论文部分内容阅读
摘要[目的]研究氨氮对鲤幼鱼肝组织谷胱甘肽及其酶系的影响，阐析谷胱甘肽对环境胁迫的抗氧化防御机理。[方法]将黄河鲤在对照组（0 mg/L）和低（10 mg/L）、中 （20 mg/L）、高（30 mg/L）3个氨氮处理组中染毒，研究氨氮胁迫 6、24和 48 h后对肝组织中谷胱甘肽（GSH）含量、谷胱甘肽过氧化物酶（GSHPx）和谷胱甘肽转移酶（GST）活性的影响。[结果]氨氮胁迫诱导黄河鲤幼鱼肝组织中GSH含量、GSHPx和GST活性迅速升高，并在氨氮胁迫24 h达到最大值，从而抵御氨氮造成的氧化胁迫。随着氨氮胁迫时间的延长，肝组织中GSH含量、GSHPx和GST活性降低，抗氧化能力减弱。[结论]氨氮胁迫诱导黄河鲤幼鱼肝组织中谷胱甘肽含量及其酶系活性改变，以有效清除细胞中的活性氧和有毒代谢物，提高鱼类对环境的适应性。
关键词黄河鲤；氨氮；GSHPx活性；GST活性；GSH含量
中图分类号S965.116文献标识码
A文章编号0517-6611（2015）26-130-02
Abstract [Objective] The aim was to clarify the antioxidative defense of glutathione （GSH） to ammonia stress.[Method] Cyprinus carpio were exposed to different ammonia levels：0 mg/L （control），10 mg/L （low），20 mg/L （middle） and 30 mg/L （high） NH4Cl，each ammonia level was randomly triplicate and sampled at 6，24 and 48 h，respectively.[Results] The results indicated that the content of GSH and activities of glutathione peroxidase （GSHPX） and glutathione Stransferase （GST） increased significantly after exposed to ammonia for 24 h，which protected Cyprinus carpio from oxidative damage induced by ammonia stress.However，the content of GSH and activities of GSHPX and GST decreased with increasing exposure time，and antioxidant capacity decreased with prolonged stress.[Conclusion] Our results suggested that GSH and GSHrelated defense enzymes had important roles in protecting against oxidative damage under ammonia stress .
Key words Carp； Ammonia nitrogen； GSHPx activity； GST activity； GSH content 近年来，在规模化集约化水产养殖中，高放养密度和高投饲率使得水体中的残饵、肥料和生物排泄物等不断增多，经氨化作用产生大量的氨氮，目前已成为水产养殖中影响鱼类的主要胁迫因子之一[1]。氨氮通过鱼鳃进入体内后，首先对酶蛋白活性和膜稳定性产生明显影响，导致机体生理生化指标发生改变[2-3]。水体中高浓度氨氮还能使鱼体的鳃、肾和肝组织结构发生病变、免疫力下降，生长、发育受阻，甚至导致死亡，严重影响水产品的产量和品质[4-5]。谷胱甘肽（GSH）是一种细胞内重要的调节代谢物质，具有活性巯基（-SH），可作为谷胱甘肽过氧化物酶（GSHPx）和谷胱甘肽转移酶（GST）特有的底物，有效清除胞内过量的活性氧和脂质过氧化物，从而维持机体正常的生理功能和物质代谢[6-7]。笔者通过研究氨氮胁迫后黄河鲤幼鱼肝组织中谷胱甘肽含量及其酶系活性的变化，初步探讨鱼类谷胱甘肽的抗氧化防御机理，以期为利用谷胱甘肽提高鱼类的环境适应性提供科学依据。
1材料与方法
1.1试验材料
黄河鲤幼鱼为购自山西清徐渔场的鱼苗，体质量为（100.00±0.35）g。試验前室内暂养2周，日投食2次。养鱼用水为曝气自来水，水温为（25±1）℃，pH为（7.5±0.3），用充氧机连续充气以保证溶解氧含量在6.0 mg/L以上，正式试验前停食24 h。
1.2染毒试验
鱼类染毒采用静态水质接触染毒法。参照龙章强[8]的方法，设置对照组、低氨氮组（10 mg/L）、中氨氮组 （20 mg/L）和高氨氮组（30 mg/L），每个处理设3个平行。用氯化铵（NH4Cl）配制试验组总氨氮浓度100 L，随机放入健康活泼的黄河鲤20尾。试验期间每天定时换水，采用虹吸式法监测总氨氮浓度。
1.3样品采集与指标测定
在染毒 6、 24和 48 h后，各试验组随机取黄河鲤3尾，采集肝脏样品。谷胱甘肽（GSH）含量、谷胱甘肽过氧化物酶（GSHPx）和谷胱甘肽转移酶（GST）活性均使用南京建成生物工程研究所试剂盒测定。
1.4数据统计与分析
试验结果均以平均值和标准误表示，使用SPSS统计软件进行方差分析后，采用Duncan’s多重比较分析处理组与对照组之间的差异显著性（*表示P<0.05；**表示P<0.01）。
2结果与分析 2.1氨氮胁迫对黄河鲤幼鱼肝组织中GSH含量的影响
从图1可以看出，
氨氮胁迫后，黃河鲤幼鱼肝组织中GSH含量呈先升高后降低的趋势。氨氮胁迫6 h时，肝组织中GSH含量迅速升高。胁迫24 h后，各胁迫组GSH含量达
到最大，与对照组相比差异显著（P<0.05）。随着氨氮胁迫时间的延长，肝组织中GSH含量降低，各胁迫组GSH含量与对照组没有显著差异。
2.2氨氮胁迫对黄河鲤幼鱼肝组织GSHPx和GST活性的影响从图2可以看出，氨氮胁迫后黄河鲤幼鱼肝组织中GSHPx和GST活性提高，并在胁迫前期维持较高水平，但在胁迫后期呈现不同的变化趋势。氨氮胁迫6 h时，肝组织中GSHPx和GST活性迅速提高。胁迫24 h后，GSHPx和GST活性达到最大，与对照组差异显著（P<0.05）。随着氨氮胁迫时间的延长，肝组织中GSHPx活性降低，GST活性维持较高水平。胁迫48 h后，30 mg/L氨氮组GSHPx活性显著低于对照组，而GST活性显著高于对照组（P<0.05）。
3讨论
当鱼体受到氨氮胁迫时，诱导体内产生大量的活性氧自由基（ROS），攻击附近的生物大分子，对机体造成氧化胁迫[9]。谷胱甘肽是生物体内主要的抗氧化物质之一，与GSHPx和GST等抗氧化酶协同作用，有效清除体内过量的活性氧和脂质过氧化物[10]。该研究中氨氮胁迫初期黄河鲤幼鱼GSH含量增加，GSHPx和GST活性提高，催化GSH与脂质过氧化物和ROS反应，使有毒的脂质过氧化物还原成无毒的醇类，同时促进H2O2分解成水，从而保护生物膜免受过氧化物的损害，维持细胞正常的生理功能。随着氨氮胁迫时间的延长，大量的GSH被氧化为GSSG，体内的GSH含量降低，使GSHPx和GST活性随底物的减少而下降，机体的抗氧化能力降低。
该研究表明GSH及其酶系在清除氨氮胁迫诱导产生的活性氧过程中具有重要作用。另有研究表明，饲料中添加GSH能显著提高鱼类的生长性能，增强机体的抗氧化能力和非特异性免疫力[11-12]。因此，在规模化和集约化养殖过程中在饲料中添加一定量的GSH可以有效提高鱼类对营养、拥挤、氨氮等应激因子的抵抗力，促进鱼类的生长。
参考文献
[1]
王琨.氨氮对鲤（Cyprinus carpio Linnaeus）幼鱼部分组织及血液指标的影响[D].哈尔滨：东北农业大学，2007.
[2] CHING B，CHEW S F，WONG W P，et al.Environmental ammonia exposure induces oxidative stress in gills and brain of Boleophthalmus boddarti （Mudskipper） [J].Aquatic toxicology，2009，95（3）：203-212.
[3] 刘晓华，曹俊明，杨大伟，等.氨氮胁迫前后凡纳滨对虾组织中抗氧化酶和脂质过氧化产物的分布[J].水利渔业，2007，27（6）：24-26.
[4] 胡毅，黄云，钟蕾，等.氨氮胁迫对青鱼幼鱼鳃丝Na+/K+-ATP酶、组织结构及血清部分生理生化指标的影响[J].水产学报，2012，36（4）：538-545.
[5] 黄鹤忠，李义，宋学宏，等.氨氮胁迫对中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）免疫功能的影响[J].海洋与湖沼，2006，37（3）：198-205.
[6] 马森.谷胱甘肽过氧化物酶和谷胱甘肽转硫酶研究进展[J].动物医学进展，2008，29（10）：53-56.
[7] CERIELLO A.Hyperglycaemia：The bridge between non-enzymatic glycation and oxidative stress in the pathogenesis of diabetic complications[J].Diabetes nutrition metabolism，1999，12（1）：42-46.
[8] 龙章强.黑鲷（Acanthopagrus schlegeli）幼鱼对氨氮胁迫的生理响应及其维生素C 的营养需求研究[D].上海：华东师范大学，2008.
[9] 姜会民.氨氮胁迫对黄河鲤幼鱼红细胞微核、核异常的影响[J].四川动物，2011，30（5）：768-771.
[10] 周婷婷，曹俊明，赵红霞，等.谷胱甘肽在水产动物中的营养生理作用研究进展[J].水产科学，2012，31（10）：630-634.
[11] 赵红霞，谭永刚，周萌，等.饲料中添加谷胱甘肽对草鱼生长/生理指标和抗病力的影响[J].中国水产科学，2007，14（4）：678-683.
[12] 董桂芳，朱晓鸣，杨云霞，等.黄颡鱼饲料中添加谷胱甘肽降低藻毒素毒性作用的研究[J].水生生物学报，2010，34（4）：722-729.
关键词黄河鲤；氨氮；GSHPx活性；GST活性；GSH含量
中图分类号S965.116文献标识码
A文章编号0517-6611（2015）26-130-02
Abstract [Objective] The aim was to clarify the antioxidative defense of glutathione （GSH） to ammonia stress.[Method] Cyprinus carpio were exposed to different ammonia levels：0 mg/L （control），10 mg/L （low），20 mg/L （middle） and 30 mg/L （high） NH4Cl，each ammonia level was randomly triplicate and sampled at 6，24 and 48 h，respectively.[Results] The results indicated that the content of GSH and activities of glutathione peroxidase （GSHPX） and glutathione Stransferase （GST） increased significantly after exposed to ammonia for 24 h，which protected Cyprinus carpio from oxidative damage induced by ammonia stress.However，the content of GSH and activities of GSHPX and GST decreased with increasing exposure time，and antioxidant capacity decreased with prolonged stress.[Conclusion] Our results suggested that GSH and GSHrelated defense enzymes had important roles in protecting against oxidative damage under ammonia stress .
Key words Carp； Ammonia nitrogen； GSHPx activity； GST activity； GSH content 近年来，在规模化集约化水产养殖中，高放养密度和高投饲率使得水体中的残饵、肥料和生物排泄物等不断增多，经氨化作用产生大量的氨氮，目前已成为水产养殖中影响鱼类的主要胁迫因子之一[1]。氨氮通过鱼鳃进入体内后，首先对酶蛋白活性和膜稳定性产生明显影响，导致机体生理生化指标发生改变[2-3]。水体中高浓度氨氮还能使鱼体的鳃、肾和肝组织结构发生病变、免疫力下降，生长、发育受阻，甚至导致死亡，严重影响水产品的产量和品质[4-5]。谷胱甘肽（GSH）是一种细胞内重要的调节代谢物质，具有活性巯基（-SH），可作为谷胱甘肽过氧化物酶（GSHPx）和谷胱甘肽转移酶（GST）特有的底物，有效清除胞内过量的活性氧和脂质过氧化物，从而维持机体正常的生理功能和物质代谢[6-7]。笔者通过研究氨氮胁迫后黄河鲤幼鱼肝组织中谷胱甘肽含量及其酶系活性的变化，初步探讨鱼类谷胱甘肽的抗氧化防御机理，以期为利用谷胱甘肽提高鱼类的环境适应性提供科学依据。
1材料与方法
1.1试验材料
黄河鲤幼鱼为购自山西清徐渔场的鱼苗，体质量为（100.00±0.35）g。試验前室内暂养2周，日投食2次。养鱼用水为曝气自来水，水温为（25±1）℃，pH为（7.5±0.3），用充氧机连续充气以保证溶解氧含量在6.0 mg/L以上，正式试验前停食24 h。
1.2染毒试验
鱼类染毒采用静态水质接触染毒法。参照龙章强[8]的方法，设置对照组、低氨氮组（10 mg/L）、中氨氮组 （20 mg/L）和高氨氮组（30 mg/L），每个处理设3个平行。用氯化铵（NH4Cl）配制试验组总氨氮浓度100 L，随机放入健康活泼的黄河鲤20尾。试验期间每天定时换水，采用虹吸式法监测总氨氮浓度。
1.3样品采集与指标测定
在染毒 6、 24和 48 h后，各试验组随机取黄河鲤3尾，采集肝脏样品。谷胱甘肽（GSH）含量、谷胱甘肽过氧化物酶（GSHPx）和谷胱甘肽转移酶（GST）活性均使用南京建成生物工程研究所试剂盒测定。
1.4数据统计与分析
试验结果均以平均值和标准误表示，使用SPSS统计软件进行方差分析后，采用Duncan’s多重比较分析处理组与对照组之间的差异显著性（*表示P<0.05；**表示P<0.01）。
2结果与分析 2.1氨氮胁迫对黄河鲤幼鱼肝组织中GSH含量的影响
从图1可以看出，
氨氮胁迫后，黃河鲤幼鱼肝组织中GSH含量呈先升高后降低的趋势。氨氮胁迫6 h时，肝组织中GSH含量迅速升高。胁迫24 h后，各胁迫组GSH含量达
到最大，与对照组相比差异显著（P<0.05）。随着氨氮胁迫时间的延长，肝组织中GSH含量降低，各胁迫组GSH含量与对照组没有显著差异。
2.2氨氮胁迫对黄河鲤幼鱼肝组织GSHPx和GST活性的影响从图2可以看出，氨氮胁迫后黄河鲤幼鱼肝组织中GSHPx和GST活性提高，并在胁迫前期维持较高水平，但在胁迫后期呈现不同的变化趋势。氨氮胁迫6 h时，肝组织中GSHPx和GST活性迅速提高。胁迫24 h后，GSHPx和GST活性达到最大，与对照组差异显著（P<0.05）。随着氨氮胁迫时间的延长，肝组织中GSHPx活性降低，GST活性维持较高水平。胁迫48 h后，30 mg/L氨氮组GSHPx活性显著低于对照组，而GST活性显著高于对照组（P<0.05）。
3讨论
当鱼体受到氨氮胁迫时，诱导体内产生大量的活性氧自由基（ROS），攻击附近的生物大分子，对机体造成氧化胁迫[9]。谷胱甘肽是生物体内主要的抗氧化物质之一，与GSHPx和GST等抗氧化酶协同作用，有效清除体内过量的活性氧和脂质过氧化物[10]。该研究中氨氮胁迫初期黄河鲤幼鱼GSH含量增加，GSHPx和GST活性提高，催化GSH与脂质过氧化物和ROS反应，使有毒的脂质过氧化物还原成无毒的醇类，同时促进H2O2分解成水，从而保护生物膜免受过氧化物的损害，维持细胞正常的生理功能。随着氨氮胁迫时间的延长，大量的GSH被氧化为GSSG，体内的GSH含量降低，使GSHPx和GST活性随底物的减少而下降，机体的抗氧化能力降低。
该研究表明GSH及其酶系在清除氨氮胁迫诱导产生的活性氧过程中具有重要作用。另有研究表明，饲料中添加GSH能显著提高鱼类的生长性能，增强机体的抗氧化能力和非特异性免疫力[11-12]。因此，在规模化和集约化养殖过程中在饲料中添加一定量的GSH可以有效提高鱼类对营养、拥挤、氨氮等应激因子的抵抗力，促进鱼类的生长。
参考文献
[1]
王琨.氨氮对鲤（Cyprinus carpio Linnaeus）幼鱼部分组织及血液指标的影响[D].哈尔滨：东北农业大学，2007.
[2] CHING B，CHEW S F，WONG W P，et al.Environmental ammonia exposure induces oxidative stress in gills and brain of Boleophthalmus boddarti （Mudskipper） [J].Aquatic toxicology，2009，95（3）：203-212.
[3] 刘晓华，曹俊明，杨大伟，等.氨氮胁迫前后凡纳滨对虾组织中抗氧化酶和脂质过氧化产物的分布[J].水利渔业，2007，27（6）：24-26.
[4] 胡毅，黄云，钟蕾，等.氨氮胁迫对青鱼幼鱼鳃丝Na+/K+-ATP酶、组织结构及血清部分生理生化指标的影响[J].水产学报，2012，36（4）：538-545.
[5] 黄鹤忠，李义，宋学宏，等.氨氮胁迫对中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）免疫功能的影响[J].海洋与湖沼，2006，37（3）：198-205.
[6] 马森.谷胱甘肽过氧化物酶和谷胱甘肽转硫酶研究进展[J].动物医学进展，2008，29（10）：53-56.
[7] CERIELLO A.Hyperglycaemia：The bridge between non-enzymatic glycation and oxidative stress in the pathogenesis of diabetic complications[J].Diabetes nutrition metabolism，1999，12（1）：42-46.
[8] 龙章强.黑鲷（Acanthopagrus schlegeli）幼鱼对氨氮胁迫的生理响应及其维生素C 的营养需求研究[D].上海：华东师范大学，2008.
[9] 姜会民.氨氮胁迫对黄河鲤幼鱼红细胞微核、核异常的影响[J].四川动物，2011，30（5）：768-771.
[10] 周婷婷，曹俊明，赵红霞，等.谷胱甘肽在水产动物中的营养生理作用研究进展[J].水产科学，2012，31（10）：630-634.
[11] 赵红霞，谭永刚，周萌，等.饲料中添加谷胱甘肽对草鱼生长/生理指标和抗病力的影响[J].中国水产科学，2007，14（4）：678-683.
[12] 董桂芳，朱晓鸣，杨云霞，等.黄颡鱼饲料中添加谷胱甘肽降低藻毒素毒性作用的研究[J].水生生物学报，2010，34（4）：722-729.