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作者筒介：郑澜(1967－)，女，湖南长沙人，副教授，博士，研究方向低氧运动的适应机制。
摘 要：为了研究低氧、训练及低氧训练对骨骼肌组织血管生成的不同作用，采用3x 3析因设计试验，将健康雄性sD大鼠72只，随机分为9组，采用免疫组织化学及生物体视学方法，检测骨骼肌组织中微血管密度参数的改变，分析低氧和运动训练两种不同的处理因素对骨骼肌组织微血管体积密度、表面积密度、长度密度的单独效应、主效应及交互作用。结果表明：CD34可较好显示骨骼肌组织的微血管。低氧处理及运动训练对骨骼肌组织微血管体积密度、表面积密度、长度密度的主效应有差别，低氧处理、运动训练的单独效应中以超低氧处理、低氧训练的效应最强，并且低氧处理与训练方式两因素之间具有协同交互作用。
关键词：低氧训练；骨骼肌组织；血管生成；体视学；析因设计试验
中图分类号：G804．23
文献标识码：A
文章编号：1007—3612(2006)02—0198—04
低氧训练是在运动训练周期中持续或间断采用低氧条件刺激，利用人工模拟或高原自然低氧环境对人体所产生的特殊生物学效应，配合运动训练来增加机体的缺氧程度，以调动体内的机能潜力，从而产生一系列有利于提高运动能力的抗缺氧生理反应及适应。本研究针对低氧和运动训练两种不同的处理因素，采用3x3析因设计试验，研究不同低氧、训练及低氧训练对骨骼肌组织微血管密度参数的影响，来了解低氧训练对骨骼肌组织血管生成的影响，为低氧训练在训练实践中的应用提供参考。
1 材料与方法
1．1 实验对象及分组 健康雄性2．0月龄Sprague－Dawley大鼠72只，体重约200g(由中南大学湘雅医学院动物学部提供)。用国家标准啮齿类动物饲料饲养，生活期间室温保持20-23％，相对湿度45％～—55％，每天光照12 h。适应性喂养1周后，随机分为9组，每组8只(分组情况见表1)。
1．2 运动训练安排 采用杭州立泰科技有限公司PT动物实验跑台，进行递增负荷跑台运动训练，每周训练6天，共持续8周，具体训练方案见文献[1]。
1．3 低氧处理 采用美国Uypoxico公司的低氧装置，用美国产TOXIRAE PGM—36型氧气监测仪实时监测低氧舱 逐周递增，具体低氧处理方案见文献[1]。1t4 实验取材 训练方案结束后，每组随机取4只大鼠，用0．4％戊巴比妥钠1 mL／100s体重麻醉后，将大鼠呈仰卧位固定于手术台上，暴滤胸腔；从主动脉胸部近心端插入细塑料管，扎紧固定，缓慢注入1％肝素2 mL；然后快速滴灌500 mL0．85％的生理盐水，迅速剪断后腔静脉；待生理盐水滴完后，换滴500mL4％多聚甲醛缓冲盐溶液(0．01 m、pH7．4PBS)，快速滴完，整个滴灌时间约30man；取腓肠肌中部置同一固定液中固定，固定24h后，常规脱水、透明、进蜡、石蜡包埋，用于免疫组织化学标本制作。
1．5 骨骼肌组织CD34免疫组织化学标本制作 石蜡切片脱蜡至蒸馏水；用0．3％H202阻断内源性过氧化物酶，用0．3％TritonX－100处理增加标本通透性，用0．01mol、pH6．0的柠檬酸缓冲液微波修复抗原；羊血清(1：50)处理标本，减少和消除非特异性染色；分别加一抗(1：500)(兔源CD34单克隆抗体购自德国Zymed公司)、二抗(1：200)、ABC复合物(1：1：100)，37℃恒温箱于湿盒内孵育；用终浓度为0．05％DAB—O．03％1lO：的TB显色；镜下控制显色时间，显色时间5—15 min；苏木精衬染，常规脱水、透明，中性树胶封片。用PBS代替一抗作为空白对照。
1．6 微血管密度参数的测算方法 采用100目方网测试系统，方网内每一小格的边长为1 mm，测试点数为100个，测试线长为200 lnln。每张切片在中央区及周边区随机选取5个视野，进行点计数、交点计数和横穿点计。计数过程采用Sig－mascall4．O软件完成。
点计数：方网测试系统中测试点落在血管腔内或内皮细胞上的数量(落在血管或内皮细胞边缘仍计数在内)；交点计数：方网测试系统中测试线与血管或内皮细胞界面相交的交点数；横穿点计数：任何一个棕色的内皮细胞或细胞丛作为一个横穿点计数，只要结构不相连，其分支结构也作为一个横穿点数计数[2]。
1．6．1 微血管体积密度的计算方法 体积密度是指单位参照体积中x相所占的体积。
Pn和Pcl分别代表测试点落在第i幅图像X相和所定参照系上的点数，表示图像数。
1．6．2 微血管表面积密度计算方法 表面积密度是指单位参照体积中J相所占的表面积。
M为放大倍数，pT、LT，分别为所用测试系统的测试点数和测试线长度，IX为测试线与{相界面的交点，Pc为包容空间的测试点数，n表示图像数。
1．6．3 微血管长度密度计算方法 长度密度是指单位参照体积中某线性结构所占的长度。
为放大倍数，Qx；为第幅图像上Pci相的横穿点计数，Pci为落在第i幅图像参照系内的测试点数，a为每个测试点所代表的面积，n表示图像数。
1．7 统计分析 所得数据用SPSSll．0统计软件处理。p≤0．05为差别具有显著性，P≤0．01为差别具有非常显著性。
采用完全随机设计3x 3析因试验方差分析分析处理因素的单独效应、主效应及交互效应。
单独效应：其他因素的水平固定时，同一因素不同水平间的差别；主效应：某一因素各水平间的平均差别；交互效应：当某因素的各个单独效应随另一因素水平的变化而变化，且相互间的差别超出随机波动范围时，则称因素间存在交互作用[3]。
当因素之间具有交互效应时，采用Duncan多重极差检验法进行各组均数间的多重比较[4]。
2 实验结果
2．1 大鼠骨骼肌组织CD34免疫组织化学观察结果 骨骼肌组织血管经CD34免疫组织化学染色呈棕黄色，着色鲜明，血管管腔明显。微血管腔多为类圆形，部分血管无明显管腔，呈条索状(图1A)。各组大鼠经不同程度的低氧处理和不同方式的运动训练后，血管的密度显示不同的变化，2组、3组与1组相比骨骼肌组织中微血管无明显变化(图1D)，4组、5组、6组与1组相比骨骼肌组织中微血管稍有增多(图1C)，7组、8组、9组与1组相比骨骼肌组织中微血管增加明显(图1D)。
2．2 大鼠骨骼肌组织微血管体视学分析结果 大鼠骨骼肌组织微血管体积密度、表面积密度、长度密度的Duncan多重极差检验结果(表2)。
2．3 骨髂肌组织微血管密度参数析因试验结果的方差分析
当训练方式固定在不训练水平时，低氧与超低氧处理对骨骼肌组织体积密度、表面积密度、长度密度的单独效应分别为0．80％、1．58％；0．05 mm[-1]、0．23 mm[-1]；-0．45 mm[-2]、1．93mm[-2]。当训练方式固定在常氧训练水平时，低氧与超低氧处理的单独效应分别为0．91％、1．40％；0．08 mm[-1]、0．43 mm[-1]；1．03 mm[-2]、13．27 mm[-2]。当训练方式固定在低氧训练水平时，低氧与超低氧处理的单独效应分别为0．97％、3，88％；0．94mm[-1]、1．62mm[-1]；6．96mm[-1]、10．36mm[-2](表3)。
3分析与讨论
对低氧影响骨骼肌毛细血管的研究认为，骨骼肌毛细血管不会对单纯的低氧发生反应mm[5]。低氧中毛细血管密度的增加是因为肌纤维横断面减少，而不是由于血管新生mm[6，7]。这种结构的改变虽然也可缩短氧从毛细血管弥散到肌纤维的距离，使毛细血管的供氧能力得以改善mm[5，6]，但却由于肌纤维的萎缩不利于肌肉活动能力的增强。而耐力训练可使骨骼肌代谢能力增加的同时，产生血管生成反应mm[8-10]，并且运动训练中借助低氧环境来加强机体的缺氧应激，可加强骨骼肌血管的适应性变化mm[11-13]。表现为肌纤维横断面积增加的同时，增加了毛细血管与肌纤维的比率mm[14-16]和毛细血管密度mm[9，17，18]，其中低氧复合高强度训练是骨骼肌组织毛细血管增加的有效刺激mm[19]。但另有观点认为，常氧训练不能显著增加骨骼肌毛细血管，低氧下以相同的绝对负荷训练，也没有观察到毛细血管的显著增加mm[20]。低氧运动可使毛细血管与肌纤维比率、毛细血管密度有增高的趋势，但毛细血管的改变不具有统计学意义mm[18]。
在本文的研究中，采用CD34抗体标记骨骼肌组织微血管，CD34是造血干细胞抗原，后证实可在正常及新生的血管内皮细胞中表达，是血管内皮的特异性标记物，成为血管生成研究的一种可靠的标记物质mm[21]，观察到肌组织微血管呈棕黄色，管腔清晰，微血管和内皮细胞匀有明显的着色。并采用生物体视学原理，即通过定量分析组织切片图象与组织结构的关系，用几何学、概率论、数理统计、微积分、曲线、曲面理论和拓扑学等数学方法揭示这种关系以实现对三维结构的定量分析，在准确建立二维形态结构与三维结构之间关系的基础上，从组织二维结构定量认识其三维结构，研究了不同低氧及运动状态下骨骼肌血管生成情况。结果表明，随着常氧训练到低氧训练以及由低氧到超低氧，骨骼肌组织微血管密度呈增加的趋势。不论低氧程度如何，训练期间每天3h的低氧处理不能使骨骼肌组织微血管密度发生变化，并且，常氧训练及训练后进行3h的低氧处理，未见微血管密度的改变，而常氧训练后进行3h的超低氧处理与常氧训练及常氧训练后低氧3h相比，微血管的长度密度增加。低氧训练与常氧训练相比，微血管密度增加，以低氧训练后进行超低氧处理增加最为明显。低氧处理、运动训练对骨骼肌微血管密度的单独效应有差别，低氧处理中以超低氧处理的效应最大，运动训练处理因素中以低氧训练的效应最大，并且，低氧处理、运动训练的主效应有差别，表明运动训练中是否应用低氧条件刺激，以及在运动中或运动后进行低氧处理对微血管的影响有差别。并且，低氧处理与训练方式两因素之间具有协同交互作用，提示在训练中应用低氧刺激，能使运动所致的机体缺氧与低氧环境所致的缺氧叠加起来，增加机体低氧程度，而运动后即刻采用低氧刺激，可延长机体处于低氧状态的时间，使骨骼肌微血管产生更大的低氧应激，其结果骨骼肌微血管密度增加。
低氧及运动使骨骼肌组织中微血管密度增加，将有利于运动中骨骼肌组织对氧、营养物质的摄取，及代谢产物的排出，表明在运动训练中或训练后施以低氧条件刺激，可作为一种辅助训练手段，来增强耐缺氧能力，从而提高机体的运动能力。
4 结 论
1)CD34免疫组织化学染色可使大鼠骨骼肌组织微血管呈棕黄色着色，血管管腔明显，能较好显示骨骼肌组织的微血管。2)低氧处理、运动训练对骨骼肌组织微血管密度的单独效应中以超低氧处理、低氧训练的效应最强，低氧处理及运动训练的主效应有差别，表明运动训练中是否应用低氧条件刺激，以及在运动中或运动后进行低氧处理对微血管的影响有差别。3)低氧处理与训练方式两因素之间具有协同交互作用，提示在训练中、训练后应用低氧刺激，能使运动所致的机体缺氧与低氧环境所致的缺氧叠加起来，或延长机体处于低氧状态的时间，使骨骼肌微血管产生更大的低氧适应。
摘 要：为了研究低氧、训练及低氧训练对骨骼肌组织血管生成的不同作用，采用3x 3析因设计试验，将健康雄性sD大鼠72只，随机分为9组，采用免疫组织化学及生物体视学方法，检测骨骼肌组织中微血管密度参数的改变，分析低氧和运动训练两种不同的处理因素对骨骼肌组织微血管体积密度、表面积密度、长度密度的单独效应、主效应及交互作用。结果表明：CD34可较好显示骨骼肌组织的微血管。低氧处理及运动训练对骨骼肌组织微血管体积密度、表面积密度、长度密度的主效应有差别，低氧处理、运动训练的单独效应中以超低氧处理、低氧训练的效应最强，并且低氧处理与训练方式两因素之间具有协同交互作用。
关键词：低氧训练；骨骼肌组织；血管生成；体视学；析因设计试验
中图分类号：G804．23
文献标识码：A
文章编号：1007—3612(2006)02—0198—04
低氧训练是在运动训练周期中持续或间断采用低氧条件刺激，利用人工模拟或高原自然低氧环境对人体所产生的特殊生物学效应，配合运动训练来增加机体的缺氧程度，以调动体内的机能潜力，从而产生一系列有利于提高运动能力的抗缺氧生理反应及适应。本研究针对低氧和运动训练两种不同的处理因素，采用3x3析因设计试验，研究不同低氧、训练及低氧训练对骨骼肌组织微血管密度参数的影响，来了解低氧训练对骨骼肌组织血管生成的影响，为低氧训练在训练实践中的应用提供参考。
1 材料与方法
1．1 实验对象及分组 健康雄性2．0月龄Sprague－Dawley大鼠72只，体重约200g(由中南大学湘雅医学院动物学部提供)。用国家标准啮齿类动物饲料饲养，生活期间室温保持20-23％，相对湿度45％～—55％，每天光照12 h。适应性喂养1周后，随机分为9组，每组8只(分组情况见表1)。
1．2 运动训练安排 采用杭州立泰科技有限公司PT动物实验跑台，进行递增负荷跑台运动训练，每周训练6天，共持续8周，具体训练方案见文献[1]。
1．3 低氧处理 采用美国Uypoxico公司的低氧装置，用美国产TOXIRAE PGM—36型氧气监测仪实时监测低氧舱 逐周递增，具体低氧处理方案见文献[1]。1t4 实验取材 训练方案结束后，每组随机取4只大鼠，用0．4％戊巴比妥钠1 mL／100s体重麻醉后，将大鼠呈仰卧位固定于手术台上，暴滤胸腔；从主动脉胸部近心端插入细塑料管，扎紧固定，缓慢注入1％肝素2 mL；然后快速滴灌500 mL0．85％的生理盐水，迅速剪断后腔静脉；待生理盐水滴完后，换滴500mL4％多聚甲醛缓冲盐溶液(0．01 m、pH7．4PBS)，快速滴完，整个滴灌时间约30man；取腓肠肌中部置同一固定液中固定，固定24h后，常规脱水、透明、进蜡、石蜡包埋，用于免疫组织化学标本制作。
1．5 骨骼肌组织CD34免疫组织化学标本制作 石蜡切片脱蜡至蒸馏水；用0．3％H202阻断内源性过氧化物酶，用0．3％TritonX－100处理增加标本通透性，用0．01mol、pH6．0的柠檬酸缓冲液微波修复抗原；羊血清(1：50)处理标本，减少和消除非特异性染色；分别加一抗(1：500)(兔源CD34单克隆抗体购自德国Zymed公司)、二抗(1：200)、ABC复合物(1：1：100)，37℃恒温箱于湿盒内孵育；用终浓度为0．05％DAB—O．03％1lO：的TB显色；镜下控制显色时间，显色时间5—15 min；苏木精衬染，常规脱水、透明，中性树胶封片。用PBS代替一抗作为空白对照。
1．6 微血管密度参数的测算方法 采用100目方网测试系统，方网内每一小格的边长为1 mm，测试点数为100个，测试线长为200 lnln。每张切片在中央区及周边区随机选取5个视野，进行点计数、交点计数和横穿点计。计数过程采用Sig－mascall4．O软件完成。
点计数：方网测试系统中测试点落在血管腔内或内皮细胞上的数量(落在血管或内皮细胞边缘仍计数在内)；交点计数：方网测试系统中测试线与血管或内皮细胞界面相交的交点数；横穿点计数：任何一个棕色的内皮细胞或细胞丛作为一个横穿点计数，只要结构不相连，其分支结构也作为一个横穿点数计数[2]。
1．6．1 微血管体积密度的计算方法 体积密度是指单位参照体积中x相所占的体积。
Pn和Pcl分别代表测试点落在第i幅图像X相和所定参照系上的点数，表示图像数。
1．6．2 微血管表面积密度计算方法 表面积密度是指单位参照体积中J相所占的表面积。
M为放大倍数，pT、LT，分别为所用测试系统的测试点数和测试线长度，IX为测试线与{相界面的交点，Pc为包容空间的测试点数，n表示图像数。
1．6．3 微血管长度密度计算方法 长度密度是指单位参照体积中某线性结构所占的长度。
为放大倍数，Qx；为第幅图像上Pci相的横穿点计数，Pci为落在第i幅图像参照系内的测试点数，a为每个测试点所代表的面积，n表示图像数。
1．7 统计分析 所得数据用SPSSll．0统计软件处理。p≤0．05为差别具有显著性，P≤0．01为差别具有非常显著性。
采用完全随机设计3x 3析因试验方差分析分析处理因素的单独效应、主效应及交互效应。
单独效应：其他因素的水平固定时，同一因素不同水平间的差别；主效应：某一因素各水平间的平均差别；交互效应：当某因素的各个单独效应随另一因素水平的变化而变化，且相互间的差别超出随机波动范围时，则称因素间存在交互作用[3]。
当因素之间具有交互效应时，采用Duncan多重极差检验法进行各组均数间的多重比较[4]。
2 实验结果
2．1 大鼠骨骼肌组织CD34免疫组织化学观察结果 骨骼肌组织血管经CD34免疫组织化学染色呈棕黄色，着色鲜明，血管管腔明显。微血管腔多为类圆形，部分血管无明显管腔，呈条索状(图1A)。各组大鼠经不同程度的低氧处理和不同方式的运动训练后，血管的密度显示不同的变化，2组、3组与1组相比骨骼肌组织中微血管无明显变化(图1D)，4组、5组、6组与1组相比骨骼肌组织中微血管稍有增多(图1C)，7组、8组、9组与1组相比骨骼肌组织中微血管增加明显(图1D)。
2．2 大鼠骨骼肌组织微血管体视学分析结果 大鼠骨骼肌组织微血管体积密度、表面积密度、长度密度的Duncan多重极差检验结果(表2)。
2．3 骨髂肌组织微血管密度参数析因试验结果的方差分析
当训练方式固定在不训练水平时，低氧与超低氧处理对骨骼肌组织体积密度、表面积密度、长度密度的单独效应分别为0．80％、1．58％；0．05 mm[-1]、0．23 mm[-1]；-0．45 mm[-2]、1．93mm[-2]。当训练方式固定在常氧训练水平时，低氧与超低氧处理的单独效应分别为0．91％、1．40％；0．08 mm[-1]、0．43 mm[-1]；1．03 mm[-2]、13．27 mm[-2]。当训练方式固定在低氧训练水平时，低氧与超低氧处理的单独效应分别为0．97％、3，88％；0．94mm[-1]、1．62mm[-1]；6．96mm[-1]、10．36mm[-2](表3)。
3分析与讨论
对低氧影响骨骼肌毛细血管的研究认为，骨骼肌毛细血管不会对单纯的低氧发生反应mm[5]。低氧中毛细血管密度的增加是因为肌纤维横断面减少，而不是由于血管新生mm[6，7]。这种结构的改变虽然也可缩短氧从毛细血管弥散到肌纤维的距离，使毛细血管的供氧能力得以改善mm[5，6]，但却由于肌纤维的萎缩不利于肌肉活动能力的增强。而耐力训练可使骨骼肌代谢能力增加的同时，产生血管生成反应mm[8-10]，并且运动训练中借助低氧环境来加强机体的缺氧应激，可加强骨骼肌血管的适应性变化mm[11-13]。表现为肌纤维横断面积增加的同时，增加了毛细血管与肌纤维的比率mm[14-16]和毛细血管密度mm[9，17，18]，其中低氧复合高强度训练是骨骼肌组织毛细血管增加的有效刺激mm[19]。但另有观点认为，常氧训练不能显著增加骨骼肌毛细血管，低氧下以相同的绝对负荷训练，也没有观察到毛细血管的显著增加mm[20]。低氧运动可使毛细血管与肌纤维比率、毛细血管密度有增高的趋势，但毛细血管的改变不具有统计学意义mm[18]。
在本文的研究中，采用CD34抗体标记骨骼肌组织微血管，CD34是造血干细胞抗原，后证实可在正常及新生的血管内皮细胞中表达，是血管内皮的特异性标记物，成为血管生成研究的一种可靠的标记物质mm[21]，观察到肌组织微血管呈棕黄色，管腔清晰，微血管和内皮细胞匀有明显的着色。并采用生物体视学原理，即通过定量分析组织切片图象与组织结构的关系，用几何学、概率论、数理统计、微积分、曲线、曲面理论和拓扑学等数学方法揭示这种关系以实现对三维结构的定量分析，在准确建立二维形态结构与三维结构之间关系的基础上，从组织二维结构定量认识其三维结构，研究了不同低氧及运动状态下骨骼肌血管生成情况。结果表明，随着常氧训练到低氧训练以及由低氧到超低氧，骨骼肌组织微血管密度呈增加的趋势。不论低氧程度如何，训练期间每天3h的低氧处理不能使骨骼肌组织微血管密度发生变化，并且，常氧训练及训练后进行3h的低氧处理，未见微血管密度的改变，而常氧训练后进行3h的超低氧处理与常氧训练及常氧训练后低氧3h相比，微血管的长度密度增加。低氧训练与常氧训练相比，微血管密度增加，以低氧训练后进行超低氧处理增加最为明显。低氧处理、运动训练对骨骼肌微血管密度的单独效应有差别，低氧处理中以超低氧处理的效应最大，运动训练处理因素中以低氧训练的效应最大，并且，低氧处理、运动训练的主效应有差别，表明运动训练中是否应用低氧条件刺激，以及在运动中或运动后进行低氧处理对微血管的影响有差别。并且，低氧处理与训练方式两因素之间具有协同交互作用，提示在训练中应用低氧刺激，能使运动所致的机体缺氧与低氧环境所致的缺氧叠加起来，增加机体低氧程度，而运动后即刻采用低氧刺激，可延长机体处于低氧状态的时间，使骨骼肌微血管产生更大的低氧应激，其结果骨骼肌微血管密度增加。
低氧及运动使骨骼肌组织中微血管密度增加，将有利于运动中骨骼肌组织对氧、营养物质的摄取，及代谢产物的排出，表明在运动训练中或训练后施以低氧条件刺激，可作为一种辅助训练手段，来增强耐缺氧能力，从而提高机体的运动能力。
4 结 论
1)CD34免疫组织化学染色可使大鼠骨骼肌组织微血管呈棕黄色着色，血管管腔明显，能较好显示骨骼肌组织的微血管。2)低氧处理、运动训练对骨骼肌组织微血管密度的单独效应中以超低氧处理、低氧训练的效应最强，低氧处理及运动训练的主效应有差别，表明运动训练中是否应用低氧条件刺激，以及在运动中或运动后进行低氧处理对微血管的影响有差别。3)低氧处理与训练方式两因素之间具有协同交互作用，提示在训练中、训练后应用低氧刺激，能使运动所致的机体缺氧与低氧环境所致的缺氧叠加起来，或延长机体处于低氧状态的时间，使骨骼肌微血管产生更大的低氧适应。