论文部分内容阅读
【摘要】目的探讨人粪便中分泌型卷曲相关蛋白2(SFRP2)基因甲基化分析用于结直肠癌(CRC)早期诊断的可行性。方法从30例结直肠癌人及30例正常对照者的粪便中分别提取DNA,采用甲基化特异性PCR(MSP)技术分析其SFRP2基因甲基化状态。结合临床病理对照，用统计学方法计算该检测的敏感度，特异性。确证粪便SFRP2基因甲基化分析可望成为CRC早期无创诊断或CRC高风险人群筛查的新途径。
以往结直肠癌早期检测的方法多为组织化学染色和利用组织为标本的PCR检测，标本均为活检组织，在预警检测中存在标本来源困难的情况。粪便检测可以克服这种不足。由于结直肠癌组织持续脱落细胞到粪便中，因此检测粪便中特定基因的甲基化状态有可能成为一条结直肠癌无创诊断的新途径。
近年研究发现，DNA甲基化改变与肿瘤发展关系密切。自2004年以来，相继有一些研究报道：粪便ＤＮＡ甲基化检测有可能是筛查结直肠癌的有效方法；分泌型卷曲相关蛋白2（SFRP2）基因是一个肿瘤抑制基因，在大多数结直肠癌中表现出过甲基化。本文重点研究人粪便中分泌型卷曲相关蛋白2（SFRP2）基因甲基化分析用于结直肠癌(CRC)早期诊断的可行性。协同隐血试验阳性率与结直肠癌病理诊断的比较，得出粪便DNA的甲基化分析在结直肠癌早期诊断中的意义。
1研究对象与方法
1.1分组研究 ：
1.1.1已确诊结直肠癌症人30例作为实验组，病人来源于我院和其它三甲医院，男20名，女10名，年龄32-71岁，均经肠镜病理证实，分别在手术和治疗前留取粪便做SFRP2基因甲基化检测，粪便隐血试验。
1.1.2正常对照组30例，来源于健康体检合格人群，年龄在21-40岁之间，留取粪便做SFRP2基因甲基化检测，粪便隐血试验。
1.2标本留取：所留标本均为手术和治疗前自然排出粪便，留取约1ｇ粪便于2ｍl刻度离心管中，2小时内放入-80°冰箱冰冻保存，以备DNA提取用，冷冻标本DNA提取在标本收集后4个月完成。
1.3试剂盒DNA提取、甲基化分析：
上海生工生物技术公司 杰美基因
便隐血试验：北京万华普曼生物工程公司检测试剂盒
1.4试验方法
1.4.1DNA提取：使用杰美基因试剂盒按说明书操作。
1.4.2基因组DNA二硫化修饰。
1.4.3SFRP2基因甲基化检测应用上海生工生物技术公司合成的试剂盒进行基因检测
1.4.4胶体金法大便隐血试验：应用北京万华普曼生物工程公司检测试剂盒
1.4.5统计学分析：
2结果
所有粪便DNA标本均成功实现β肌动蛋白基因的扩增，SFRP2基因甲基化检测和便隐血实验结果如下表1.
甲基化特异性PCR(MS-PCR)检测30位确诊病人的甲基化情况，其中28位甲基化阳性，2位甲基化阴性，正常对照组30人其中一位甲基化实验呈阳性，该实验甲基化阳性率为93.3％，特异性为90％，病例组与正常对照组结果呈极显著性差异P＜0.01。便隐血试验检出阳性率为76％，特异性为80％，低于甲基化实验。病例组与正常对照组结果呈显著性差异P＜0.05。 经统计学计算病人甲基化情况与临床病理诊断符合率较好，与临床病理特征如性别、年龄、肿瘤部位、淋巴结转移、临床分期均无相关性。P值分别为P=0.62、P=0.99、P=0.34、P=0.17、P=0.15，高于显著性水准P＞0.05.
3讨论
3.1过去认为结直肠癌发生是APC、kras、p53等基因突变累积使得正常结直肠上皮通过腺瘤演变为腺癌的结果。近来研究表明DNA的甲基化，不同于经典的基因突变，也是肿瘤发生的一种机制。大多数结直肠癌中DNA的甲基化和一些经典的p53、kras等基因突变同时存在。而且许多基因如SFRP2、P14、P16、HmLH1等的启动子在结直肠癌中处于甲基化状态。尤其以SFRP2基因甲基化阳性率最高，相关性最好。因此本研究目的在于探讨SFRP2基因甲基化状态改变用于结直肠癌(CRC)早期诊断的可行性。
3.2实验表明结直肠癌病人粪便中DNA确实存在着SFRP2基因甲基化，且甲基化阳性率达93.3％，与有关报道相符，结直肠癌(CRC)病人与正常人甲基化情况存在着极显著性差异P＜0.01，与疾病相关性好，特异性达90％，高于国内相关报道，检测敏感度、特异性均比以往筛查指标便隐血实验理想，且取材方便易于接受。
3.3以往研究资料曾有报道，结直肠癌前病变（结直肠息肉）SFRP2基因也发生甲基化改变，且阳性率最高可达79.4％，癌前病变（结直肠息肉）与正常人甲基化情况存在着显著性差异，与结直肠癌无显著性差异，由此可见SFRP2基因甲基化参与了肿瘤的发生机制，是早期事件之一，可用于结直肠癌早期筛查和预警，优于其它指标。
3.4肠粘膜细胞甲基化是DNA的表观遗传修饰，与肿瘤发病密切相关。分泌型卷曲相关蛋白2（SFRP2）基因是一個肿瘤抑制基因，DNA甲基化能关闭某些基因的活性，是后天基因沉默的一种主要决定性因素。该基因甲基化是可逆的，可用抗甲基化药物降低和逆转甲基化作用，这也为肿瘤的治疗提供了一个新的途径。
3.5该方法为无创性诊断，简便易行，SFRP2基因有可能作为肿瘤筛查标志物特定基因，用于高危人群的监测、筛查与诊断，必将带来很好的应用前景。
结论：粪便DNA甲基化检测可作为筛查结直肠癌的无创有效方法；用于健康筛查和高危人群的监测与诊断。
注：本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文
以往结直肠癌早期检测的方法多为组织化学染色和利用组织为标本的PCR检测，标本均为活检组织，在预警检测中存在标本来源困难的情况。粪便检测可以克服这种不足。由于结直肠癌组织持续脱落细胞到粪便中，因此检测粪便中特定基因的甲基化状态有可能成为一条结直肠癌无创诊断的新途径。
近年研究发现，DNA甲基化改变与肿瘤发展关系密切。自2004年以来，相继有一些研究报道：粪便ＤＮＡ甲基化检测有可能是筛查结直肠癌的有效方法；分泌型卷曲相关蛋白2（SFRP2）基因是一个肿瘤抑制基因，在大多数结直肠癌中表现出过甲基化。本文重点研究人粪便中分泌型卷曲相关蛋白2（SFRP2）基因甲基化分析用于结直肠癌(CRC)早期诊断的可行性。协同隐血试验阳性率与结直肠癌病理诊断的比较，得出粪便DNA的甲基化分析在结直肠癌早期诊断中的意义。
1研究对象与方法
1.1分组研究 ：
1.1.1已确诊结直肠癌症人30例作为实验组，病人来源于我院和其它三甲医院，男20名，女10名，年龄32-71岁，均经肠镜病理证实，分别在手术和治疗前留取粪便做SFRP2基因甲基化检测，粪便隐血试验。
1.1.2正常对照组30例，来源于健康体检合格人群，年龄在21-40岁之间，留取粪便做SFRP2基因甲基化检测，粪便隐血试验。
1.2标本留取：所留标本均为手术和治疗前自然排出粪便，留取约1ｇ粪便于2ｍl刻度离心管中，2小时内放入-80°冰箱冰冻保存，以备DNA提取用，冷冻标本DNA提取在标本收集后4个月完成。
1.3试剂盒DNA提取、甲基化分析：
上海生工生物技术公司 杰美基因
便隐血试验：北京万华普曼生物工程公司检测试剂盒
1.4试验方法
1.4.1DNA提取：使用杰美基因试剂盒按说明书操作。
1.4.2基因组DNA二硫化修饰。
1.4.3SFRP2基因甲基化检测应用上海生工生物技术公司合成的试剂盒进行基因检测
1.4.4胶体金法大便隐血试验：应用北京万华普曼生物工程公司检测试剂盒
1.4.5统计学分析：
2结果
所有粪便DNA标本均成功实现β肌动蛋白基因的扩增，SFRP2基因甲基化检测和便隐血实验结果如下表1.
甲基化特异性PCR(MS-PCR)检测30位确诊病人的甲基化情况，其中28位甲基化阳性，2位甲基化阴性，正常对照组30人其中一位甲基化实验呈阳性，该实验甲基化阳性率为93.3％，特异性为90％，病例组与正常对照组结果呈极显著性差异P＜0.01。便隐血试验检出阳性率为76％，特异性为80％，低于甲基化实验。病例组与正常对照组结果呈显著性差异P＜0.05。 经统计学计算病人甲基化情况与临床病理诊断符合率较好，与临床病理特征如性别、年龄、肿瘤部位、淋巴结转移、临床分期均无相关性。P值分别为P=0.62、P=0.99、P=0.34、P=0.17、P=0.15，高于显著性水准P＞0.05.
3讨论
3.1过去认为结直肠癌发生是APC、kras、p53等基因突变累积使得正常结直肠上皮通过腺瘤演变为腺癌的结果。近来研究表明DNA的甲基化，不同于经典的基因突变，也是肿瘤发生的一种机制。大多数结直肠癌中DNA的甲基化和一些经典的p53、kras等基因突变同时存在。而且许多基因如SFRP2、P14、P16、HmLH1等的启动子在结直肠癌中处于甲基化状态。尤其以SFRP2基因甲基化阳性率最高，相关性最好。因此本研究目的在于探讨SFRP2基因甲基化状态改变用于结直肠癌(CRC)早期诊断的可行性。
3.2实验表明结直肠癌病人粪便中DNA确实存在着SFRP2基因甲基化，且甲基化阳性率达93.3％，与有关报道相符，结直肠癌(CRC)病人与正常人甲基化情况存在着极显著性差异P＜0.01，与疾病相关性好，特异性达90％，高于国内相关报道，检测敏感度、特异性均比以往筛查指标便隐血实验理想，且取材方便易于接受。
3.3以往研究资料曾有报道，结直肠癌前病变（结直肠息肉）SFRP2基因也发生甲基化改变，且阳性率最高可达79.4％，癌前病变（结直肠息肉）与正常人甲基化情况存在着显著性差异，与结直肠癌无显著性差异，由此可见SFRP2基因甲基化参与了肿瘤的发生机制，是早期事件之一，可用于结直肠癌早期筛查和预警，优于其它指标。
3.4肠粘膜细胞甲基化是DNA的表观遗传修饰，与肿瘤发病密切相关。分泌型卷曲相关蛋白2（SFRP2）基因是一個肿瘤抑制基因，DNA甲基化能关闭某些基因的活性，是后天基因沉默的一种主要决定性因素。该基因甲基化是可逆的，可用抗甲基化药物降低和逆转甲基化作用，这也为肿瘤的治疗提供了一个新的途径。
3.5该方法为无创性诊断，简便易行，SFRP2基因有可能作为肿瘤筛查标志物特定基因，用于高危人群的监测、筛查与诊断，必将带来很好的应用前景。
结论：粪便DNA甲基化检测可作为筛查结直肠癌的无创有效方法；用于健康筛查和高危人群的监测与诊断。
注：本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文