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料 美国国立生物技术信息中心（NCBI） GenBank公布的动物双歧杆菌BB12菌株基因组编码蛋白质的氨基酸序列，GenBank的登录号是NC_017214.1。
1.2 方法
1.2.1 动物双歧杆菌BB12菌株Sec分泌途径分析。打开NCBI的基因 组数据库，选中“Genome”在查询中输入“Bifidobacterium BB12”得到菌株蛋白和基因的相关信息，点击“Search”，并采用Fasta格式下载基因编码蛋白的氨基酸序列，在氨基酸序列中筛选Sec分泌途径及构建蛋白，并进行归类统计分析。
1.2.2 动物双歧杆菌BB12菌株底物预测及功能分析。底物构建蛋白包括Ⅰ型和Ⅱ 型Sec分泌蛋白，分别由Spase Ⅰ肽酶识别和Spase Ⅱ 肽酶识别。Signal P 4.0软件（ http：//www.Cbs.dtu.dk / services / Signal P）分析I型Sec分泌途径的信号肽识别蛋白，包括蛋白名称、基因名称、蛋白长度以及功能。Lipo P分析Ⅱ型Sec分泌途径的信号肽识别蛋白，选择革兰氏阳性菌，同时采用TMHMM 2.0 （http：//genome.Cbs.dtu.dk / services / TMHMM /） 统计I型信号肽蛋的跨膜螺旋结构数，并使用COG（http：//eggnog embl.de/）功能数据库统计蛋白数目和在菌体与宿主细胞接触时行使的功能并进行聚类分析。
2 结果与分析
2.1 动物双歧杆菌BB12菌体Sec分泌装置分析
对双歧杆菌BB12菌株Sec分泌装置途径进行预测分析，跟Sec分泌途径相关的蛋白基因共有9个，其中5个是Sec分泌途径构建蛋白基因，2个信号肽酶识别基因（Signal peptidase Ⅰ和Signal peptidase Ⅱ）和1个脂蛋白信号肽识别蛋白基因（Lipoprotein signal peptidase），1个信号肽识别蛋白编码基因（signal recognition particledocking protein），结果见表1。
2.2 双歧杆菌BB12菌株Sec分泌途径底物蛋白分析
通过Sec分泌途径的蛋白为57个，占总蛋白的3.6%，其中被Spase Ⅰ型信号肽酶识别的蛋白有37个，被Spase Ⅱ型信号肽酶识别的蛋白有20个，57个Sec分泌途径底物蛋白功能结果显示有22个蛋白未知和没有COG功能注釋，含有COG功能注释的蛋白有35个，经TMHMM2.0软件统计螺旋数最多为14个，最少为1个。COG数据功能显示参与Sec分泌途径的蛋白主要与氨基酸运输和代谢、碳水化合物的运输和代谢、功能细胞壁/膜和无机离子运输和代谢功能有关。具体Sec途径底物蛋白分析见图1。
3 讨论与结论
双歧杆菌是一类广泛添加在酸奶等乳制品中的益生菌，应用前景十分广阔，可阻止病原菌的定殖，诱发肠道免疫，控制内毒素，制造营养物质，刺激组织发育，具有免疫调节、抗肿瘤、抗衰老、抗炎症、润肠通便和调节肠道微生态平衡等一系列保健功能，而这些功能发生的基础需要依靠菌体和宿主细胞之间的黏附定殖作用，所以研究菌体外表面蛋白黏附机制具有一定的意义。对该菌外表面蛋白和分泌蛋白的研究可以更好地了解该菌适应外界环境的分子机制，也可为研究与宿主之间的相互作用奠定基础。主要研究了双歧杆菌的分泌转运途径并预测分析了底物蛋白功能，Sec分泌途径是细菌最常见的分泌方式，主要与参与分泌的构建蛋白种类有关，分泌蛋白是指在细胞内合成后通过一定方式运输到细胞外行使相应功能的一类蛋白，与微生物生活环境和功能特性有一定的关系，该研究对菌株中编码Sec途径分泌蛋白的种类进行了完善，为蛋白质的跨膜转运分泌提供了物质基础。 细胞壁/膜的生物合成和无机离子的转运和代谢途径。分析结果表明，分泌蛋白发挥的功能与微生物的生物特性、吸收营养物质、适应环境能力和稳定性方面有着重要的关系，该研究为益生菌在食品特別是乳制品方面的应用提供了数据资源。
参考文献
[1]孙建华，刘晓放，于丽萍.双歧杆菌BB12发酵乳的润肠通便功效研究[J].黑龙江医药，2013，26（2）：214-217.
[2] LIU C，ZHANG Z Y，DONG K，et al.Adhesion and immunomodulatory effects of Bifidobacterium lactis HN019 on intestinal epithelial cells INT-407[J].World journal of gastroenterology，2010，16（18）：2283-2290.
[3] GILAD O，SVENSSON B，VIBORG A H，et al.The extracellular proteome of Bifidobacterium animalis subsp.lactis BB-12 reveals proteins with putative roles in probiotic effects[J].Proteomics，2011，11（12）：2503-2514.
[4] 朱德全，王纯岩，温馨，等.亚硝化单胞菌is79a3 Sec途径分泌系统及底物蛋白分析[J].安徽农业科学，2017，45（29）：153-154，206.
[5] 卫生部公布可用于婴幼儿食品的菌种名单的公告（卫生部公告2011年第25号）[J].食品与发酵工业，2011，37（10）：208.
[6] MALYOTH G，BAUER A.Versuch diner Differenzierung beim Bacterium bifidum[J].Klinische wochenschrift，1950，28（25/26）：451-452.
[7] 贾英民.食品微生物学[M].北京：中国轻工业出版社，2006：23-25.
[8] 潘伟好.具有粘附性双歧杆菌的筛选及相关特性研究[D].北京：中国农业大学，2005.
[9] 邢咏梅，纪令士.双歧杆菌活菌与灭活菌对肠上皮细胞粘附作用的比较分析[J].青岛医药卫生，2007，39（5）：327-328.
[10] 葛常辉，杨佩满，蒋寒青，等.双歧杆菌对人大肠癌细胞粘附作用的初步探讨[J].中国微生态学杂志，1997，9（3）：13-15.
关键词 双歧杆菌BB12;基因组;分泌蛋白;功能分析
中图分类号 TS201文献标识码 A
文章编号 0517-6611（2019）19-0175-03
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.19.051
Abstract [Objective]To study the Sec pathway secretion system of Bifidobacterium BB12 by bioinformatics and predict substrate protein.[Method]The protein amino acid sequence of the Bifidobacterium BB12 strain genome was used as the research object.A series of bioinformatics software was used to analyze the Sec secretion pathway and substrate protein function in this genome，and functional annotation and cluster analysis of these proteins were performed using COG function database.[Result]It was found that there were 9 protein genes related to the Sec secretion pathway of Bifidobacterium BB12 strain，which included 5 Sec secretion pathway constructs protein gene，2 signal peptidase gene，1 Lipoprotein signal peptide recognition gene and 1 signal peptide recognition protein gene.Results of substrate proteins of Sec pathway showed there were 1 583 proteins，57 proteins that passed through the Sec secretion pathway to the extracellular space，35 of which had COG function，accounting for 61%，of which 37 were identified by Spase type Ⅰ signal peptidase and 20 by Spase type Ⅱ signal peptidase.[Conclusion]The COG function annotation shows that some proteins have no function.The functional proteins are mainly related to amino acid transport and metabolism，carbohydrate transport and metabolism，functional cell wall/membrane and inorganic ion transport and metabolism functions.
Key words Bifidobacterium BB12;Genome;Secreted protein;Functional analysis
雙歧杆菌（Bifidobacterium）代表益生菌的一大类，是一种能代谢产生多种生物活性物质并具有一系列特殊保健功能的人体肠道内优势益生菌。双歧杆菌常以益生菌的形式添加到多种食品及保健品中以发挥其益生功能，通过饮食到达人体肠道后，由于其表面有相关的黏附定殖蛋白，可以提高菌体在肠道内的时间，使菌体发挥功能的时间增长，从而起到改善肠道菌群变化、解决便秘等作用，宿主的疾病和健康都与它息息相关[1]。双歧杆菌外表面分泌蛋白在菌体本身与宿主细胞黏附定殖和对宿主产生的影响方面起着非常重要的作用[2-3]。分泌系统是细菌发挥致病作用的一个关键途径，细菌通过不同的分泌系统向细胞外分泌不同的蛋白来维持细胞结构和生理功能，分泌蛋白是在细胞内经过一系列化学反应合成后，在相关酶的作用下跨过细胞膜分泌到细胞外发挥相应功能的蛋白质。细菌Sec分泌途径是蛋白分泌到细胞外最常见的分泌方式，是由多种蛋白组成的转运酶复合体，主要转运折叠之前的蛋白，具有边转运边折叠的特点，转运到胞外的蛋白一部分附着在细胞壁上，一部分到组织细胞中发挥功能。Sec分泌途径含有的构建蛋白有SecY、SecE、SecG、SecD、SecF、YajC、YidC、SecA、SecB、SecM、Ffh、Ffs、FtsY等[4]，分别被Spase I型和Spase Ⅱ 型信号肽识别，双精氨酸分泌途径主要转运已经折叠的蛋白，该课题研究的菌株没有该转运途径。 双歧杆菌BB12于2007年通过我国卫生部安全性评估，并于2011年被国家卫生和计划生育委员会列入《可用于婴幼儿配方食品的菌种名单》中[5]，同时已证实具有诱发肠道免疫、润肠通便和调节肠道微生态平衡等一系列保健功能，现已广泛添加在我国乳制品和饮料中，但是对于该菌分泌系统和底物蛋白的分析尚无系统性的报道。2008年该菌株完成了全基因组测序和功能注释，共1 659个基因，蛋白数目为1 583个，基因长度为1.942 2 Mb，CG含量为60.5%。该研究从NCBI中以Fasta形式下载双歧杆菌BB12菌株基因组注释的蛋白氨基酸序列，查找该菌株基因组中编码Sec途径的分泌装置蛋白，然后用Signal P 4.0、TMHMM 2.0、LipoP软件分析该基因组中Sec分泌途径和跨膜螺旋数，同时采用COG功能数据库对预测的底物蛋白进行功能注释和聚类分析，了解蛋白基因在分泌过程中行使的功能。
该菌株基因组序列的获得使利用基因组学和蛋白质组学数据进行功能性分析得以实现，如菌体分泌蛋白、外表面蛋白的分析。由于双歧杆菌是当前应用最广泛的商业菌株之一，所以对双歧杆菌的研究日益增多。如1969年Malyoth等[6]将双歧杆菌应用于发酵乳制品，探究双歧杆菌代谢产物在发酵乳液中发挥的作用，也开拓了其在饮食行业中的地位[7]。
潘伟好[8]通过研究双歧杆菌的表面疏水性及对人肠道上皮一细胞的黏附性，结果显示同一菌株在疏水性及黏附性上存在着一定的对应关系，说明测定菌株的表面疏水性可作为筛选黏附性双歧杆菌的初筛标准之一，而不同菌株对肠道上皮细胞黏附特点不同。邢咏梅等[9]通过研究热灭活状态和活菌状态双歧杆菌对结肠癌细胞系HT-29的黏附性进行了对比分析，发现活菌与灭活菌对肠上皮细胞均具有较强的黏附性，增大了双歧杆菌的使用范围。葛常辉等[10]研究了双歧杆菌DM9227菌株对培养的大肠癌细胞系CCL-187细胞的黏附作用以及影响黏附的因素，初步建立了体外双歧杆菌的黏附模型。目前，关于双歧杆菌BB12外表面蛋白的全基因测序和功能性分析国内外鲜有报道。该研究以双歧杆菌BB12菌株全基因组编码蛋白序列为研究对象，采用生物信息学的手段大规模预测分析菌体分泌蛋白，具有一定的创新性和理论性，为益生菌与宿主相互作用的分子研究提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料 美国国立生物技术信息中心（NCBI） GenBank公布的动物双歧杆菌BB12菌株基因组编码蛋白质的氨基酸序列，GenBank的登录号是NC_017214.1。
1.2 方法
1.2.1 动物双歧杆菌BB12菌株Sec分泌途径分析。打开NCBI的基因 组数据库，选中“Genome”在查询中输入“Bifidobacterium BB12”得到菌株蛋白和基因的相关信息，点击“Search”，并采用Fasta格式下载基因编码蛋白的氨基酸序列，在氨基酸序列中筛选Sec分泌途径及构建蛋白，并进行归类统计分析。
1.2.2 动物双歧杆菌BB12菌株底物预测及功能分析。底物构建蛋白包括Ⅰ型和Ⅱ 型Sec分泌蛋白，分别由Spase Ⅰ肽酶识别和Spase Ⅱ 肽酶识别。Signal P 4.0软件（ http：//www.Cbs.dtu.dk / services / Signal P）分析I型Sec分泌途径的信号肽识别蛋白，包括蛋白名称、基因名称、蛋白长度以及功能。Lipo P分析Ⅱ型Sec分泌途径的信号肽识别蛋白，选择革兰氏阳性菌，同时采用TMHMM 2.0 （http：//genome.Cbs.dtu.dk / services / TMHMM /） 统计I型信号肽蛋的跨膜螺旋结构数，并使用COG（http：//eggnog embl.de/）功能数据库统计蛋白数目和在菌体与宿主细胞接触时行使的功能并进行聚类分析。
2 结果与分析
2.1 动物双歧杆菌BB12菌体Sec分泌装置分析
对双歧杆菌BB12菌株Sec分泌装置途径进行预测分析，跟Sec分泌途径相关的蛋白基因共有9个，其中5个是Sec分泌途径构建蛋白基因，2个信号肽酶识别基因（Signal peptidase Ⅰ和Signal peptidase Ⅱ）和1个脂蛋白信号肽识别蛋白基因（Lipoprotein signal peptidase），1个信号肽识别蛋白编码基因（signal recognition particledocking protein），结果见表1。
2.2 双歧杆菌BB12菌株Sec分泌途径底物蛋白分析
通过Sec分泌途径的蛋白为57个，占总蛋白的3.6%，其中被Spase Ⅰ型信号肽酶识别的蛋白有37个，被Spase Ⅱ型信号肽酶识别的蛋白有20个，57个Sec分泌途径底物蛋白功能结果显示有22个蛋白未知和没有COG功能注釋，含有COG功能注释的蛋白有35个，经TMHMM2.0软件统计螺旋数最多为14个，最少为1个。COG数据功能显示参与Sec分泌途径的蛋白主要与氨基酸运输和代谢、碳水化合物的运输和代谢、功能细胞壁/膜和无机离子运输和代谢功能有关。具体Sec途径底物蛋白分析见图1。
3 讨论与结论
双歧杆菌是一类广泛添加在酸奶等乳制品中的益生菌，应用前景十分广阔，可阻止病原菌的定殖，诱发肠道免疫，控制内毒素，制造营养物质，刺激组织发育，具有免疫调节、抗肿瘤、抗衰老、抗炎症、润肠通便和调节肠道微生态平衡等一系列保健功能，而这些功能发生的基础需要依靠菌体和宿主细胞之间的黏附定殖作用，所以研究菌体外表面蛋白黏附机制具有一定的意义。对该菌外表面蛋白和分泌蛋白的研究可以更好地了解该菌适应外界环境的分子机制，也可为研究与宿主之间的相互作用奠定基础。主要研究了双歧杆菌的分泌转运途径并预测分析了底物蛋白功能，Sec分泌途径是细菌最常见的分泌方式，主要与参与分泌的构建蛋白种类有关，分泌蛋白是指在细胞内合成后通过一定方式运输到细胞外行使相应功能的一类蛋白，与微生物生活环境和功能特性有一定的关系，该研究对菌株中编码Sec途径分泌蛋白的种类进行了完善，为蛋白质的跨膜转运分泌提供了物质基础。 细胞壁/膜的生物合成和无机离子的转运和代谢途径。分析结果表明，分泌蛋白发挥的功能与微生物的生物特性、吸收营养物质、适应环境能力和稳定性方面有着重要的关系，该研究为益生菌在食品特別是乳制品方面的应用提供了数据资源。
参考文献
[1]孙建华，刘晓放，于丽萍.双歧杆菌BB12发酵乳的润肠通便功效研究[J].黑龙江医药，2013，26（2）：214-217.
[2] LIU C，ZHANG Z Y，DONG K，et al.Adhesion and immunomodulatory effects of Bifidobacterium lactis HN019 on intestinal epithelial cells INT-407[J].World journal of gastroenterology，2010，16（18）：2283-2290.
[3] GILAD O，SVENSSON B，VIBORG A H，et al.The extracellular proteome of Bifidobacterium animalis subsp.lactis BB-12 reveals proteins with putative roles in probiotic effects[J].Proteomics，2011，11（12）：2503-2514.
[4] 朱德全，王纯岩，温馨，等.亚硝化单胞菌is79a3 Sec途径分泌系统及底物蛋白分析[J].安徽农业科学，2017，45（29）：153-154，206.
[5] 卫生部公布可用于婴幼儿食品的菌种名单的公告（卫生部公告2011年第25号）[J].食品与发酵工业，2011，37（10）：208.
[6] MALYOTH G，BAUER A.Versuch diner Differenzierung beim Bacterium bifidum[J].Klinische wochenschrift，1950，28（25/26）：451-452.
[7] 贾英民.食品微生物学[M].北京：中国轻工业出版社，2006：23-25.
[8] 潘伟好.具有粘附性双歧杆菌的筛选及相关特性研究[D].北京：中国农业大学，2005.
[9] 邢咏梅，纪令士.双歧杆菌活菌与灭活菌对肠上皮细胞粘附作用的比较分析[J].青岛医药卫生，2007，39（5）：327-328.
[10] 葛常辉，杨佩满，蒋寒青，等.双歧杆菌对人大肠癌细胞粘附作用的初步探讨[J].中国微生态学杂志，1997，9（3）：13-15.