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摘要：以铁皮石斛种子为基础材料，建立铁皮石斛快速成苗的组培技术体系。通过调整组织培养过程中的激素种类及浓度配比，找出不同生长阶段最适的培养基配方。结果表明，诱导种子萌发、原球茎的最适培养基配方为1/2MS 0.1 mg/L NAA，9～10 d时种子开始萌发，30 d后种子萌发率达94.4%。原球茎增殖与分化的最适培养基配方为 MS 1.5 mg/L 6-BA 0.2 mg/L NAA，15 d后原球茎增殖率为8.0%，55 d后分化率达73.6%。生根壮苗阶段的最适培养基为MS 0.5 mg/L NAA 0.5 mg/L IBA，生根率达92.0%。研究结果为铁皮石斛快繁技术奠定了理论基础。
关键词：铁皮石斛;种子;组织培养;快繁优化
珍稀植物铁皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）为兰科石斛属，具有养阴生津、润肺明目、抗击肿瘤、提高人体免疫力等功效[1-3]，是我国名贵中药材之一，位于“中华九大仙草”之首[4]，素有“药中黄金”之美誉。野生铁皮石斛一般生长在岩石、树皮上，开花多，但结果少，种子细小如尘埃，没有胚乳组织，必须与真菌共生才能萌发，因此自然条件下萌发难度大，萌发率不到5%[5]。但因野生石斛具有极高的药用价值，需求大，人们对其采摘过度，导致野生资源越来越稀少。因此，利用植物组织培养技术对铁皮石斛进行人工繁殖、生产，既能发挥其药用价值，又能使这一濒危植物得到保护和发展。本研究以铁皮石斛种子为材料，探讨不同激素种类、不同激素浓度配比对种子萌发、原球茎诱导、原球茎增殖及分化、生根壮苗的影响，并筛出各阶段的最适培养基。
1 材料与方法
1.1 材料
供试材料为铁皮石斛蒴果，由重庆市中药研究院提供。
1.2 方法
基础培养基为MS或1/2MS，pH值为5.6～58。培养温度为（25±2） ℃，光照时间为12 h，光照度为1 000～1 500 lx。利用DPS数据分析软件进行显著性分析。
1.2.1 种子萌发及原球茎的诱导 将采摘的铁皮石斛蒴果用自来水冲洗0.5 h，洗净蒴果表面的泥尘。于超净工作台上，用75%乙醇浸泡蒴果30 s，再用无菌水冲洗2～3次，然后用0.1%氯化汞浸泡6 min，无菌水漂洗5次，于无菌滤纸上吸干水分。用灭菌解剖刀在蒴果上切开1个小口，接种于以MS或1/2MS为基础培养基添加0.1 mg/L或0.3 mg/L NAA的培养基上。各培养基中均加入3%蔗糖、0.5%瓊脂，每个处理各15瓶，重复3次。
1.2.2 原球茎增殖与分化 选取个大、深绿色的原球茎进行增殖及分化培养。将原球茎接种于以MS或1/2MS为基础培养基添加0.2 mg/L NAA 1.0 mg/L 6-BA或0.2 mg/L NAA 1.5 mg/L 6-BA 的培养基上，各培养基中均加入20%马铃薯汁、2%蔗糖、0.5%琼脂、0.4%活性炭，每个处理各12瓶，每瓶接种10个原球茎，重复3次。
1.2.3 生根壮苗 选取生长旺盛、株高为4 cm左右、长势较一致的幼苗进行生根壮苗试验。以MS为基础培养基，分别添加0.5 mg/L NAA、1.0 mg/L NAA、0.5 mg/L NAA 0.5 mg/L IBA、1.0 mg/L NAA 1.0 mg/L IBA，各培养基中均加 3%蔗糖、05%琼脂、0.3%活性炭、10%香蕉汁、0.4%活性炭，每个处理各12瓶，每瓶接种10株幼苗，重复3次。
2 结果与分析
2.1 不同培养基对铁皮石斛种子萌发及原球茎诱导的影响
培养10 d左右，铁皮石斛种子开始萌发，种胚逐渐长大，呈黄绿色。培养25 d左右，种胚进一步膨大，呈绿色，有部分原球茎已进一步分化成叶原基，呈圆锥状，有些已生长成子叶。
由表1可知，4种培养基都能促进铁皮石斛种子萌发，形成圆锥状芽。比较4种培养基的培养效果可知，以MS为基础的培养基中种子的萌发时间比1/2MS培养基长，且原球茎呈黄绿色，其大小比1/2MS培养基小，到后期的白化现象比较严重。当NAA质量浓度为0.3 mg/L时，原球茎个体较大，颜色较深且饱满。综合30 d后的诱导情况发现，1/2MS 培养基处理的萌发率更高，达91%以上，其中1/2MS 0.1 mg/L NAA培养基的萌发率高达944%，与MS培养基相比较，差异极显著，1/2MS 0.3 mg/L NAA培养基的萌发率为91.3%，均比 MS 0.1 mg/L NAA培养基的萌发率（90.1%）和MS 0.3 mg/L NAA培养基的萌发率（90.3%）高。
2.2 不同培养基对铁皮石斛原球茎增殖与分化的影响
选取个大、深绿色、饱满的原球茎进行增殖与分化培养，统计接种30 d后的增殖情况与接种55 d时的分化状况。由表2可以看出，4种培养基中的原球茎基部都有新芽和一些块状黄绿色原球茎产生，但1/2 MS 0.2 mg/L NAA 1.0 mg/L 6-BA、1/2 MS 0.2 mg/L NAA 1.5 mg/L 6-BA培养基上的原球茎颜色呈黄绿色，且新生芽、原球茎较少，增殖率分别为5.8%、5.0%;MS 0.2 mg/L NAA 1.0 mg/L 6-BA、MS 0.2 mg/L NAA 1.5 mg/L 6-BA 培养基上的原球茎颜色较深，为绿色、深绿色，新生的原球茎较多，增殖率极显著增加，分别达74%、8.0%。由此可见，MS培养基比1/2MS更适合原球茎增殖。55 d后各培养基中原球茎的分化情况显示，4种培养基均能使原球茎分化成幼苗，1/2MS 02 mg/L NAA 1.0 mg/L 6-BA培养基中原球茎的分化率为61.0%，分化出的幼苗有细根，但长势较弱;1/2MS 0.2 mg/L NAA 1.5 mg/L 6-BA培养基中原球茎的分化率为65.6%，幼苗有细根，长势较1/2MS 0.2 mg/L NAA 1.0 mg/L 6-BA 培养基稍强;MS 0.2 mg/L NAA 1.0 mg/L 6-BA培养基中原球茎的分化率为61.2%，大部分原球茎能分化成苗，苗色翠绿，生长旺盛;MS 0.2 mg/L NAA 1.5 mg/L 6-BA培养基中原球茎的分化率达73.6%，绝大部分原球茎能分化成苗，苗色浓绿，生长旺盛。由此可看出，1.5 mg/L 6-BA 与 0.2 mg/L NAA培养基的浓度配比更适合原球茎分化。原球茎增殖需要充足的营养成分，MS 1.5 mg/L 6-BA 0.2 mg/L NAA培养基更有益于原球茎的增殖与分化。 2.3 不同培养基对铁皮石斛生根壮苗的影响
选取生长旺盛、株高4 cm左右、长势较一致的幼苗进行生根壮苗试验。以MS为基础培养基，在各培养基中均加3%蔗糖、0.5%琼脂、0.3%活性炭、10%香蕉汁。每个处理各设12瓶，每瓶接种10株幼苗，重复3次。培养30 d时，各处理在生根率、每株根数、根长、株高及茎粗上逐渐表现出差异。50 d 后各处理间的差异变大，在生根率方面，MS 05 mg/L NAA培养基的优势显著，生根率高达946%;其次是MS 0.5 mg/L NAA 0.5 mg/L IBA培养基，生根率为92.0%;再次为MS 1.0 mg/L NAA 1.0 mg/L IBA培养基，生根率为91.6%;而MS 1.0 mg/L NAA培养基的生根率最低，仅为910%。MS 0.5 mg/L NAA培养基处理在每株根数方面也有一定优势，平均每株根数为3.1条;其次是MS 0.5 mg/L NAA 0.5 mg/L IBA培养基，平均每株根数为2.7条;MS 1.0 mg/L NAA、MS 10 mg/L NAA 1.0 mg/L IBA培养基的平均每株根数分别为2.6、2.3条。在根长方面，4种处理间的差异不大，在3.2～3.5 cm之间。在株高方面，MS 0.5 mg/L NAA培养基也表现出明显优势，株高达 6.0 cm，但在茎粗方面，MS 0.5 mg/L NAA 0.5 mg/L
关键词：铁皮石斛;种子;组织培养;快繁优化
珍稀植物铁皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）为兰科石斛属，具有养阴生津、润肺明目、抗击肿瘤、提高人体免疫力等功效[1-3]，是我国名贵中药材之一，位于“中华九大仙草”之首[4]，素有“药中黄金”之美誉。野生铁皮石斛一般生长在岩石、树皮上，开花多，但结果少，种子细小如尘埃，没有胚乳组织，必须与真菌共生才能萌发，因此自然条件下萌发难度大，萌发率不到5%[5]。但因野生石斛具有极高的药用价值，需求大，人们对其采摘过度，导致野生资源越来越稀少。因此，利用植物组织培养技术对铁皮石斛进行人工繁殖、生产，既能发挥其药用价值，又能使这一濒危植物得到保护和发展。本研究以铁皮石斛种子为材料，探讨不同激素种类、不同激素浓度配比对种子萌发、原球茎诱导、原球茎增殖及分化、生根壮苗的影响，并筛出各阶段的最适培养基。
1 材料与方法
1.1 材料
供试材料为铁皮石斛蒴果，由重庆市中药研究院提供。
1.2 方法
基础培养基为MS或1/2MS，pH值为5.6～58。培养温度为（25±2） ℃，光照时间为12 h，光照度为1 000～1 500 lx。利用DPS数据分析软件进行显著性分析。
1.2.1 种子萌发及原球茎的诱导 将采摘的铁皮石斛蒴果用自来水冲洗0.5 h，洗净蒴果表面的泥尘。于超净工作台上，用75%乙醇浸泡蒴果30 s，再用无菌水冲洗2～3次，然后用0.1%氯化汞浸泡6 min，无菌水漂洗5次，于无菌滤纸上吸干水分。用灭菌解剖刀在蒴果上切开1个小口，接种于以MS或1/2MS为基础培养基添加0.1 mg/L或0.3 mg/L NAA的培养基上。各培养基中均加入3%蔗糖、0.5%瓊脂，每个处理各15瓶，重复3次。
1.2.2 原球茎增殖与分化 选取个大、深绿色的原球茎进行增殖及分化培养。将原球茎接种于以MS或1/2MS为基础培养基添加0.2 mg/L NAA 1.0 mg/L 6-BA或0.2 mg/L NAA 1.5 mg/L 6-BA 的培养基上，各培养基中均加入20%马铃薯汁、2%蔗糖、0.5%琼脂、0.4%活性炭，每个处理各12瓶，每瓶接种10个原球茎，重复3次。
1.2.3 生根壮苗 选取生长旺盛、株高为4 cm左右、长势较一致的幼苗进行生根壮苗试验。以MS为基础培养基，分别添加0.5 mg/L NAA、1.0 mg/L NAA、0.5 mg/L NAA 0.5 mg/L IBA、1.0 mg/L NAA 1.0 mg/L IBA，各培养基中均加 3%蔗糖、05%琼脂、0.3%活性炭、10%香蕉汁、0.4%活性炭，每个处理各12瓶，每瓶接种10株幼苗，重复3次。
2 结果与分析
2.1 不同培养基对铁皮石斛种子萌发及原球茎诱导的影响
培养10 d左右，铁皮石斛种子开始萌发，种胚逐渐长大，呈黄绿色。培养25 d左右，种胚进一步膨大，呈绿色，有部分原球茎已进一步分化成叶原基，呈圆锥状，有些已生长成子叶。
由表1可知，4种培养基都能促进铁皮石斛种子萌发，形成圆锥状芽。比较4种培养基的培养效果可知，以MS为基础的培养基中种子的萌发时间比1/2MS培养基长，且原球茎呈黄绿色，其大小比1/2MS培养基小，到后期的白化现象比较严重。当NAA质量浓度为0.3 mg/L时，原球茎个体较大，颜色较深且饱满。综合30 d后的诱导情况发现，1/2MS 培养基处理的萌发率更高，达91%以上，其中1/2MS 0.1 mg/L NAA培养基的萌发率高达944%，与MS培养基相比较，差异极显著，1/2MS 0.3 mg/L NAA培养基的萌发率为91.3%，均比 MS 0.1 mg/L NAA培养基的萌发率（90.1%）和MS 0.3 mg/L NAA培养基的萌发率（90.3%）高。
2.2 不同培养基对铁皮石斛原球茎增殖与分化的影响
选取个大、深绿色、饱满的原球茎进行增殖与分化培养，统计接种30 d后的增殖情况与接种55 d时的分化状况。由表2可以看出，4种培养基中的原球茎基部都有新芽和一些块状黄绿色原球茎产生，但1/2 MS 0.2 mg/L NAA 1.0 mg/L 6-BA、1/2 MS 0.2 mg/L NAA 1.5 mg/L 6-BA培养基上的原球茎颜色呈黄绿色，且新生芽、原球茎较少，增殖率分别为5.8%、5.0%;MS 0.2 mg/L NAA 1.0 mg/L 6-BA、MS 0.2 mg/L NAA 1.5 mg/L 6-BA 培养基上的原球茎颜色较深，为绿色、深绿色，新生的原球茎较多，增殖率极显著增加，分别达74%、8.0%。由此可见，MS培养基比1/2MS更适合原球茎增殖。55 d后各培养基中原球茎的分化情况显示，4种培养基均能使原球茎分化成幼苗，1/2MS 02 mg/L NAA 1.0 mg/L 6-BA培养基中原球茎的分化率为61.0%，分化出的幼苗有细根，但长势较弱;1/2MS 0.2 mg/L NAA 1.5 mg/L 6-BA培养基中原球茎的分化率为65.6%，幼苗有细根，长势较1/2MS 0.2 mg/L NAA 1.0 mg/L 6-BA 培养基稍强;MS 0.2 mg/L NAA 1.0 mg/L 6-BA培养基中原球茎的分化率为61.2%，大部分原球茎能分化成苗，苗色翠绿，生长旺盛;MS 0.2 mg/L NAA 1.5 mg/L 6-BA培养基中原球茎的分化率达73.6%，绝大部分原球茎能分化成苗，苗色浓绿，生长旺盛。由此可看出，1.5 mg/L 6-BA 与 0.2 mg/L NAA培养基的浓度配比更适合原球茎分化。原球茎增殖需要充足的营养成分，MS 1.5 mg/L 6-BA 0.2 mg/L NAA培养基更有益于原球茎的增殖与分化。 2.3 不同培养基对铁皮石斛生根壮苗的影响
选取生长旺盛、株高4 cm左右、长势较一致的幼苗进行生根壮苗试验。以MS为基础培养基，在各培养基中均加3%蔗糖、0.5%琼脂、0.3%活性炭、10%香蕉汁。每个处理各设12瓶，每瓶接种10株幼苗，重复3次。培养30 d时，各处理在生根率、每株根数、根长、株高及茎粗上逐渐表现出差异。50 d 后各处理间的差异变大，在生根率方面，MS 05 mg/L NAA培养基的优势显著，生根率高达946%;其次是MS 0.5 mg/L NAA 0.5 mg/L IBA培养基，生根率为92.0%;再次为MS 1.0 mg/L NAA 1.0 mg/L IBA培养基，生根率为91.6%;而MS 1.0 mg/L NAA培养基的生根率最低，仅为910%。MS 0.5 mg/L NAA培养基处理在每株根数方面也有一定优势，平均每株根数为3.1条;其次是MS 0.5 mg/L NAA 0.5 mg/L IBA培养基，平均每株根数为2.7条;MS 1.0 mg/L NAA、MS 10 mg/L NAA 1.0 mg/L IBA培养基的平均每株根数分别为2.6、2.3条。在根长方面，4种处理间的差异不大，在3.2～3.5 cm之间。在株高方面，MS 0.5 mg/L NAA培养基也表现出明显优势，株高达 6.0 cm，但在茎粗方面，MS 0.5 mg/L NAA 0.5 mg/L