【摘 要】
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目的 表达卵形疟原虫柯氏亚种(Plasmodium ovale curtisi)和沃氏亚种(P.ovale wallikeri)裂殖子表面蛋白1(merozoite surface protein 1,MSP1)N端重组蛋白,并进行抗原性及免疫原性分析,以探究其作为卵形疟候选疫苗的潜力.方法 PCR扩增卵形疟原虫基因组DNA Pomsp1 N端基因.将纯化后的PocmspJ N端、PowmspJ N端分别与pET30a、pET32a载体连接,并转化至DH5α感受态细胞中,经BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切验
【机 构】
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江南大学无锡医学院病原感染与免疫研究室,无锡214000;江阴市第三人民医院,无锡214000;上海市疾病预防控制中心,上海200336;江苏省血吸虫病防治研究所,无锡214000
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目的 表达卵形疟原虫柯氏亚种(Plasmodium ovale curtisi)和沃氏亚种(P.ovale wallikeri)裂殖子表面蛋白1(merozoite surface protein 1,MSP1)N端重组蛋白,并进行抗原性及免疫原性分析,以探究其作为卵形疟候选疫苗的潜力.方法 PCR扩增卵形疟原虫基因组DNA Pomsp1 N端基因.将纯化后的PocmspJ N端、PowmspJ N端分别与pET30a、pET32a载体连接,并转化至DH5α感受态细胞中,经BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切验证且测序无误后,转入大肠埃希菌BL21 (DE3) pLysS中.0.1 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达后纯化蛋白,采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹(Western blotting)检测蛋白表达情况.15只BALB/c小鼠随机分为rPocMSP1 N端组、rPowMSP1 N端组和阴性对照组,每组5只,分别腹腔注射50 μg与弗氏完全佐剂混合的rPocMSP1和rPowMSP1 N端蛋白和等量的PBS,初次免疫后第21天和第42天使用弗氏不完全佐剂加强免疫,初次免疫后第0、7、28和49天采集小鼠尾静脉血,制备血清.ELISA、Western blotting检测小鼠血清中特异性IgG、分析抗体滴度及抗体亲和指数,评估纯化后的rPocMSP1和rPowMSP1 N端蛋白的免疫原性.Western blotting检测rPocMSP1和rPowMSP1 N端蛋白的交叉反应,并用蛋白芯片分析重组蛋白在卵形疟原虫感染者血清中的抗原反应性.采用GraphPad Prism 5.0软件和Microsoft Excel 2016软件进行统计学分析,组间差异比较采用成组t检验.结果 PCR扩增结果显示,Pocmsp1 N端和Powmsp1 N端片段大小均为1068 bp,与预期大小一致.PCR产物经克隆、诱导并纯化后,所获rPocMSP1和rPowMSP1 N端蛋白浓度分别为0.5 mg/ml和1.0 mg/ml.SDS-PAGE结果显示,rPocMSP1和rPowMSP1 N端的相对分子质量(Mr)分别约为46000和59000,Western blotting结果证实蛋白成功表达.免疫组小鼠血清均可特异性识别相应抗原.ELISA结果显示,在免疫后第7天检测到特异性IgG抗体,纯化的rPocMSP1 N端蛋白和rPowMSP1 N端蛋白均与IgG发生特异性反应,与阴性对照组相比差异均有统计学意义(t=5.824、25.98,P＜0.01);初次免疫后第28天,rPocMSP1 N端和rPowMSP1 N端蛋白免疫组小鼠血清A450值分别为1.043±0.390和1.923±1.373;IgG抗体水平持续上升至免疫后第49天,rPocMSP1 N端和rPowMSP1 N端蛋白免疫组小鼠血清A450值分别为1.217±0.365和2.463±0.983.rPoMSP1 N端在小鼠体内中诱导了较高的抗体应答,抗体滴度为1:640000至1:1280000.ELISA结果表明,用rPoMSP1 N端蛋白免疫的小鼠均诱导出高亲和力的IgG抗体,rPocMSP1 N端和rPowMSP1 N端免疫小鼠血清抗体亲和指数分别为97.11％和75.72％.Western blotting结果显示,rPocMSP1 N端免疫组小鼠血清中IgG抗体可以识别rPowMSP1 N端蛋白,rPowMSP1 N端免疫组小鼠血清中IgG抗体可以识别rPocMSP1 N端蛋白,两者存在交叉反应.蛋白芯片分析结果显示,rPocMSP1 N端蛋白识别卵形疟原虫感染者血清的敏感性为83.33％、特异性为57.14％,rPowMSP1 N端识别感染者血清的敏感性为97.62％、特异性为54.76％.rPocMSP1 N端、rPowMSP1 N端均与卵形疟原虫感染者血清有反应,与健康人血清相比,差异具有统计学意义(t=5.896、10.42,P＜ 0.01).结论 rPoMSP 1 N端蛋白具有良好的免疫原性,可诱导小鼠产生体液免疫应答,与卵形疟原虫感染者血清抗体反应上具有良好的抗原性.
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