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摘 要：从采自安徽省肥西县发病的水稻材料中提取水稻黑条矮缩病毒dsRNA，利用RT-PCR获得了病毒基因组片段S10的cDNA克隆，并测定其全序列。结果表明：S10全长1801bp，含有一个ORF；核苷酸与氨基酸序列同源性比较表明，其与浙江的RBSDV（AY050488）最接近，分别为99.2%和99.6%；与日本的RBSDV（D00606）分别为95.1%和97.5%。
关键词：水稻黑条矮缩病毒；cDNA克隆；S10片段；序列分析
中图分类号 S435.11 文献标识码 B 文章编号 1007-7731（2013）09-31-02
水稻黑条矮缩病毒（rice black-streaked dwarf Fijivirus，RBSDV）是呼肠孤病毒科（Reovirdae）斐济病毒属（Fijivirus）的成员[1]，该病毒基因组是由10条双链RNA组成，按照其在凝胶上的迁移率由慢到快依次命名为S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9和S10[2]。在自然界中，水稻黑条矮缩病毒只能通过携带病毒的灰飞虱（Laodelphax striatellus）以持久性的方式传播[3]。该病毒主要侵染水稻引起水稻黑条矮缩病，同时也可侵染小麦、玉米，引起玉米粗缩病和小麦绿矮病等病害[2]，是一种十分重要的作物病毒。20世纪90年代后期，RBSDV在浙江省暴发流行，并迅速在长江流域中东部稻作区蔓延，成为水稻生产上的毁灭性病害，造成了巨大的经济损失[4]。本文报道了采自安徽省肥西县的RBSDV水稻分离物基因组片段S10的cDNA克隆及其全序列分析的研究结果。
1 材料与方法
1.1 材料 2010年7月从安徽省肥西县采集具有典型RBSDV侵染症状的水稻样本，于-80℃保存备用。
1.2 引物设计 根据已报道的RBSDV S10基因组序列设计两对引物P1（扩增1-616位点的片段）和P2（扩增167-1801位点的片段），由上海生工生物工程有限公司合成。序列如下：P1 F1：5’AAGTTTTTTTCCTCACCCATA3’，R1：5’CCATTTGAGCAGGAACTTCAC3’；P2 F2：5’TCAAAGCGCCCCACGTTGC3’；R2：5’GACAATAGCTGAATTTCCCCCTA3’。
1.3 总RNA提取及RT-PCR扩增 取0.1g冻存水稻病叶，于液氮中充分研磨成粉，然后用Trizol试剂（上海生工生物工程有限公司公司产品）提取病叶总RNA，方法按公司提供的产品说明书进行。取8μL RNA模板与1μL R2（下游引物）混匀后，于95℃处理5min后迅速冰浴。然后按以下反应体系（25μL）进行逆转录：5μL 5ⅹ反转录缓冲液，2.5μL Dntp，1μL Rnase抑制剂和AMV反转录酶3μL，加0.1%DEPC处理的双蒸水至25μL，42℃反应1h，随后95℃加热5min，立即冰浴，合成cDNA第一链。PCR扩增在50μL反应体系中进行，反应包括2μL反转录产物，5μL 10ⅹPCR buffer，3μL MgCL2（25mmol/L），1μLdNTP Mixture（10nmol/L），上下游引物各1μL，0.5μL Taq DNA聚合酶（5U/μL），ddH2O36.5μL。充分混匀后，进行PCR反应，反应条件如下：94℃变性3min后，94℃30s，58℃45s，72℃1min，共30个循环。最后72℃延伸10min。
1.4 PCR产物克隆及序列测定 PCR产物纯化后，经电泳检测为目的片段后，直接连接于pMD18-T载体（TaKaRa）上，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，蓝白斑筛选重组子，PCR扩增和双酶切鉴定阳性重组子。阳性克隆委托上海生工生物工程有限公司进行测序、拼接，获得S10 cDNA全序0。
2 结果与分析
2.1 安徽RBSDV S10两段序列的扩增 利用P1和P2这两对引物，通过RT-PCR的方法从水稻黑条矮缩病感病叶片总RNA中扩增得到600bp和1600bp左右的特异产物（如图1），片段大小与引物设计大小相符。经回收后克隆到pMD18-T载体，并转化大肠杆菌。阳性克隆用于DNA序列测定，并进行拼接。
2.2 安徽RBSDV S10 cDNA全序列分析 通过片段拼接获得安徽省水稻黑条矮缩病的病毒分离物基因组第10组分（S10）cDNA克隆。序列分析结果显示：S10全长1801bp，含有一个ORF开放阅读框，编码一个分子量约为63.1kD的蛋白质。序列分析表明所测的病毒分离物S10在总长度、G/C含量、非编码区长度和开放阅读框（ORF）等基因组织形式与报道的RBSDV相符合。核苷酸与氨基酸序列同源性比较发现其与浙江的RBSDV水稻分离物S10基因（AY050488）最接近，分别为99.2%和99.6%；与日本的RBSDV（D00606）分别为95.1%和97.5%；与意大利的MRDV（L76560）相对较远一些，分别为86.8%和91.6%。S10序列分析结果证明斐济病毒属RBSDV为引起我省水稻黑条矮缩病的病原之一。
3 讨论
自2008年以来，水稻黑条矮缩病在安徽省多个地区发生危害，我们先后对我省太湖县、居巢区、肥西县、全椒县等地水稻病毒病发生状况进行了调查，并采集了发病水稻病株。本研究系从我省肥西县水稻上克隆了RBSDV S10片段序列。序列分析发现，其与多个来自于浙江的RBSDV 的S10序列相似性高达95.2%～99.2%，推测安徽省肥西县的RBSDV病毒与浙江分离的病毒亲缘关系较近。有关安徽省水稻黑条矮缩病发生流行的研究报道较多，但有关分子方面的研究只有李祥宇等[5]对安徽省内RBSDV的S9部分片段序列进行过研究。通过对安徽省RBSDV各个组分的克隆及序列分析，可以进一步认识RBSDV基因组功能结构，有助于深入研究水稻黑条矮缩病毒在安徽省不同作物上的侵染危害、演化、分布、流行规律，为防治RBSDV提供理论依据。
参考文献
[1 ] Boccardo G，Milne R G. Plant reovirus group [J]. CMI/ AAB Discriptions of Plant Viruses，1984：294.
[2] 张恒木，雷娟利，陈剑平，等.浙江和河北发生的一种水稻、小麦、玉米矮缩病是水稻黑条矮缩病毒引起的[J].中国病毒学，2001，16（3）：246-251.
[3] Shikata E，Kitagawa Y. Rice black-streaked dwarf virus： Its properties，morphology and intracellular localization. Virology，1977，77（2）：826-842.
[4] Wang H D，Chen J P，Wang A G，et al Studies on the epidemiology and yield losses from rice black streaked dwarf disease in a recent epidemic in Zhejiang province，China[J]. Plant Pathology，2009，58（5）：815-825.
[5]李祥宇，闫德龙，郑兆阳，等.安徽省水稻黑条矮缩病毒和南方水稻黑条矮缩病毒的分子检测和序列分析[J].安徽农业大学学报，2013，40（1）：146-151. （责编：陶学军）
关键词：水稻黑条矮缩病毒；cDNA克隆；S10片段；序列分析
中图分类号 S435.11 文献标识码 B 文章编号 1007-7731（2013）09-31-02
水稻黑条矮缩病毒（rice black-streaked dwarf Fijivirus，RBSDV）是呼肠孤病毒科（Reovirdae）斐济病毒属（Fijivirus）的成员[1]，该病毒基因组是由10条双链RNA组成，按照其在凝胶上的迁移率由慢到快依次命名为S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9和S10[2]。在自然界中，水稻黑条矮缩病毒只能通过携带病毒的灰飞虱（Laodelphax striatellus）以持久性的方式传播[3]。该病毒主要侵染水稻引起水稻黑条矮缩病，同时也可侵染小麦、玉米，引起玉米粗缩病和小麦绿矮病等病害[2]，是一种十分重要的作物病毒。20世纪90年代后期，RBSDV在浙江省暴发流行，并迅速在长江流域中东部稻作区蔓延，成为水稻生产上的毁灭性病害，造成了巨大的经济损失[4]。本文报道了采自安徽省肥西县的RBSDV水稻分离物基因组片段S10的cDNA克隆及其全序列分析的研究结果。
1 材料与方法
1.1 材料 2010年7月从安徽省肥西县采集具有典型RBSDV侵染症状的水稻样本，于-80℃保存备用。
1.2 引物设计 根据已报道的RBSDV S10基因组序列设计两对引物P1（扩增1-616位点的片段）和P2（扩增167-1801位点的片段），由上海生工生物工程有限公司合成。序列如下：P1 F1：5’AAGTTTTTTTCCTCACCCATA3’，R1：5’CCATTTGAGCAGGAACTTCAC3’；P2 F2：5’TCAAAGCGCCCCACGTTGC3’；R2：5’GACAATAGCTGAATTTCCCCCTA3’。
1.3 总RNA提取及RT-PCR扩增 取0.1g冻存水稻病叶，于液氮中充分研磨成粉，然后用Trizol试剂（上海生工生物工程有限公司公司产品）提取病叶总RNA，方法按公司提供的产品说明书进行。取8μL RNA模板与1μL R2（下游引物）混匀后，于95℃处理5min后迅速冰浴。然后按以下反应体系（25μL）进行逆转录：5μL 5ⅹ反转录缓冲液，2.5μL Dntp，1μL Rnase抑制剂和AMV反转录酶3μL，加0.1%DEPC处理的双蒸水至25μL，42℃反应1h，随后95℃加热5min，立即冰浴，合成cDNA第一链。PCR扩增在50μL反应体系中进行，反应包括2μL反转录产物，5μL 10ⅹPCR buffer，3μL MgCL2（25mmol/L），1μLdNTP Mixture（10nmol/L），上下游引物各1μL，0.5μL Taq DNA聚合酶（5U/μL），ddH2O36.5μL。充分混匀后，进行PCR反应，反应条件如下：94℃变性3min后，94℃30s，58℃45s，72℃1min，共30个循环。最后72℃延伸10min。
1.4 PCR产物克隆及序列测定 PCR产物纯化后，经电泳检测为目的片段后，直接连接于pMD18-T载体（TaKaRa）上，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，蓝白斑筛选重组子，PCR扩增和双酶切鉴定阳性重组子。阳性克隆委托上海生工生物工程有限公司进行测序、拼接，获得S10 cDNA全序0。
2 结果与分析
2.1 安徽RBSDV S10两段序列的扩增 利用P1和P2这两对引物，通过RT-PCR的方法从水稻黑条矮缩病感病叶片总RNA中扩增得到600bp和1600bp左右的特异产物（如图1），片段大小与引物设计大小相符。经回收后克隆到pMD18-T载体，并转化大肠杆菌。阳性克隆用于DNA序列测定，并进行拼接。
2.2 安徽RBSDV S10 cDNA全序列分析 通过片段拼接获得安徽省水稻黑条矮缩病的病毒分离物基因组第10组分（S10）cDNA克隆。序列分析结果显示：S10全长1801bp，含有一个ORF开放阅读框，编码一个分子量约为63.1kD的蛋白质。序列分析表明所测的病毒分离物S10在总长度、G/C含量、非编码区长度和开放阅读框（ORF）等基因组织形式与报道的RBSDV相符合。核苷酸与氨基酸序列同源性比较发现其与浙江的RBSDV水稻分离物S10基因（AY050488）最接近，分别为99.2%和99.6%；与日本的RBSDV（D00606）分别为95.1%和97.5%；与意大利的MRDV（L76560）相对较远一些，分别为86.8%和91.6%。S10序列分析结果证明斐济病毒属RBSDV为引起我省水稻黑条矮缩病的病原之一。
3 讨论
自2008年以来，水稻黑条矮缩病在安徽省多个地区发生危害，我们先后对我省太湖县、居巢区、肥西县、全椒县等地水稻病毒病发生状况进行了调查，并采集了发病水稻病株。本研究系从我省肥西县水稻上克隆了RBSDV S10片段序列。序列分析发现，其与多个来自于浙江的RBSDV 的S10序列相似性高达95.2%～99.2%，推测安徽省肥西县的RBSDV病毒与浙江分离的病毒亲缘关系较近。有关安徽省水稻黑条矮缩病发生流行的研究报道较多，但有关分子方面的研究只有李祥宇等[5]对安徽省内RBSDV的S9部分片段序列进行过研究。通过对安徽省RBSDV各个组分的克隆及序列分析，可以进一步认识RBSDV基因组功能结构，有助于深入研究水稻黑条矮缩病毒在安徽省不同作物上的侵染危害、演化、分布、流行规律，为防治RBSDV提供理论依据。
参考文献
[1 ] Boccardo G，Milne R G. Plant reovirus group [J]. CMI/ AAB Discriptions of Plant Viruses，1984：294.
[2] 张恒木，雷娟利，陈剑平，等.浙江和河北发生的一种水稻、小麦、玉米矮缩病是水稻黑条矮缩病毒引起的[J].中国病毒学，2001，16（3）：246-251.
[3] Shikata E，Kitagawa Y. Rice black-streaked dwarf virus： Its properties，morphology and intracellular localization. Virology，1977，77（2）：826-842.
[4] Wang H D，Chen J P，Wang A G，et al Studies on the epidemiology and yield losses from rice black streaked dwarf disease in a recent epidemic in Zhejiang province，China[J]. Plant Pathology，2009，58（5）：815-825.
[5]李祥宇，闫德龙，郑兆阳，等.安徽省水稻黑条矮缩病毒和南方水稻黑条矮缩病毒的分子检测和序列分析[J].安徽农业大学学报，2013，40（1）：146-151. （责编：陶学军）