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【摘要】 目的 通过体外实验对比研究单独及联合应用多西苯醌(AA 861)与塞来昔布对结肠癌的抑制作用。方法 体外分组培养的结肠癌HT 29细胞,通过倒置相差显微镜观察AA 861与塞来昔布单独及联合应用48 h后细胞形态变化;通过细胞增殖试验(MTT)检测细胞吸光度,以此检测细胞增殖状态;应用免疫荧光染色方法在共聚焦显微镜下观察细胞内VEGF表达变化。结果 倒置相差显微镜观察到各药物组细胞形态发生明显变化,其中AA 861与塞来昔布联合应用组变化最明显;MTT结果提示两种药物联合应用组细胞增殖率最低;免疫荧光染色实验观察到细胞内VEGF表达减少,两种药物联合应用组VEGF表达量最低。结论 多西苯醌与塞来昔布联合应用比单独应用,更能有效抑制结肠癌,并且可能与抑制VEGF表达有关。
【关键词】多西苯醌; 塞来昔布; 联合抑制; 结肠癌HT 29细胞; VEGF
Research of Docebenone combined Celecoxib Inhibit Human colon carcinoma cell line
LIU Chun ying,LI Jin feng,LIMing qiang,et al.Department of Gastroenterology,Affiliated Zhongshan Hospital of Dalian University,Dalian 11600l,China
【Abstract】 Objective To comparative investigate the influence of AA 861 alone or in combination with Celecoxib on the proliferation of colon carcinoma HT 29 cell line.Methods Group cultured colon cancer HT 29 cells,The morphological changes of HT 29 cells was observed by inverted phase contrast microscope after Docebenone(AA 861)and Celecoxib alone or in combination;By cell proliferation assay(MTT)detect cell absorbance so as to test cell proliferation;The expression change of VEGF was detected by Immunofluorescence staining experiments under Confocal microscope.Results We can observe that cell morphology chaned significantly under the inverted phase contrast microscope,and the group of AA 861and Celecoxib in combination changed most obvious; These results of MTT suggest that the group of two drugs in combination shows the lowest rate of cell proliferation.Immunofluorescence staining experiments revealed that the expression of VEGF was decreased,and the group of two drugs in combination has the lowest expression.Conclusion AA 861 and Celecoxib in combination can produce a superior anti colon cancer effection than AA 861 or Celecoxib alone,and this effect may be related with inhibit the expression of VEGF.
【Key words】Docebenone;Celecoxib;Associative inhibition;Colon carcinomaHT 29 cell line;VEGF
近年来研究发现结肠癌组织中存在环氧化酶 2(COX 2)及5 脂氧合酶(5 LOX)的高表达,而相应的正常组织或癌旁组织中则不表达或表达量很极少。应用选择性COX 2抑制剂或5 LOX抑制剂都能抑制结肠癌细胞增殖,但是对于联合应用COX 2及5 LOX抑制剂对结肠癌的抑制作用报道很少。我们通过体外细胞实验比较单独及联合应用COX 2抑制剂塞来昔布及5 LOX抑制剂AA 861对结肠癌的抑制作用。以期二者小剂量联合应用,在减轻副作用的前提下协同获得最大的抗癌效果。
1 材料和方法
1.1 材料 人结肠癌HT 29细胞(由大连理工大学生物医学工程实验室惠赠);胎牛血清、1640培养基分别购自Hyclone公司、胰蛋白酶购自Gibico公司;塞来昔布与AA 861均购自美国Sigma试剂公司;鼠抗人VEGF抗体购自Santa cruz公司,FITC标记山羊抗小鼠IgG购自北京中衫金桥生物公司。其余试剂均为国产生化试剂。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养及分组 人结肠癌HT 29细胞采用含10%胎牛血清、100IU/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的PRMI1640培养液,置于37℃ 5%的CO2培养箱中传代培养。按实验设计分为对照组、AA 861组(50 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L)、塞来昔布组(50 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L)、AA 861联合塞来昔布组(50 μmol/LAA 861+50 μmol/L塞来昔布组、100 μmol/L AA 861+100 μmol/L塞来昔布)。
1.2.2 倒置相差显微镜观察细胞生长形态变化 取生长对数期细胞,经胰酶消化后,以3×104~5×104/孔接种于六孔板中,待细胞贴壁生长稳定后,弃去孔板中原培养液,分别按上述分组,加入含有药物的培养液作用48 h后,在倒置相差显微镜下观察细胞形态变化。
1.2.3 MTT细胞增殖试验 取生长状态良好的对数生长期细胞,按1×105/ml的密度接种于接种于96孔板中,每孔加入100 μl,每列的第一孔不加细胞,为空白对照调零,于培养箱内培养。细胞同步化后,分为空白对照组、塞来昔布组、AA 861组、塞来昔布组联合AA 861组,具体浓度如前所述,药物作用第1、2、3天分别每孔加入0.5%MTT液20 μl,继续培养4 h后吸出孔内液体,每孔加入DMSO 200 μl,立即置入酶标仪中震荡后于492 nm处波长下测定各孔吸光度(A492),细胞抑制率计算公式为:细胞抑制率=(1 实验组A492/对照组A492)×100%。
【关键词】多西苯醌; 塞来昔布; 联合抑制; 结肠癌HT 29细胞; VEGF
Research of Docebenone combined Celecoxib Inhibit Human colon carcinoma cell line
LIU Chun ying,LI Jin feng,LIMing qiang,et al.Department of Gastroenterology,Affiliated Zhongshan Hospital of Dalian University,Dalian 11600l,China
【Abstract】 Objective To comparative investigate the influence of AA 861 alone or in combination with Celecoxib on the proliferation of colon carcinoma HT 29 cell line.Methods Group cultured colon cancer HT 29 cells,The morphological changes of HT 29 cells was observed by inverted phase contrast microscope after Docebenone(AA 861)and Celecoxib alone or in combination;By cell proliferation assay(MTT)detect cell absorbance so as to test cell proliferation;The expression change of VEGF was detected by Immunofluorescence staining experiments under Confocal microscope.Results We can observe that cell morphology chaned significantly under the inverted phase contrast microscope,and the group of AA 861and Celecoxib in combination changed most obvious; These results of MTT suggest that the group of two drugs in combination shows the lowest rate of cell proliferation.Immunofluorescence staining experiments revealed that the expression of VEGF was decreased,and the group of two drugs in combination has the lowest expression.Conclusion AA 861 and Celecoxib in combination can produce a superior anti colon cancer effection than AA 861 or Celecoxib alone,and this effect may be related with inhibit the expression of VEGF.
【Key words】Docebenone;Celecoxib;Associative inhibition;Colon carcinomaHT 29 cell line;VEGF
近年来研究发现结肠癌组织中存在环氧化酶 2(COX 2)及5 脂氧合酶(5 LOX)的高表达,而相应的正常组织或癌旁组织中则不表达或表达量很极少。应用选择性COX 2抑制剂或5 LOX抑制剂都能抑制结肠癌细胞增殖,但是对于联合应用COX 2及5 LOX抑制剂对结肠癌的抑制作用报道很少。我们通过体外细胞实验比较单独及联合应用COX 2抑制剂塞来昔布及5 LOX抑制剂AA 861对结肠癌的抑制作用。以期二者小剂量联合应用,在减轻副作用的前提下协同获得最大的抗癌效果。
1 材料和方法
1.1 材料 人结肠癌HT 29细胞(由大连理工大学生物医学工程实验室惠赠);胎牛血清、1640培养基分别购自Hyclone公司、胰蛋白酶购自Gibico公司;塞来昔布与AA 861均购自美国Sigma试剂公司;鼠抗人VEGF抗体购自Santa cruz公司,FITC标记山羊抗小鼠IgG购自北京中衫金桥生物公司。其余试剂均为国产生化试剂。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养及分组 人结肠癌HT 29细胞采用含10%胎牛血清、100IU/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的PRMI1640培养液,置于37℃ 5%的CO2培养箱中传代培养。按实验设计分为对照组、AA 861组(50 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L)、塞来昔布组(50 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L)、AA 861联合塞来昔布组(50 μmol/LAA 861+50 μmol/L塞来昔布组、100 μmol/L AA 861+100 μmol/L塞来昔布)。
1.2.2 倒置相差显微镜观察细胞生长形态变化 取生长对数期细胞,经胰酶消化后,以3×104~5×104/孔接种于六孔板中,待细胞贴壁生长稳定后,弃去孔板中原培养液,分别按上述分组,加入含有药物的培养液作用48 h后,在倒置相差显微镜下观察细胞形态变化。
1.2.3 MTT细胞增殖试验 取生长状态良好的对数生长期细胞,按1×105/ml的密度接种于接种于96孔板中,每孔加入100 μl,每列的第一孔不加细胞,为空白对照调零,于培养箱内培养。细胞同步化后,分为空白对照组、塞来昔布组、AA 861组、塞来昔布组联合AA 861组,具体浓度如前所述,药物作用第1、2、3天分别每孔加入0.5%MTT液20 μl,继续培养4 h后吸出孔内液体,每孔加入DMSO 200 μl,立即置入酶标仪中震荡后于492 nm处波长下测定各孔吸光度(A492),细胞抑制率计算公式为:细胞抑制率=(1 实验组A492/对照组A492)×100%。