【摘 要】
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目的 建立一种疟原虫雌性配子体的分子检测法.方法 根据疟原虫雌性配子体特异性mRNA靶标(待测靶序列)即动合子表面蛋白(s25)的转录产物,设计特异性的捕获探针和连接探针.血液样品经裂解释放的mRNAs,无需核酸提取,通过“三明治”杂交被捕获到96孔板表面.洗去未结合探针后,将结合在mRNA靶标上的连接探针进行连接,得到两端为特殊设计序列的单链扩增模板.再用通用引物进行染料法qPCR扩增,或在端部设计TaqMan探针序列,用通用引物和通用TaqMan探针进行探针法qPCR扩增.评价这一基于捕获和连接扩增的
【机 构】
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中国医学科学院基础医学研究所 北京协和医学院基础学院 生物化学与分子生物学系,北京100005
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目的 建立一种疟原虫雌性配子体的分子检测法.方法 根据疟原虫雌性配子体特异性mRNA靶标(待测靶序列)即动合子表面蛋白(s25)的转录产物,设计特异性的捕获探针和连接探针.血液样品经裂解释放的mRNAs,无需核酸提取,通过“三明治”杂交被捕获到96孔板表面.洗去未结合探针后,将结合在mRNA靶标上的连接探针进行连接,得到两端为特殊设计序列的单链扩增模板.再用通用引物进行染料法qPCR扩增,或在端部设计TaqMan探针序列,用通用引物和通用TaqMan探针进行探针法qPCR扩增.评价这一基于捕获和连接扩增的方法(CLIP-PCR)的灵敏度、特异性和重复性并与普通的RT-qPCR方法进行比较,将其应用于临床样品的检测.结果 该CLIP-PCR具有较高的灵敏度和特异性.与普通的RT-qPCR一样,均可检测低至11拷贝数的s25 mRNA靶标;而且该CLIP-PCR操作更简便.该CLIP-PCR可准确检测到疟疾患者血液中的雌性配子体.可将96个样品的检测时间缩短至3 h.结论 建立了灵敏高效的染料法和通用TaqMan探针法CLIP-PCR检测疟原虫雌性配子体,为疟疾传播的控制、配子体大规模筛查奠定了基础.
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