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摘 要：拟环纹豹蛛Pardosa pseudoannulata是稻田害虫重要的自然天敌，在绿色防控中有重要作用。本研究基于拟环纹豹蛛转录组数据，使用微卫星鉴定工具软件（MISA） 挖掘和分析其简单序列重复（SSR）位点。结果表明：拟环纹豹蛛转录组Unigene序列中共检测到6474个SSR位点，平均长度为12.36 bp，分布于4411条Unigene上。单核苷酸重复类型为拟环纹豹蛛转录组SSR位点的主导基序类型，共5025个，占总SSR位点的77.62%;在拟环纹豹蛛转录组序列识别的6474个SSR中共发现了53种重复基元，从单核苷酸到五核苷酸重复基元分别有2种、6种、27种、15种和3种，其中（A/T）基元类型占明显优势，占总SSR的74.44%。拟环纹豹蛛转录组SSR位点丰富，有较高的多态性潜能，可作为开发SSR标记的有效来源，为拟环纹豹蛛的遗传多样性分析、功能基因的开发利用等方面的研究奠定基础。
关键词：拟环纹豹蛛;转录组;SSR;重复基元
中图分类号：Q346+.5;Q959.1
文献标识码：A
文章编号：1008-0457（2021）04-0031-07
国际DOI编码：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2021.04.005
Abstract：The wolf spider Pardosa pseudoannulata is an important biological control agent of rice pests and plays an important role in green prevention and control.In this study，based on the transcriptome data of P.pseudoannulata，we used MISA （microsatellite identification tool） to analyze its SSR （simple sequence repeat） loci.The results showed that a total of 6474 SSR loci were detected in the Unigene sequence of the transcriptome data，with an average length of 12.36 bp，distributed on 4411 Unigenes.The Mono-nucleotide repeat type were the dominanttype，its number was 5025，accounting for 77.62% of the total SSR loci.The 6474 SSR lociwere identified 53 repetitive motifs，there were 2，6，27，15 and 3 repetitive motifs from Mono-nucleotide to Hexa-nucleotide.（A/T）was dominant repetitive motif，accounting for 74.44% of the total SSR.The SSR loci of transcriptome in P.pseudoannulata were rich and high polymorphism potential. Our results can be used as an effective source for the development of SSR marker and provide foundation for research of genetic diversity and development functional genes of P.pseudoannulata.
Keywords：Pardosa pseudoannulata;transcriptome;SSR;repeat motif
擬环纹豹蛛Pardosa pseudoannulata属于蛛形纲Arachnida蜘蛛目Araneae狼蛛科Lycosidae豹蛛属Pardosa，在我国分布较广，是稻田生态系统中优势种蜘蛛，尤其在我国南方的广东[1]、湖南[2]、湖北[3]、云南[4]、贵州[5]等地区常年可见。拟环纹豹蛛属于中型蜘蛛，成蛛体长可达到13 mm，雌雄蛛均可多次交配，雌蛛每次平均产卵156粒，孵化的幼蛛群集在雌蛛背面3～7 d后才离开，幼蛛期47～158 d，成蛛期121～236 d，雌蛛较雄蛛长21～62 d[2，6-7]。拟环纹豹蛛是稻田害虫的重要捕食性天敌，其空间生态位宽[6，8]，能够在水面、稻株上、地面上等多种环境捕食褐飞虱Nilaparvata lugens、白背飞虱Sogatella furcifera、稻纵卷叶螟Cnaphalocrocis medinalis、黑尾叶蝉Nephotettix bipunctatus等害虫。在稻田中捕食飞虱和叶蝉，90%是狼蛛科蜘蛛的功劳[9-13]。拟环纹豹蛛的性情凶猛，专捕活虫，即使饱食，也会把猎物咬死后才休止，食量也大，2龄幼蛛每头每天平均捕食黑腹果蝇Drosophila melanogaster 4.36头，成蛛每头每天捕食水蝇Hydrellia sp.可达30头[8，14]，雌成蛛对亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis 2龄幼虫的捕食上限为116头[15]，王智等[16]研究表明低剂量农药对拟环纹豹蛛捕食褐飞虱的能力有增强作用。本课题组前期对拟环纹豹蛛的求偶交配行为[17]、选择行为[18]和温度胁迫[19-20]和SNP位点[21]等方面进行了研究。目前，拟环纹豹蛛转录组SSR位点分析未见报道。 微卫星（microsatellite），又称为简单序列重复（simple sequence repeat，SSR），是指以1～6个核苷酸为重復单元串联组成的重复序列，串联重复10～60次组成的简单重复序，微卫星具有高多态性、共显性、高可重复性、数量丰富等优点[22-23]。因此，微卫星在遗传分析中可以作为一种理想的分子标记，已被广泛应用于生物遗传研究中，在苦荞Fagopyrum tartaricum[24]、密花香薷Elsholtzia densa[25]、密叶红豆杉Taxus fuana[26]、金佛山方竹Chimonobambusa utilis[27]等植物;麦红吸浆虫Sitodiplosis mosellana[28]、蚜虫[29]、小胸鳖甲Microdera punctipennis[30]、桔小实蝇Bactrocera dorsalis[31]、沟渠豹蛛Pardosa laura[32]等动物中进行了报道。本文基于拟环纹豹蛛转录组测序数据，对其SSR特征进行分析，旨在为SSR标记在该物种的遗传多样性分析、功能基因的开发利用等方面提供参考。
1 材料与方法
1.1 供试虫源
拟环纹豹蛛的亚成蛛采集于广州市华南农业大学试验田（113.7°E，23.17°N）。亚成蛛采回后单头放入玻璃试管（ 长100 mm，直径25 mm） 中饲养，试管底部用一块蘸水的海绵保湿，管口塞有海绵塞，防止蜘蛛逃逸，置于人工气候箱内（25±0.5）℃，相对湿度RH为60%±10%，光周期为14 L：10 D饲养。每周饲喂2次，每次饲喂4～6头活家蝇Musca domestica成虫，同时给试管底部的海绵添加足量的水以保持湿润。每隔1 d观察记录拟环纹豹蛛蜕皮及成熟情况，成熟两周后的蜘蛛用液氮速冻后置-80 ℃冰箱备用。
1.2 SSR位点的检测
当蜘蛛成熟14 d后，使用TRIzol试剂盒提取蜘蛛的总RNA，经质量检测合格的样品，送北京百迈客生物科技有限公司利用Illumina HiseqTM 2500平台进行转录组测序，测序结果用Trinity软件进行数据组装获得Unigene。利用MISA（MIcroSAtellite identification tool，http：//pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/misa.html）软件对拟环纹豹蛛转录组中的Unigene进行SSR位点检测。检测的重复序列从单碱基重复至六碱基重复，筛选参数：单核苷酸序列重复次数不低于10次，二核苷酸序列重复次数不低于6次，三核苷酸序列、四核苷酸序列、五核苷酸序列和六核苷酸序列重复次数则不低于5次。若2个SSR间距小于100 bp，则组成一个复合SSR位点。
2 结果与分析
2.1 拟环纹豹蛛转录组分布概况
组装后的拟环纹豹蛛转录组数据，共获得67 725条Unigene，筛选长度1 kb以上的13 762条Unigene，利用MISA软件分析发现，SSR重复序列总共有6474个，分布在4411条Unigene上，拟环纹豹蛛转录组Unigene序列平均每4581 bp就出现一个SSR位点。包含1个以上SSR位点数的Unigene数目1347条（表1）。可见，拟环纹豹蛛转录组所包含SSR位点较丰富，且分布较广泛。
2.2 拟环纹豹蛛转录组SSR位点不同重复类型分析
对拟环纹豹蛛转录组搜索的SSR位点进行了核苷酸重复类型分类，共有5种重复类型（表2）。不同重复类型形成的SSR位点数目相差较大，其中单核苷酸重复位点最多，为5025个，占总SSR位点的77.62%，总长度为62 117 bp，平均每477 bp出现1个单核苷酸重复序列，单核苷酸平均长度为12.36 bp;二核苷酸重复SSR位点，为985个，占总SSR位点的15.21%，总长度为13 868 bp，平均每2138 bp出现1个二核苷酸重复序列，二核苷酸平均长度为14.08 bp;三核苷酸重复SSR位点，为421个，占总SSR位点的6.50%，总长度为6918 bp，平均每4287 bp出现1个三核苷酸重复序列，三核苷酸平均长度为16.43 bp;四核苷酸重复SSR位点，为40个，占总SSR位点的0.62%，总长度为824 bp，平均每35 990 bp出现1个四核苷酸重复序列，四核苷酸平均长度为20.60 bp;五核苷酸重复SSR位点最少，为3个，占总SSR位点的0.05%，总长度为90 bp，平均每329 506 bp出现1个五核苷酸重复序列，五核苷酸平均长度为30.00 bp。不同重复类型形成SSR频率差异较大，其中单核苷酸重复类型SSR发生频率最高，每100条Unigene有36.51个SSR位点出现;五核苷酸重复类型SSR发生频率最低，100条Unigene仅有0.02个SSR位点出现（表2）。
2.3 拟环纹豹蛛转录组SSR基元类型分析
在拟环纹豹蛛转录组序列识别的6474个SSR中共发现了53种重复基元，其中单核苷酸重复基元有2种、二核苷酸重复基元有6种、三核苷酸重复基元有27种、四核苷酸重复基元有15种、五核苷酸重复基元有3种。不同基元类型形成SSR位点数目存在差异，从总体来看，随着SSR基元碱基数目的增加，SSR位点数呈下降趋势。其中单核苷酸基元（A/T）发生频率最高为35.02%，其次是（AT/AT）的2.81%、（TA/TA）的2.03%、（C/G）的1.50%、（AC/GT）的0.80%等（表3）。
在单核苷酸重复基元中，（A/T）基元类型占明显优势，共形成4819个SSR位点，占单核苷酸SSR位点的95.90%，总SSR位点的74.44%，属于单碱基的优势重复基元（图1，表3）。在二核苷酸重复基元中（AT/AT）和（TA/TA）基元类型占明显优势。（AT/AT）基元类型共形成387个SSR位点，占二核苷酸SSR位点的39.29%，占总SSR位点的5.98%;其次是（TA/TA）基元类型，共形成280个SSR位点，占二核苷酸SSR位点的28.43%，占总SSR位点的4.32%（图1，表3）。在三核苷酸重复基元中（AAT/ATT）、（TCA/TGA）、（TAA/TTA）基元类型占明显优势。（AAT/ATT）基元类型形成46个SSR位点，占三核苷酸SSR位点的10.93%，占总SSR位点的0.71%;（TCA/TGA）基元类型形成39个SSR位点，占三核苷酸SSR位点的9.26%，占总SSR位点的0.60%;（TAA/TTA）基元类型形成37个SSR位点，占三核苷酸SSR位点的8.79%，占总SSR位点的0.57%（图1，表3）。在四核苷酸重复基元中（TAAA/TTTA）和（AAAT/ATTT）基元类型占明显优势。（TAAA/TTTA）基元类型共形成8个SSR位点，占四核苷酸SSR位点的20.00%，占总SSR位点的0.12%;其次是（AAAT/ATTT）基元类型，共形成7个SSR位点，占四核苷酸SSR位点的17.50%，占总SSR位点的0.11%（图1，表3）。在五核苷酸重复基元中（AACCT/AGGTT）、（TTTTA/TAAAA）、（ATATA/TATAT）基元类型，每一种类型都只形成1个SSR位点，占五核苷酸SSR位点的33.33%，占总SSR位点的0.02%（图1，表3）。 2.4 拟环纹豹蛛转录组SSR重复次数分析
拟环纹豹蛛SSR基元重复次数在不同基元类型间存在差异，不同重复次数所形成的SSR位点差异较大，每种类型构成的SSR位点中，最小重复次数的SSR位点最多，且随着基元碱基数目的增加，重复次数类型呈下降趋势（图2）。单核苷酸重复基元的重复次数类型最多，共有15种重复次数，不同重复次数所形成的SSR位点数量差异较大，最小重复次数为10次，形成2210个SSR位点，占单核苷酸SSR位点的43.98%，最大重复次数为24次，仅形成1个SSR位点，占单核苷酸SSR位点的0.02%。二核苷酸重复基元共有8种重复次数类型，其中最小重复次数为6次（505个，51.26%），最大重复次数为13次（1个，0.10%）。三核苷酸重复基元共有6种重复次数类型，其中最小重复次数为5次（278个，66.03%），最大重复次数为10次（1个，0.24%）。四核苷酸重复基元共有2种重复次数类型，最小重复次数为5次（34个，85%），最大重复次数为6次（位点数：6个，15%）。五核苷酸重復基元的共有3种重复次数类型，其中最小重复次数为5次（1个，33.33%），最大重复次数为7次（1个，33.33%）。
2.5 拟环纹豹蛛转录组SSR长度分析
影响SSR多态性的主要因素是SSR序列的长度，SSR序列长度与其多态性成正比。SSR序列长度<12 bp时，SSR多态性很低;12 bp≤SSR序列长度<20 bp时，SSR多态性良好;SSR序列长度≥20 bp时，SSR多态性较高[27，33]。对拟环纹豹蛛转录组SSR长度进行分析，SSR长度在10～35 bp之间，平均长度为12.95 bp（表2，图3）。其中数量最多的SSR序列长度为12～19 bp，占比为47.28%;其次是长度小于12 bp SSR序列，占比为46.18%;然后是SSR序列长度为20～35 bp，占比为6.53%，总体来看，SSR多态性属于良好（图3）。
3 结论与讨论
本研究基于拟环纹豹蛛转录组数据，共获得67 725条Unigene，筛选长度1 kb以上的13 762条Unigene，利用MISA软件共检测到6474个SSR位点，分布于4411条Unigene上，SSR出现频率为47.04%。拟环纹豹蛛转录组SSR出现频率明显高于荔枝蒂蛀虫Conopomorpha sinensis（15.25%）[34]、印度谷螟Plodia interpunctella（8.52%）[35]、小胸鳖甲M.punctipennis（7.94%）[30]、麦红吸浆虫S.mo-sellana（3.49%）[28]等昆虫。不同物种间SSR位点出现频率的差异，可能是与不同物种基因组特点有关，也可能和测序深度、筛选SSR的软件及检测时选择的参数等因素有关。如，本研究与沟渠豹蛛P.laura（80.11%）[32]的研究相比，研究对象都属于豹蛛属蜘蛛，设定参数也相同，均是对大于1 kb的Unigene进行SSR搜索，但检测到的SSR数量和SSR出现的频率存在明显的差异。
拟环纹豹蛛转录组搜索的SSR位点进行了核苷酸重复类型分类，共有5种重复类型，单核苷酸重复位点为5025个、二核苷酸重复SSR位点为985个、三核苷酸重复SSR位点为421个、四核苷酸重复SSR位点为40个、五核苷酸重复SSR位点为3个。拟环纹豹蛛转录组SSR位点的主导基序类型是单核苷酸重复类型，占总SSR位点的77.62%，高于马铃薯甲虫Leptinotarsa decemlineata（63.23%）[36]、梨网蝽Stephanitis nashi（40.41%）[37]、麦红吸浆虫S.mosellana（37.07%）[28]、小胸鳖甲M.punctipennis（47.17%）[30]等昆虫，与沟渠豹蛛P.laura（72.67%）[32]相差不大，低于窄足真蚋Simulium（Eusimulium）angustipes（87.05%）[38]。拟环纹豹蛛转录组中共发现了53种重复基元，从单核苷酸到五核苷酸重复基元分别有2种、6种、27种、15种和3种，其中单核苷酸（A/T）基元类型占总SSR的74.44%，占明显优势，这与沟渠豹蛛P.laura[32]、马铃薯甲虫L.decemlineata[36]、麦红吸浆虫S.mosellana[28]、小胸鳖甲M.punctipennis[30]等转录组SSR分析研究结果相似。二核苷酸重复基元中，（AT/AT）是优势基元，分别占总SSR的5.98%，这与沟渠豹蛛P.laura[32]分析研究结果相似。但在拟环纹豹蛛转录组SSR中，不含二核苷酸重复基元（GC/CG），这与桔小实蝇B.dorsalis[31]及褐飞虱N.lugens[39]的研究结果相似，（GC/CG）是非常稀有的重复基元，其数量几乎接近零，推测（GC/CG）重复基元在不同物种的基因组中都可能是相当稀有的SSR。三核苷酸重复基元中，（AAT/ATT）基元占优势，与褐飞虱（AAG/CTT）[39]、麦红吸浆虫（AAC/GTT）[28]、小胸鳖甲（CCG/GCC）[30]不同，与沟渠豹蛛[32]相同，（AAT/ATT）基元占优势，可能是由于高滑变率及其作为终止密码子的延伸区引起的[40]。
综上所述，本研究基于拟环纹豹蛛转录组数据筛选得到其SSR位点信息，对不同类型位点的数量、比例、频率与重复次数，以及对不同的重复基元类型的数量和比例等进行了分析，以期为研究拟环纹豹蛛的遗传多样性分析、功能基因的开发利用等方面的研究奠定基础。
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关键词：拟环纹豹蛛;转录组;SSR;重复基元
中图分类号：Q346+.5;Q959.1
文献标识码：A
文章编号：1008-0457（2021）04-0031-07
国际DOI编码：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2021.04.005
Abstract：The wolf spider Pardosa pseudoannulata is an important biological control agent of rice pests and plays an important role in green prevention and control.In this study，based on the transcriptome data of P.pseudoannulata，we used MISA （microsatellite identification tool） to analyze its SSR （simple sequence repeat） loci.The results showed that a total of 6474 SSR loci were detected in the Unigene sequence of the transcriptome data，with an average length of 12.36 bp，distributed on 4411 Unigenes.The Mono-nucleotide repeat type were the dominanttype，its number was 5025，accounting for 77.62% of the total SSR loci.The 6474 SSR lociwere identified 53 repetitive motifs，there were 2，6，27，15 and 3 repetitive motifs from Mono-nucleotide to Hexa-nucleotide.（A/T）was dominant repetitive motif，accounting for 74.44% of the total SSR.The SSR loci of transcriptome in P.pseudoannulata were rich and high polymorphism potential. Our results can be used as an effective source for the development of SSR marker and provide foundation for research of genetic diversity and development functional genes of P.pseudoannulata.
Keywords：Pardosa pseudoannulata;transcriptome;SSR;repeat motif
擬环纹豹蛛Pardosa pseudoannulata属于蛛形纲Arachnida蜘蛛目Araneae狼蛛科Lycosidae豹蛛属Pardosa，在我国分布较广，是稻田生态系统中优势种蜘蛛，尤其在我国南方的广东[1]、湖南[2]、湖北[3]、云南[4]、贵州[5]等地区常年可见。拟环纹豹蛛属于中型蜘蛛，成蛛体长可达到13 mm，雌雄蛛均可多次交配，雌蛛每次平均产卵156粒，孵化的幼蛛群集在雌蛛背面3～7 d后才离开，幼蛛期47～158 d，成蛛期121～236 d，雌蛛较雄蛛长21～62 d[2，6-7]。拟环纹豹蛛是稻田害虫的重要捕食性天敌，其空间生态位宽[6，8]，能够在水面、稻株上、地面上等多种环境捕食褐飞虱Nilaparvata lugens、白背飞虱Sogatella furcifera、稻纵卷叶螟Cnaphalocrocis medinalis、黑尾叶蝉Nephotettix bipunctatus等害虫。在稻田中捕食飞虱和叶蝉，90%是狼蛛科蜘蛛的功劳[9-13]。拟环纹豹蛛的性情凶猛，专捕活虫，即使饱食，也会把猎物咬死后才休止，食量也大，2龄幼蛛每头每天平均捕食黑腹果蝇Drosophila melanogaster 4.36头，成蛛每头每天捕食水蝇Hydrellia sp.可达30头[8，14]，雌成蛛对亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis 2龄幼虫的捕食上限为116头[15]，王智等[16]研究表明低剂量农药对拟环纹豹蛛捕食褐飞虱的能力有增强作用。本课题组前期对拟环纹豹蛛的求偶交配行为[17]、选择行为[18]和温度胁迫[19-20]和SNP位点[21]等方面进行了研究。目前，拟环纹豹蛛转录组SSR位点分析未见报道。 微卫星（microsatellite），又称为简单序列重复（simple sequence repeat，SSR），是指以1～6个核苷酸为重復单元串联组成的重复序列，串联重复10～60次组成的简单重复序，微卫星具有高多态性、共显性、高可重复性、数量丰富等优点[22-23]。因此，微卫星在遗传分析中可以作为一种理想的分子标记，已被广泛应用于生物遗传研究中，在苦荞Fagopyrum tartaricum[24]、密花香薷Elsholtzia densa[25]、密叶红豆杉Taxus fuana[26]、金佛山方竹Chimonobambusa utilis[27]等植物;麦红吸浆虫Sitodiplosis mosellana[28]、蚜虫[29]、小胸鳖甲Microdera punctipennis[30]、桔小实蝇Bactrocera dorsalis[31]、沟渠豹蛛Pardosa laura[32]等动物中进行了报道。本文基于拟环纹豹蛛转录组测序数据，对其SSR特征进行分析，旨在为SSR标记在该物种的遗传多样性分析、功能基因的开发利用等方面提供参考。
1 材料与方法
1.1 供试虫源
拟环纹豹蛛的亚成蛛采集于广州市华南农业大学试验田（113.7°E，23.17°N）。亚成蛛采回后单头放入玻璃试管（ 长100 mm，直径25 mm） 中饲养，试管底部用一块蘸水的海绵保湿，管口塞有海绵塞，防止蜘蛛逃逸，置于人工气候箱内（25±0.5）℃，相对湿度RH为60%±10%，光周期为14 L：10 D饲养。每周饲喂2次，每次饲喂4～6头活家蝇Musca domestica成虫，同时给试管底部的海绵添加足量的水以保持湿润。每隔1 d观察记录拟环纹豹蛛蜕皮及成熟情况，成熟两周后的蜘蛛用液氮速冻后置-80 ℃冰箱备用。
1.2 SSR位点的检测
当蜘蛛成熟14 d后，使用TRIzol试剂盒提取蜘蛛的总RNA，经质量检测合格的样品，送北京百迈客生物科技有限公司利用Illumina HiseqTM 2500平台进行转录组测序，测序结果用Trinity软件进行数据组装获得Unigene。利用MISA（MIcroSAtellite identification tool，http：//pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/misa.html）软件对拟环纹豹蛛转录组中的Unigene进行SSR位点检测。检测的重复序列从单碱基重复至六碱基重复，筛选参数：单核苷酸序列重复次数不低于10次，二核苷酸序列重复次数不低于6次，三核苷酸序列、四核苷酸序列、五核苷酸序列和六核苷酸序列重复次数则不低于5次。若2个SSR间距小于100 bp，则组成一个复合SSR位点。
2 结果与分析
2.1 拟环纹豹蛛转录组分布概况
组装后的拟环纹豹蛛转录组数据，共获得67 725条Unigene，筛选长度1 kb以上的13 762条Unigene，利用MISA软件分析发现，SSR重复序列总共有6474个，分布在4411条Unigene上，拟环纹豹蛛转录组Unigene序列平均每4581 bp就出现一个SSR位点。包含1个以上SSR位点数的Unigene数目1347条（表1）。可见，拟环纹豹蛛转录组所包含SSR位点较丰富，且分布较广泛。
2.2 拟环纹豹蛛转录组SSR位点不同重复类型分析
对拟环纹豹蛛转录组搜索的SSR位点进行了核苷酸重复类型分类，共有5种重复类型（表2）。不同重复类型形成的SSR位点数目相差较大，其中单核苷酸重复位点最多，为5025个，占总SSR位点的77.62%，总长度为62 117 bp，平均每477 bp出现1个单核苷酸重复序列，单核苷酸平均长度为12.36 bp;二核苷酸重复SSR位点，为985个，占总SSR位点的15.21%，总长度为13 868 bp，平均每2138 bp出现1个二核苷酸重复序列，二核苷酸平均长度为14.08 bp;三核苷酸重复SSR位点，为421个，占总SSR位点的6.50%，总长度为6918 bp，平均每4287 bp出现1个三核苷酸重复序列，三核苷酸平均长度为16.43 bp;四核苷酸重复SSR位点，为40个，占总SSR位点的0.62%，总长度为824 bp，平均每35 990 bp出现1个四核苷酸重复序列，四核苷酸平均长度为20.60 bp;五核苷酸重复SSR位点最少，为3个，占总SSR位点的0.05%，总长度为90 bp，平均每329 506 bp出现1个五核苷酸重复序列，五核苷酸平均长度为30.00 bp。不同重复类型形成SSR频率差异较大，其中单核苷酸重复类型SSR发生频率最高，每100条Unigene有36.51个SSR位点出现;五核苷酸重复类型SSR发生频率最低，100条Unigene仅有0.02个SSR位点出现（表2）。
2.3 拟环纹豹蛛转录组SSR基元类型分析
在拟环纹豹蛛转录组序列识别的6474个SSR中共发现了53种重复基元，其中单核苷酸重复基元有2种、二核苷酸重复基元有6种、三核苷酸重复基元有27种、四核苷酸重复基元有15种、五核苷酸重复基元有3种。不同基元类型形成SSR位点数目存在差异，从总体来看，随着SSR基元碱基数目的增加，SSR位点数呈下降趋势。其中单核苷酸基元（A/T）发生频率最高为35.02%，其次是（AT/AT）的2.81%、（TA/TA）的2.03%、（C/G）的1.50%、（AC/GT）的0.80%等（表3）。
在单核苷酸重复基元中，（A/T）基元类型占明显优势，共形成4819个SSR位点，占单核苷酸SSR位点的95.90%，总SSR位点的74.44%，属于单碱基的优势重复基元（图1，表3）。在二核苷酸重复基元中（AT/AT）和（TA/TA）基元类型占明显优势。（AT/AT）基元类型共形成387个SSR位点，占二核苷酸SSR位点的39.29%，占总SSR位点的5.98%;其次是（TA/TA）基元类型，共形成280个SSR位点，占二核苷酸SSR位点的28.43%，占总SSR位点的4.32%（图1，表3）。在三核苷酸重复基元中（AAT/ATT）、（TCA/TGA）、（TAA/TTA）基元类型占明显优势。（AAT/ATT）基元类型形成46个SSR位点，占三核苷酸SSR位点的10.93%，占总SSR位点的0.71%;（TCA/TGA）基元类型形成39个SSR位点，占三核苷酸SSR位点的9.26%，占总SSR位点的0.60%;（TAA/TTA）基元类型形成37个SSR位点，占三核苷酸SSR位点的8.79%，占总SSR位点的0.57%（图1，表3）。在四核苷酸重复基元中（TAAA/TTTA）和（AAAT/ATTT）基元类型占明显优势。（TAAA/TTTA）基元类型共形成8个SSR位点，占四核苷酸SSR位点的20.00%，占总SSR位点的0.12%;其次是（AAAT/ATTT）基元类型，共形成7个SSR位点，占四核苷酸SSR位点的17.50%，占总SSR位点的0.11%（图1，表3）。在五核苷酸重复基元中（AACCT/AGGTT）、（TTTTA/TAAAA）、（ATATA/TATAT）基元类型，每一种类型都只形成1个SSR位点，占五核苷酸SSR位点的33.33%，占总SSR位点的0.02%（图1，表3）。 2.4 拟环纹豹蛛转录组SSR重复次数分析
拟环纹豹蛛SSR基元重复次数在不同基元类型间存在差异，不同重复次数所形成的SSR位点差异较大，每种类型构成的SSR位点中，最小重复次数的SSR位点最多，且随着基元碱基数目的增加，重复次数类型呈下降趋势（图2）。单核苷酸重复基元的重复次数类型最多，共有15种重复次数，不同重复次数所形成的SSR位点数量差异较大，最小重复次数为10次，形成2210个SSR位点，占单核苷酸SSR位点的43.98%，最大重复次数为24次，仅形成1个SSR位点，占单核苷酸SSR位点的0.02%。二核苷酸重复基元共有8种重复次数类型，其中最小重复次数为6次（505个，51.26%），最大重复次数为13次（1个，0.10%）。三核苷酸重复基元共有6种重复次数类型，其中最小重复次数为5次（278个，66.03%），最大重复次数为10次（1个，0.24%）。四核苷酸重复基元共有2种重复次数类型，最小重复次数为5次（34个，85%），最大重复次数为6次（位点数：6个，15%）。五核苷酸重復基元的共有3种重复次数类型，其中最小重复次数为5次（1个，33.33%），最大重复次数为7次（1个，33.33%）。
2.5 拟环纹豹蛛转录组SSR长度分析
影响SSR多态性的主要因素是SSR序列的长度，SSR序列长度与其多态性成正比。SSR序列长度<12 bp时，SSR多态性很低;12 bp≤SSR序列长度<20 bp时，SSR多态性良好;SSR序列长度≥20 bp时，SSR多态性较高[27，33]。对拟环纹豹蛛转录组SSR长度进行分析，SSR长度在10～35 bp之间，平均长度为12.95 bp（表2，图3）。其中数量最多的SSR序列长度为12～19 bp，占比为47.28%;其次是长度小于12 bp SSR序列，占比为46.18%;然后是SSR序列长度为20～35 bp，占比为6.53%，总体来看，SSR多态性属于良好（图3）。
3 结论与讨论
本研究基于拟环纹豹蛛转录组数据，共获得67 725条Unigene，筛选长度1 kb以上的13 762条Unigene，利用MISA软件共检测到6474个SSR位点，分布于4411条Unigene上，SSR出现频率为47.04%。拟环纹豹蛛转录组SSR出现频率明显高于荔枝蒂蛀虫Conopomorpha sinensis（15.25%）[34]、印度谷螟Plodia interpunctella（8.52%）[35]、小胸鳖甲M.punctipennis（7.94%）[30]、麦红吸浆虫S.mo-sellana（3.49%）[28]等昆虫。不同物种间SSR位点出现频率的差异，可能是与不同物种基因组特点有关，也可能和测序深度、筛选SSR的软件及检测时选择的参数等因素有关。如，本研究与沟渠豹蛛P.laura（80.11%）[32]的研究相比，研究对象都属于豹蛛属蜘蛛，设定参数也相同，均是对大于1 kb的Unigene进行SSR搜索，但检测到的SSR数量和SSR出现的频率存在明显的差异。
拟环纹豹蛛转录组搜索的SSR位点进行了核苷酸重复类型分类，共有5种重复类型，单核苷酸重复位点为5025个、二核苷酸重复SSR位点为985个、三核苷酸重复SSR位点为421个、四核苷酸重复SSR位点为40个、五核苷酸重复SSR位点为3个。拟环纹豹蛛转录组SSR位点的主导基序类型是单核苷酸重复类型，占总SSR位点的77.62%，高于马铃薯甲虫Leptinotarsa decemlineata（63.23%）[36]、梨网蝽Stephanitis nashi（40.41%）[37]、麦红吸浆虫S.mosellana（37.07%）[28]、小胸鳖甲M.punctipennis（47.17%）[30]等昆虫，与沟渠豹蛛P.laura（72.67%）[32]相差不大，低于窄足真蚋Simulium（Eusimulium）angustipes（87.05%）[38]。拟环纹豹蛛转录组中共发现了53种重复基元，从单核苷酸到五核苷酸重复基元分别有2种、6种、27种、15种和3种，其中单核苷酸（A/T）基元类型占总SSR的74.44%，占明显优势，这与沟渠豹蛛P.laura[32]、马铃薯甲虫L.decemlineata[36]、麦红吸浆虫S.mosellana[28]、小胸鳖甲M.punctipennis[30]等转录组SSR分析研究结果相似。二核苷酸重复基元中，（AT/AT）是优势基元，分别占总SSR的5.98%，这与沟渠豹蛛P.laura[32]分析研究结果相似。但在拟环纹豹蛛转录组SSR中，不含二核苷酸重复基元（GC/CG），这与桔小实蝇B.dorsalis[31]及褐飞虱N.lugens[39]的研究结果相似，（GC/CG）是非常稀有的重复基元，其数量几乎接近零，推测（GC/CG）重复基元在不同物种的基因组中都可能是相当稀有的SSR。三核苷酸重复基元中，（AAT/ATT）基元占优势，与褐飞虱（AAG/CTT）[39]、麦红吸浆虫（AAC/GTT）[28]、小胸鳖甲（CCG/GCC）[30]不同，与沟渠豹蛛[32]相同，（AAT/ATT）基元占优势，可能是由于高滑变率及其作为终止密码子的延伸区引起的[40]。
综上所述，本研究基于拟环纹豹蛛转录组数据筛选得到其SSR位点信息，对不同类型位点的数量、比例、频率与重复次数，以及对不同的重复基元类型的数量和比例等进行了分析，以期为研究拟环纹豹蛛的遗传多样性分析、功能基因的开发利用等方面的研究奠定基础。
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