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【摘要】目的：测定食用葛中大豆苷的含量，并进行方法学考察，以期为其质量标准的建立提供可靠依据。方法：样品以甲醇（70%）超声提取，采用高效液相色谱法测定，色谱条件为：色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18柱，流动相为0～30min，甲醇-水（20∶80→65∶35）线性梯度洗脱，检测波长为250nm，柱温为30℃。 结果：建立了食用葛中大豆苷含量的测定方法，进行了方法学考察，并测定了三个产的食用葛药材中的大豆苷含量，其中产于昆明的食用葛含有的大豆苷0.84%，产于大理的含1.12% ，产于香格里拉的含1.87%。结论：测定结果表明各产地间大豆苷含量有明显差异，本方法能有效测定食用葛中的大豆苷含量，且较为稳定，所得数据可为将来建立食用葛药材标准提供依据。
【关键词】食用葛；大豆苷；含量测定；高效液相色谱法
【中图分类号】R284.1【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2014）17-0017-02
The Quantitative Determination of Daidzinn From Ethnomedicine Pueraria edulis Pamp. in Yunnan ZHANG Xiaonan XU Yi NIU Yanfei MAO Hongyun
Yunnan Institute of Materia Medica， Yunnan， Kunming， 650111Abstract：Objective To determine and analyze the content of daidzin from Radix Pueraria edulis Pamp.Methods HPLC method was used to determine and analyze the content of daidzin which were extracted by ultrasonic extraction. Result The results of the samples for the test have shown that the samples from Kunming contain Daidzin 0.84%， the samples from Dali contain 1.12%， the samples from Shangri-La contain 1.87% .Conclusion This method is efficient and stable，can be used in the future quality standards.
Keywords：Pueraria edulis Pamp.； daidzin； quantitative determination； HPLC
食用葛为豆科葛根属植物食用葛（Pueraria edulis Pamp.）的根，主要分布云南、四川、广西等地区，在云南、四川有时作粉葛药用，其资源量较为丰富，但现有研究比较薄弱。据《滇南本草》载“葛根（味甜者甘葛，味苦者苦葛），味甘，性微寒。入阳明经。治胃虚消渴，伤风、伤暑，伤寒，解表邪，发寒热往来，湿疟，解中酒热毒。小儿痘疹初出要药。”[1] 。食用葛根中含有尿囊素，二十四酸-α-甘油酯，β-谷甾醇，大豆苷元，染料木苷，大豆苷，葛根素，大豆苷元-8-C-芹菜糖（1→6）葡萄糖苷等成分。[2] 在其有效成分中，最受关注的是异黄酮类，也是其主要活性成分，本文选取其含量较高的异黄酮类成分大豆苷，建立其含量测定方法，以期为其质量评价提供可靠依据。
1药材、仪器、药品与试剂
1.1食用葛药材采自香格里拉、昆明、大理，经中国科学院昆明植物研究所分类鉴定室陶德定副研究员鉴定为食用葛Pueraria edulis Pamp.。
1.2Agilent1100型高效液相色谱仪，DAD检测器，Agilent Chemstation 工作站。
1.3大豆苷对照品：中国食品药品检测研究院提供，批号：111738-201302。
试药：甲醇（色谱纯），水（超纯水），95%乙醇（分析纯）。
2方法与结果
2.1液相色谱条件结合文献报道[3～6]和实验研究，色谱条件确定为：色谱柱Agilent ZORBAX SB-C18；流动相：甲醇-水，线性梯度洗脱，条件见下表；流速：1ml/min；柱温：30℃；检测波长：250nm；进样量：10μl。
表1梯度洗脱条件
时间/min甲醇/%水/%02080305634322080
2.2标准品溶液制备精密称取大豆苷对照品20mg，加70%甲醇溶解，定容到25ml，即为标准品母液，取母液适量，加70%甲醇稀释到需要浓度即得。
2.3供试品溶液制备精密称取食用葛药材约0.2g，加入甲醇（70%）20ml，称定重量，超声提取30min（59KHz， 325W），放冷，用甲醇（70%）补足失重，滤过，滤液用0.2μm滤膜滤过，即得。
2.4线性关系考察精密量取大豆苷标准品母液适量，70%甲醇稀释，分别配制成浓度为3.0、10.0、20.0、50.0、80.0、100.0、200.0ug/ml的对照品溶液，照确定的色谱条件进样测定，记录色谱图，由浓度及相应峰面积得线性方程和相关系数。
表2线性关系考察（n=7）
浓度ug/ml3.010.020.050.080.0100.0200.0峰面积79.4314.5662.41684.32738.93497.97060.8
线性方程：Y=35.473X—55.138，r2=0.9999，大豆苷在3～200ug/ml浓度范围内线性关系良好。 2.5精密度考察取同一大豆苷标准液（20ug/ml），按选定色谱条件连续进样6次，峰面积RSD为0.55 %<3%，表明仪器精密度良好。
2.6重复性精密称取食用葛药材（产地昆明）6份，按照2.3项下供试品溶液制备方法制备，测定大豆苷量，测得大豆苷平均含量为1692.9ug/g，RSD为2.17%，表明本方法重复性良好
2.7回收率试验称取已知含量的食用葛药材（1692.9ug/g）9份，以1∶0.5，1∶1，1∶1.5分别精密加入大豆苷对照品，按照供试品溶液制备方法制备，测定大豆苷量，计算回收率，回收率为98.4%～103.2%，RSD为1.49%<3%。结果见下表3：
2.8耐用性试验
2.8.1不同色谱柱考察选用不同品牌的三根色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18（4.6×250mm，5μm）， Waters Symmetry C18（4.6×250mm，5μm），Shiseido C18（4.6×250mm，5μm）；对供试品溶液和标准品溶液用2.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图，结果表明三根色谱柱保留时间与峰形略有差异，但大豆苷的峰都能完全分离，分离度达到1.5以上，且所测得的大豆苷含量只是略有差异。
2.8.2不同柱温考察改变柱温，其他条件不变，用2.1项下色谱条件进样测定供试品溶液（产地昆明），记录色谱图，结果表明柱温在有变动时，测定结果不受大的影响，20℃时出峰时间为17.321min，峰面积为625.16；30℃是出峰时间为14.087min，峰面积为627.15；40℃时，出峰时间为14.523min，峰面积为634.62。
2.8.3不同仪器考察选用不同品牌的三台高效液相色谱仪：Agilent 1100， Waters 2695，Shimadzu LC 2010；用2.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图，结果表明在仪器的品牌、型号有变动时，大豆苷的峰能够完全分离，且进样浓度有小的波动时，测定结果不受大的影响，在仪器稳定的情况下，仍可以准确进行定量测定。
2.9供试品溶液稳定性考察取同一供试品溶液（产地昆明），分别在0h、2h、6h、12h照2.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图，结果大豆苷含量RSD值为1.75%，表明供试品溶液在12h内稳定性良好。
2.10样品测定取不同产地的样品，分别按“2.3”项下方法制备供试品溶液，分别进样10μl，按“2.1”项下色谱条件测定，记录各成分的峰面积，以外标法计算样品中各成分的含量，结果见表4。三个产地食用葛药材中大豆苷含量分别为1.87%（香格里拉），1.12%（大理），0.84%（昆明）。
3讨论
实验结果表明，云南三个产地的食用葛中都含有一定量的大豆苷，但含量有明显差异，产于大理和香格里拉的含量都高于昆明，这从一个方面提示食用葛将来栽培的优质产区可在滇西北遴选。
在笔者的研究中还发现，食用葛不含葛根素，与药典规定的粉葛在成分上差异较大，是否能与粉葛混用值得考证。如果食用葛作为地方习用药药用，则需新制定专门的药材质量标准，本项研究的成果可为此提供可靠数据。此外，我们还进行过食用葛水提物解酒作用和急性毒性方面的研究，结果表明食用葛水提物有较明显的解酒作用，且毒性较低，在将来的保健品开发中是值得注意的优质资源。
参考文献
[1]滇南本草整理组.《滇南本草》（整理本.第2卷）[M].昆明：云南人民出版社，1977：212.
[2]史海明，闵知大.食用葛根的化学成分研究[J].中国药科大学学报，2000，31（6）：411.
[3]栾玉泉，何作顺.大理食用葛根中葛根素和葛根总黄酮含量分析与评价[J].云南中医学院学报，2009，32（3）：20-21.
[4]阮建林，张雯洁，谷俊峰，等.云南产葛根的葛根素及总黄酮含量测定[J].云南中医中药杂志，2000，21（3）：39-40.
[5]裴香萍，刘亚明.野葛、粉葛与云南葛中葛根素、大豆苷、大豆苷元、染料木素的含量比较[J].中国药房，2012，23（47）：4462-4464
[6]胡江琴，王利琳.葛根的化学成分分析[J].杭州师范学报，1993（3）：70-73.
【关键词】食用葛；大豆苷；含量测定；高效液相色谱法
【中图分类号】R284.1【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2014）17-0017-02
The Quantitative Determination of Daidzinn From Ethnomedicine Pueraria edulis Pamp. in Yunnan ZHANG Xiaonan XU Yi NIU Yanfei MAO Hongyun
Yunnan Institute of Materia Medica， Yunnan， Kunming， 650111Abstract：Objective To determine and analyze the content of daidzin from Radix Pueraria edulis Pamp.Methods HPLC method was used to determine and analyze the content of daidzin which were extracted by ultrasonic extraction. Result The results of the samples for the test have shown that the samples from Kunming contain Daidzin 0.84%， the samples from Dali contain 1.12%， the samples from Shangri-La contain 1.87% .Conclusion This method is efficient and stable，can be used in the future quality standards.
Keywords：Pueraria edulis Pamp.； daidzin； quantitative determination； HPLC
食用葛为豆科葛根属植物食用葛（Pueraria edulis Pamp.）的根，主要分布云南、四川、广西等地区，在云南、四川有时作粉葛药用，其资源量较为丰富，但现有研究比较薄弱。据《滇南本草》载“葛根（味甜者甘葛，味苦者苦葛），味甘，性微寒。入阳明经。治胃虚消渴，伤风、伤暑，伤寒，解表邪，发寒热往来，湿疟，解中酒热毒。小儿痘疹初出要药。”[1] 。食用葛根中含有尿囊素，二十四酸-α-甘油酯，β-谷甾醇，大豆苷元，染料木苷，大豆苷，葛根素，大豆苷元-8-C-芹菜糖（1→6）葡萄糖苷等成分。[2] 在其有效成分中，最受关注的是异黄酮类，也是其主要活性成分，本文选取其含量较高的异黄酮类成分大豆苷，建立其含量测定方法，以期为其质量评价提供可靠依据。
1药材、仪器、药品与试剂
1.1食用葛药材采自香格里拉、昆明、大理，经中国科学院昆明植物研究所分类鉴定室陶德定副研究员鉴定为食用葛Pueraria edulis Pamp.。
1.2Agilent1100型高效液相色谱仪，DAD检测器，Agilent Chemstation 工作站。
1.3大豆苷对照品：中国食品药品检测研究院提供，批号：111738-201302。
试药：甲醇（色谱纯），水（超纯水），95%乙醇（分析纯）。
2方法与结果
2.1液相色谱条件结合文献报道[3～6]和实验研究，色谱条件确定为：色谱柱Agilent ZORBAX SB-C18；流动相：甲醇-水，线性梯度洗脱，条件见下表；流速：1ml/min；柱温：30℃；检测波长：250nm；进样量：10μl。
表1梯度洗脱条件
时间/min甲醇/%水/%02080305634322080
2.2标准品溶液制备精密称取大豆苷对照品20mg，加70%甲醇溶解，定容到25ml，即为标准品母液，取母液适量，加70%甲醇稀释到需要浓度即得。
2.3供试品溶液制备精密称取食用葛药材约0.2g，加入甲醇（70%）20ml，称定重量，超声提取30min（59KHz， 325W），放冷，用甲醇（70%）补足失重，滤过，滤液用0.2μm滤膜滤过，即得。
2.4线性关系考察精密量取大豆苷标准品母液适量，70%甲醇稀释，分别配制成浓度为3.0、10.0、20.0、50.0、80.0、100.0、200.0ug/ml的对照品溶液，照确定的色谱条件进样测定，记录色谱图，由浓度及相应峰面积得线性方程和相关系数。
表2线性关系考察（n=7）
浓度ug/ml3.010.020.050.080.0100.0200.0峰面积79.4314.5662.41684.32738.93497.97060.8
线性方程：Y=35.473X—55.138，r2=0.9999，大豆苷在3～200ug/ml浓度范围内线性关系良好。 2.5精密度考察取同一大豆苷标准液（20ug/ml），按选定色谱条件连续进样6次，峰面积RSD为0.55 %<3%，表明仪器精密度良好。
2.6重复性精密称取食用葛药材（产地昆明）6份，按照2.3项下供试品溶液制备方法制备，测定大豆苷量，测得大豆苷平均含量为1692.9ug/g，RSD为2.17%，表明本方法重复性良好
2.7回收率试验称取已知含量的食用葛药材（1692.9ug/g）9份，以1∶0.5，1∶1，1∶1.5分别精密加入大豆苷对照品，按照供试品溶液制备方法制备，测定大豆苷量，计算回收率，回收率为98.4%～103.2%，RSD为1.49%<3%。结果见下表3：
2.8耐用性试验
2.8.1不同色谱柱考察选用不同品牌的三根色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18（4.6×250mm，5μm）， Waters Symmetry C18（4.6×250mm，5μm），Shiseido C18（4.6×250mm，5μm）；对供试品溶液和标准品溶液用2.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图，结果表明三根色谱柱保留时间与峰形略有差异，但大豆苷的峰都能完全分离，分离度达到1.5以上，且所测得的大豆苷含量只是略有差异。
2.8.2不同柱温考察改变柱温，其他条件不变，用2.1项下色谱条件进样测定供试品溶液（产地昆明），记录色谱图，结果表明柱温在有变动时，测定结果不受大的影响，20℃时出峰时间为17.321min，峰面积为625.16；30℃是出峰时间为14.087min，峰面积为627.15；40℃时，出峰时间为14.523min，峰面积为634.62。
2.8.3不同仪器考察选用不同品牌的三台高效液相色谱仪：Agilent 1100， Waters 2695，Shimadzu LC 2010；用2.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图，结果表明在仪器的品牌、型号有变动时，大豆苷的峰能够完全分离，且进样浓度有小的波动时，测定结果不受大的影响，在仪器稳定的情况下，仍可以准确进行定量测定。
2.9供试品溶液稳定性考察取同一供试品溶液（产地昆明），分别在0h、2h、6h、12h照2.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图，结果大豆苷含量RSD值为1.75%，表明供试品溶液在12h内稳定性良好。
2.10样品测定取不同产地的样品，分别按“2.3”项下方法制备供试品溶液，分别进样10μl，按“2.1”项下色谱条件测定，记录各成分的峰面积，以外标法计算样品中各成分的含量，结果见表4。三个产地食用葛药材中大豆苷含量分别为1.87%（香格里拉），1.12%（大理），0.84%（昆明）。
3讨论
实验结果表明，云南三个产地的食用葛中都含有一定量的大豆苷，但含量有明显差异，产于大理和香格里拉的含量都高于昆明，这从一个方面提示食用葛将来栽培的优质产区可在滇西北遴选。
在笔者的研究中还发现，食用葛不含葛根素，与药典规定的粉葛在成分上差异较大，是否能与粉葛混用值得考证。如果食用葛作为地方习用药药用，则需新制定专门的药材质量标准，本项研究的成果可为此提供可靠数据。此外，我们还进行过食用葛水提物解酒作用和急性毒性方面的研究，结果表明食用葛水提物有较明显的解酒作用，且毒性较低，在将来的保健品开发中是值得注意的优质资源。
参考文献
[1]滇南本草整理组.《滇南本草》（整理本.第2卷）[M].昆明：云南人民出版社，1977：212.
[2]史海明，闵知大.食用葛根的化学成分研究[J].中国药科大学学报，2000，31（6）：411.
[3]栾玉泉，何作顺.大理食用葛根中葛根素和葛根总黄酮含量分析与评价[J].云南中医学院学报，2009，32（3）：20-21.
[4]阮建林，张雯洁，谷俊峰，等.云南产葛根的葛根素及总黄酮含量测定[J].云南中医中药杂志，2000，21（3）：39-40.
[5]裴香萍，刘亚明.野葛、粉葛与云南葛中葛根素、大豆苷、大豆苷元、染料木素的含量比较[J].中国药房，2012，23（47）：4462-4464
[6]胡江琴，王利琳.葛根的化学成分分析[J].杭州师范学报，1993（3）：70-73.