目的 研究人工克隆表达的芳香烃受体核转位蛋白(ARNT)与天然芳香烃受体(AhR)特异性结合及其对制备的多克隆抗体识别的情况,通过两者结合与二噁(口英)(TCDD)的剂量反应关系,探索TCDD生物检测方法.方法(1)以小鼠肝组织总RNA为模板,通过RT-PCR扩增目的 基因AhR-PAS[periodicity(Per)/Arylhydrocarbon nuclear translocatar(ARNT)/single-minded(Sim)]端、AhR羧基末端(AhR-C端)、ARNT-PAS端,构建含有目的基因的pGEX-5X1重组表达质粒,并采用大肠杆菌原核系统进行克隆表达.(2)用上述克隆表达的AhR片段蛋白(AhR-PAS、AhR-C)作为抗原免疫家兔,制备多克隆抗体.(3)从C57BL/6J纯系小鼠肝组织中提取具有结合活性的天然AhR复合物,将天然AhR复合物与结合在谷胱甘肽硫转移酶(GST)上面的融合蛋白GST-ARNT-PAS,分别在0.25、0.50、1.00、2.00pmol TCDD存在的条件下进行结合,通过亲和吸附和免疫印迹观察所形成的蛋白复合物的量.结果(1)成功构建含有目的 基因AhR-PAS、AhR-C和ARNT-PAS的重组质粒,并通过大肠杆菌原核系统表达出具有结合活性的目的蛋白;(2)免疫家兔制得的多克隆抗体AhR-PAS、AhR-C的检测下限分别为5、1ng;(3)测得该法制备的小鼠肝脏匀浆中总蛋白质的浓度为60.5 mg/ml;在TCDD存在的条件下,克隆得到的融合蛋白GST-ARNT-PAS能够与天然AhR复合物特异性地结合,并测得检测下限为0.25pmol,约80 Pg TCDD.结论 成功地建立了基于克隆表达的芳香烃受体系统的TCDD生物检测方法,且检测下限达到pg级别。