论文部分内容阅读
摘 要：检测VB12发酵液中各部分的单位情况，发现菌体释放出的VB12其本身存在于水相中，与细胞色素并无结合；发酵单位的高低与色素的多少无关；并且上清液单位越高，说明菌体释放到发酵液中的VB12越多，菌体老化的也越严重，发酵越接近终点。
关键词：VB12；发酵液；预处理；滤泥；单位
VB12又称钴胺素，是对人和动物具有生物活性的类咕啉同功维生素的总称，主要品种有氰钴胺、羟钴胺、腺苷钴胺、甲钴胺。VB12能够防治人的巨幼红细胞性贫血，人和动物的神经病变，幼儿和幼小动物的生长发育障碍，以及刺激某些微生物的生长。
我公司用脱氮假单孢菌（Pseudomonas denitrificant）进行发酵，利用脱氮假单孢菌在发酵培养基中进行搅拌、通气、纯种好氧培养，控制好罐温、罐压、通气量及搅拌转速进行培养，中后期补入碳源及部分微量元素，从而使脱氮假单孢菌大量繁殖，并在其次级代谢过程中产生维生素B12得到初始产品。但一直以来对维生素B12合成过程、在发酵液中存在方式、发酵副产物等的研究很少，通过此次试验考察维生素B12发酵液中各部分的单位情况以及其是在水相中存在，还是与细胞相结合；发酵液的颜色与发酵液单位之间是否存在必然的联系等。
1、试验部分
1.1主要原材料及仪器
亚硝酸钠、消沫剂、冰乙酸、氰化钠
高压液相仪一台、离心器一台、水浴锅一套、容量瓶若干、电子天平一台
1.2试验过程
1.2.1取当天待放的发酵液250ml，首先用接种环沾取适量发酵液在干净的载玻片上涂片，用革兰氏染色法进行染色，染色完毕将其放在油镜下进行观察：菌体大部分已老化、变异，达到我们制定的放罐标准；此外镜检下未发现任何杂菌，杜绝了杂菌对试验准确性的影响。
1.2.2吸取四份50ml/份的料液至离心管中，编号为1、2、3、4；吸取25ml料液至一100ml容量瓶中并加入50ml左右的纯化水将其编号为5；把1、2、3、4号放入离心器中离心30分钟后，收集1－4号上清液共约150ml，观其外观清亮颜色呈黑红色。将1－4号称重用减量法计算出滤泥的湿重（清干净的容量瓶，需烘干后，再称取重量），结果如下如下表：
编号1234合计
总重（g）28.428.628.528.4－容量瓶重（g）19.820.219.820.0－滤泥湿重（g）8.68.48.78.434.1
1.2.3将1－4号的滤泥合并到一个200ml的容量瓶中，用纯化水溶解稀释滤泥，搅拌均匀，充分溶解，再用纯化水定容至200ml待用。
把收集的上清液分为两份编号为：1＃、2＃：把定容好的滤泥编为3＃。
从1＃、2＃、3＃吸取25ml样品分至三个100ml的容量瓶中，（对应编号为：1＃、2＃、3＃）分别加入2.5ml冰乙酸、2.5ml亚硝酸钠、3滴消沫剂、50ml纯化水将1＃、3＃、5放入水浴锅中加热，沸腾后计时30分钟，2＃直接用纯化水定容至刻度，1＃、3＃、5迅速冷却至室温后（用冷水辅助降温，减少高温对单位的破坏，提高检测的准确性），加纯化水定容至刻度，用10＃定性滤纸将各个样品逐一粗滤至对应的试管中，在粗滤过程中观察1＃、2＃、3＃样品发现：
1＃滤速最快，滤液颜色最深；
2＃滤速最慢，颜色居中；
3＃滤速居中，颜色最浅；
接着将滤液用0.45μm微孔滤膜过滤，每个样品收集滤液5ml至对应编号的比色管中（若滤液混浊或略显混浊，均需重新用0.45μm微孔滤膜过滤，必要时可采用双层滤膜进行过滤），把比色管放入通风厨内，打开通风厨，在滤液中分别加入3滴10％氰化钠（氰化钠为剧毒化学品，必须在通风厨内进行操作、并且操作时一定要带好胶片手套，操作过程中动作要稳、准、快），盖上盖从通风厨内移出，充分摇匀放入水浴锅中40℃水浴加热转化1小时。冷却至室温后，待测。
1.2.4设置高压液相仪的测定条件：
波长：361nm流速：0.7ml/min
柱温：40℃流动相介质：甲醇和超纯水
柱压：低限值10kg/cm2高限值：150kg/cm2
条件设置完毕，开始走基线，待基线走直后稳定半分钟左右，方可进样；按编号逐个用高压液相仪进行分析，并打印图谱。
维生素B12的出峰时间一般在在6.5－7.5分钟之间，且在此时间段内几乎不会有其它杂峰出现，如果图谱中出现异常情况需重新走一遍基线，观察以上四个图谱其基本符合这一规律，即此次图谱数据有效；从相应图谱中读取各个样品的峰面积：样品号VB12出峰时间样品峰面积1＃6.564538.722722＃6.574495.406773＃6.578742.2082556.5851188.81909
1.3试验结果
根据：样品单位＝样品峰面积/标准峰面积×标准单位×稀释倍数；将图谱中读出的各个样品的峰面积带入公式，计算出各样品的单位（标准峰面积为739.679）：
1＃ 5387.2272/739.679*241.55*4＝70.4（ug/ml）
2＃ 495.40677/739.679*24.155*4＝64.7（ug/ml）
3＃ 742.20825/739.679*24.155*4＝90.7（ug/ml）
1188.81909/739.679*24.155*4＝155.3（ug/ml）
1＃+3＃=70.4+90.7=161.1
2＃+3＃=64.7+90.7=155.4
（1＃+2＃）/2+3＃=（70.4+64.7）/2+90.7=158.251＃样品为发酵液经离心并水解的上清液，2＃样品为发酵液经离心未水解的上清液，3＃样品为发酵液经离心并水解的滤泥，5号样品为按生产样品标准步骤处理的发酵液；理论上1＃+3＃的单位之和应与5号样品的单位基本一致，1＃和2＃单位是否存在差异，是证明菌体释放出的VB12其本身存在于水相中还是与细胞色素结合的关键，从上面的计算结果看：1＃+3＃的单位之和与5号样品的单位基本一致与理论是相符的，1＃和2＃样品的单位相差不大，菌体释放出的VB12是存在于水相中，还是与细胞色素相结合已基本得到证实。
1.4结果分析
从上面计算的结果进行分析：1＃、2＃的单位相差不多，说明水解与不水解对单位影响不大，即菌体释放出的VB12其本身存在于水相中，与细胞色素并无结合；3＃单位最高，而颜色最浅，说明发酵液单位的高低与细胞色素的多少并没有直接关系，即在发酵过程中并不象传统理解的那样：发酵液越红，发酵单位越高，在生产中片面追求发酵颜色是没有任何意义的，这对以后的VB12发酵具有一定的指导意义；上清液（1＃、2＃）的单位与3＃单位之和与发酵液5的单位接近，由于菌体在发酵过程中，达到一定阶段后开始产生VB12，并在一定时期将VB12释放到发酵液中，故菌体释放的VB12越多上清液单位越高，菌体老化越严重，发酵越接近终点。
关键词：VB12；发酵液；预处理；滤泥；单位
VB12又称钴胺素，是对人和动物具有生物活性的类咕啉同功维生素的总称，主要品种有氰钴胺、羟钴胺、腺苷钴胺、甲钴胺。VB12能够防治人的巨幼红细胞性贫血，人和动物的神经病变，幼儿和幼小动物的生长发育障碍，以及刺激某些微生物的生长。
我公司用脱氮假单孢菌（Pseudomonas denitrificant）进行发酵，利用脱氮假单孢菌在发酵培养基中进行搅拌、通气、纯种好氧培养，控制好罐温、罐压、通气量及搅拌转速进行培养，中后期补入碳源及部分微量元素，从而使脱氮假单孢菌大量繁殖，并在其次级代谢过程中产生维生素B12得到初始产品。但一直以来对维生素B12合成过程、在发酵液中存在方式、发酵副产物等的研究很少，通过此次试验考察维生素B12发酵液中各部分的单位情况以及其是在水相中存在，还是与细胞相结合；发酵液的颜色与发酵液单位之间是否存在必然的联系等。
1、试验部分
1.1主要原材料及仪器
亚硝酸钠、消沫剂、冰乙酸、氰化钠
高压液相仪一台、离心器一台、水浴锅一套、容量瓶若干、电子天平一台
1.2试验过程
1.2.1取当天待放的发酵液250ml，首先用接种环沾取适量发酵液在干净的载玻片上涂片，用革兰氏染色法进行染色，染色完毕将其放在油镜下进行观察：菌体大部分已老化、变异，达到我们制定的放罐标准；此外镜检下未发现任何杂菌，杜绝了杂菌对试验准确性的影响。
1.2.2吸取四份50ml/份的料液至离心管中，编号为1、2、3、4；吸取25ml料液至一100ml容量瓶中并加入50ml左右的纯化水将其编号为5；把1、2、3、4号放入离心器中离心30分钟后，收集1－4号上清液共约150ml，观其外观清亮颜色呈黑红色。将1－4号称重用减量法计算出滤泥的湿重（清干净的容量瓶，需烘干后，再称取重量），结果如下如下表：
编号1234合计
总重（g）28.428.628.528.4－容量瓶重（g）19.820.219.820.0－滤泥湿重（g）8.68.48.78.434.1
1.2.3将1－4号的滤泥合并到一个200ml的容量瓶中，用纯化水溶解稀释滤泥，搅拌均匀，充分溶解，再用纯化水定容至200ml待用。
把收集的上清液分为两份编号为：1＃、2＃：把定容好的滤泥编为3＃。
从1＃、2＃、3＃吸取25ml样品分至三个100ml的容量瓶中，（对应编号为：1＃、2＃、3＃）分别加入2.5ml冰乙酸、2.5ml亚硝酸钠、3滴消沫剂、50ml纯化水将1＃、3＃、5放入水浴锅中加热，沸腾后计时30分钟，2＃直接用纯化水定容至刻度，1＃、3＃、5迅速冷却至室温后（用冷水辅助降温，减少高温对单位的破坏，提高检测的准确性），加纯化水定容至刻度，用10＃定性滤纸将各个样品逐一粗滤至对应的试管中，在粗滤过程中观察1＃、2＃、3＃样品发现：
1＃滤速最快，滤液颜色最深；
2＃滤速最慢，颜色居中；
3＃滤速居中，颜色最浅；
接着将滤液用0.45μm微孔滤膜过滤，每个样品收集滤液5ml至对应编号的比色管中（若滤液混浊或略显混浊，均需重新用0.45μm微孔滤膜过滤，必要时可采用双层滤膜进行过滤），把比色管放入通风厨内，打开通风厨，在滤液中分别加入3滴10％氰化钠（氰化钠为剧毒化学品，必须在通风厨内进行操作、并且操作时一定要带好胶片手套，操作过程中动作要稳、准、快），盖上盖从通风厨内移出，充分摇匀放入水浴锅中40℃水浴加热转化1小时。冷却至室温后，待测。
1.2.4设置高压液相仪的测定条件：
波长：361nm流速：0.7ml/min
柱温：40℃流动相介质：甲醇和超纯水
柱压：低限值10kg/cm2高限值：150kg/cm2
条件设置完毕，开始走基线，待基线走直后稳定半分钟左右，方可进样；按编号逐个用高压液相仪进行分析，并打印图谱。
维生素B12的出峰时间一般在在6.5－7.5分钟之间，且在此时间段内几乎不会有其它杂峰出现，如果图谱中出现异常情况需重新走一遍基线，观察以上四个图谱其基本符合这一规律，即此次图谱数据有效；从相应图谱中读取各个样品的峰面积：样品号VB12出峰时间样品峰面积1＃6.564538.722722＃6.574495.406773＃6.578742.2082556.5851188.81909
1.3试验结果
根据：样品单位＝样品峰面积/标准峰面积×标准单位×稀释倍数；将图谱中读出的各个样品的峰面积带入公式，计算出各样品的单位（标准峰面积为739.679）：
1＃ 5387.2272/739.679*241.55*4＝70.4（ug/ml）
2＃ 495.40677/739.679*24.155*4＝64.7（ug/ml）
3＃ 742.20825/739.679*24.155*4＝90.7（ug/ml）
1188.81909/739.679*24.155*4＝155.3（ug/ml）
1＃+3＃=70.4+90.7=161.1
2＃+3＃=64.7+90.7=155.4
（1＃+2＃）/2+3＃=（70.4+64.7）/2+90.7=158.251＃样品为发酵液经离心并水解的上清液，2＃样品为发酵液经离心未水解的上清液，3＃样品为发酵液经离心并水解的滤泥，5号样品为按生产样品标准步骤处理的发酵液；理论上1＃+3＃的单位之和应与5号样品的单位基本一致，1＃和2＃单位是否存在差异，是证明菌体释放出的VB12其本身存在于水相中还是与细胞色素结合的关键，从上面的计算结果看：1＃+3＃的单位之和与5号样品的单位基本一致与理论是相符的，1＃和2＃样品的单位相差不大，菌体释放出的VB12是存在于水相中，还是与细胞色素相结合已基本得到证实。
1.4结果分析
从上面计算的结果进行分析：1＃、2＃的单位相差不多，说明水解与不水解对单位影响不大，即菌体释放出的VB12其本身存在于水相中，与细胞色素并无结合；3＃单位最高，而颜色最浅，说明发酵液单位的高低与细胞色素的多少并没有直接关系，即在发酵过程中并不象传统理解的那样：发酵液越红，发酵单位越高，在生产中片面追求发酵颜色是没有任何意义的，这对以后的VB12发酵具有一定的指导意义；上清液（1＃、2＃）的单位与3＃单位之和与发酵液5的单位接近，由于菌体在发酵过程中，达到一定阶段后开始产生VB12，并在一定时期将VB12释放到发酵液中，故菌体释放的VB12越多上清液单位越高，菌体老化越严重，发酵越接近终点。