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摘要：【目的】明確广西罗非鱼主产区养殖环境中抗生素的残留分布，为推进罗非鱼养殖产业的健康绿色发展提供参考。【方法】分别于桂中、桂南和桂北地区淡水养殖池塘中各选择3口具有代表性的池塘（依次编号1#～9#）为采样区，重点研究养殖环境（池塘养殖水和底泥）及吉富罗非鱼成鱼组织（肌肉和肝脏）中恩诺沙星（ENR）、呋喃它酮代谢物（AMOZ）、呋喃妥因代谢物（AHD）、呋喃西林代谢物（SEM）、呋喃唑酮代谢物（AOZ）、磺胺嘧啶（SDZ）、磺胺二甲嘧啶（SM2）、氯霉素（CAP）和土霉素（OTC）等9种常见抗生素的残留情况。【结果】所有样品中检测出的残留抗生素只有3种，即ENR、SM2和OTC。其中，底泥及养殖水样品中检出的残留抗生素为ENR、SM2和OTC，鱼体肌肉组织样品中检出的残留抗生素为ENR，肝脏组织样品中检出的残留抗生素为ENR和SM2。采样池塘底泥中ENR和OTC的残留检出范围分别为1.2400～19.3500和1.3800～38.0100 μg/kg，SM2含量为4.2100 μg/kg;养殖水样品中ENR和OTC的残留量范围分别是0.0147～0.0227和0.0327～3.2420 μg/L，SM2含量为0.0443 μg/L;肌肉组织中ENR的检出残留量为2.8270 μg/kg;肝脏组织中ENR的检出范围是1.0567～6.3230 μg/kg，SM2含量为3.3000 μg/kg。在抗生素残留程度上，8#和5#池塘受抗生素的污染程度相对其他池塘更严重。其中，8#池塘抽检的底泥样品中ENR含量达19.3500 μg/kg，SM2含量达4.2100 μg/kg，OTC含量达8.4600 μg/kg，肌肉样品中ENR的残留量是2.8270 μg/kg，肝脏组织中ENR和SM2的残留量分别高达6.3230和3.3000 μg/kg;5#池塘受OTC的污染较其他池塘严重，底泥中检出OTC的残留量高达38.0100 μg/kg。食品安全方面，肌肉组织中，仅8#池塘的鱼体肌肉样品中检出ENR一种抗生素残留，且残留含量远低于我国及输韩国的水产品中对可食部分限定的最大残留量，但在输美国、加拿大及日本等国家和地区时，禁止在水产品的可食部分中检出ENR;其余肌肉样品中均未检出残留抗生素。【结论】虽然广西罗非鱼主产区养殖池塘环境中残留抗生素种类较少，残留量较低，鱼体组织中抗生素累积较少，抗生素污染程度较低，肌肉组织可食无害，但仍需密切关注养殖环境中抗生素的残留风险。
关键词： 罗非鱼;养殖池塘;抗生素;残留;风险评价;广西
中图分类号： S965.12 文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2019）04-0891-07
Abstract：【Objective】The residual distribution of antibiotics in culture ponds in the main aquaculture areas of tilapia in Guangxi was clarified. It provided reference for promoting the healthy and green development of tilapia breeding industry. 【Method】This experiment selected three representative tilapia freshwater aquaculture ponds in each area of central Guangxi， southern Guangxi and northern Guangxi（No.1#-9#） as the sampling sites. The culture environment（pond water and sediment） and residue of nine major antibiotics in GIFT tilapia adults（muscle and liver） including enrofloxacin（ENR）， furanone metabolites（AMOZ）， nitrofuranotoin metabolites（AHD）， nitrofurazone metabolites（SEM）， furazolidone metabolites（AOZ）， sulfadiazine（SDZ）， sulfamethazine（SM2）， chloramphenicol（CAP） and oxytetracycline（OTC） were researched. 【Result】Only ENR， SM2 and OTC were detected in all the samples.The residual antibiotics in sediment and water samples were ENR， SM2 and OTC， ENR were detected from fish muscle， ENR and SM2 were found in liver samples. Residual detection concentrations of ENR and OTC in the sediment samples of these nine ponds ranged from 1.2400 to 19.3500 μg/kg and 1.3800 to 38.0100 μg/kg， respectively. Residues of SM2 was 4.2100 μg/kg. The ENR residue in water ranged from 0.0147 to 0.0227 μg/L， and OTC residue ranged from 0.0327 to 3.2420 μg/L. The SM2 residue was 0.0443 μg/L . The detected residual ENR in muscle was 2.8270 μg/kg. The detection range of ENR in liver tissues was 1.0567 to 6.3230 μg/kg， and the residual SM2 was 3.3000 μg/kg. In terms of the degree of antibiotic residues， the contamination level of antibiotics in 8# pond and 5# pond was more serious than other fish ponds. Among them， the ENR content in sediment samples of the 8# pond was as high as 19.3500 μg/kg， the SM2 and OTC contents were 4.2100 μg/kg and 8.4600 μg/kg， respectively. The residual amount of ENR in muscle samples was 2.8270 μg/kg. The residual amounts of ENR and SM2 in liver were as high as 6.3230 μg/kg and 3.3000 μg/kg， respectively. And 5# pond was more polluted by OTC than other fish ponds. The residual amount of OTC detected in the sediment was as high as 38.0100 μg/kg. As for food safety， in muscle tissue， only the ENR was detected in the muscle samples of fish in 8# fish pond， and the residual content was much lower than the limited maximum residue in the aquatic products set by China and Korea. But in countries such as the United States， Canada， and Japan， it was prohibited to detect ENR in the edible portion of aquatic products. In addition， no residual antibiotics were detected in the remaining muscle samples. 【Conclusion】There are relatively few residual antibiotics in the breeding pond environment in the main tilapia producing areas in Guangxi， and the cumulative residual quantity is low in the samples of fish tissues. The antibiotics pollution level is low， and the muscle is edible and harmless. But the residual risk of antibiotics in breeding environment should be closely paid attention to. Key words： tilapia; aquaculture ponds; antibiotics; residue; risk evaluation; Guangxi
0 引言
【研究意义】罗非鱼被誉为未来动物性蛋白的主要来源之一。我国是全球最大的罗非鱼养殖国家，2017年罗非鱼养殖总产量约158万t。广西是我国罗非鱼主产区之一，2017年广西罗非鱼养殖总产量约23万t，占我国罗非鱼养殖总产量的15%，罗非鱼产业已成为广西水产业的支柱产业。但近几年来，为缓减广西地区频发的罗非鱼鱼病，养殖户大量施用抗生素，不仅给环境带来了严重威胁，还危及广西地区养殖水产品的质量安全，并最终经由包括食物链传递累积在内的各种途径影响人体健康。因此，了解广西地区罗非鱼养殖主产区域内罗非鱼成鱼组织及养殖池塘环境中抗生素的残留分布，对评价罗非鱼产品的质量安全、养殖环境受抗生素的污染程度有重要意义。【前人研究进展】已报道的研究成果显示，抗生素广泛分布于畜禽养殖环境及养殖对象体内。江西省12个规模化养猪场养殖废水和下游水环境样品中存在至少6种抗生素残留物（陈军平等，2015）;一项对广州市2家典型畜牧养殖场所排污水的检测中检出13种残留抗生素（魏晓东等，2018）。同样，抗生素残留现象广泛存在于水产养殖区各环境介质及鱼体的不同组织中。刘思思等（2014）从莱州湾海水养殖区内鱼体中检测到6种残留抗生素;王华章等（2015）检测到巢湖水产品中有ENR等5种抗生素残留;中国科学院2015年的一项调查结果显示，从广州市南沙水产养殖区养殖水体和鱼体不同组织中共检出9种残留抗生素（郝勤伟等，2017）;2014年10月和2015年3月测得珠江口（珠海和大亚湾）海水养殖区的水样、沉积物及水产品（鱼类和贝类）中共有近20种残留抗生素（郝红珊等，2018）;原盛广等（2015）检测到北京农贸市场内常见4种淡水鱼鲤鱼、鲫鱼、草魚和鲢鱼体内有ENR等4种残留抗生素。抗生素残留污染是严重威胁产品质量安全的一大隐患。但由于动物机体对大多数的抗生素代谢作用较强，以及受检测方法的局限，使得目前针对养殖环境以及水生动物体内抗生素的残留情况研究较少。【本研究切入点】至今，鲜见以广西罗非鱼主产区为研究对象，较全面排查常见抗生素对广西罗非鱼主产区生产污染的研究报道。【拟解决的关键问题】通过检测桂中、桂南和桂北地区9口有代表性养殖池塘环境及罗非鱼成鱼肌肉组织中抗生素的残留状况，并通过风险评价，为农业农村部及其他相关部门的数据统计及产品质量和养殖环境安全监管提供参考，也为进一步推动广西地区罗非鱼养殖产业的健康绿色发展助力。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
分别于桂中地区选取南宁市兴宁区及西乡塘区的坛洛镇和金光镇，于桂南地区选取北海市合浦县党江镇、石康镇和常乐镇，于桂北地区选取柳州市柳北区石碑坪镇和沙塘镇为检测区域。于桂中、桂南每个区域（镇或区）和桂北地区的沙塘镇分别选取1口有代表性的罗非鱼养殖池塘，于桂北地区的柳北区石碑坪镇选取2口有代表性的罗非鱼养殖池塘进行取样检测（共9口池塘）。所检测养殖池塘中的罗非鱼遗传背景一致，且单独饲养。采样时间是2017年5月，每口池塘分别采集池塘底泥、养殖池塘水和罗非鱼成鱼。采样时，向养殖户明确养殖期间对抗生素类药物的使用情况。以下分别用符号1#～3#代表桂中地区的采样池塘，4#～6#代表桂南地区的采样池塘，7#～9#代表桂北地区的采样池塘。采样池塘基本情况如表1所示。
具体采样方法：用抓斗于池塘四角及中央位置采集底泥样品600.00 g并混匀放在黑色样品袋里。用采水器于池塘相同位置的表、中和底层各采集部分养殖水，取等量水样充分混匀后，收集3 L水样于棕色聚乙烯瓶中。以上两种样品采集好后，迅速加冰运回实验室，置于4 ℃冰箱中保存待测。试验用罗非鱼样品为吉富罗非鱼，养殖时间约180 d。每口池塘随机选取20尾（体重652.5±10.8 g/尾，体长25.2±1.6 cm/尾），活鱼充氧运回实验室后，立即取肌肉和肝脏组织，-80 ℃保存待测。取样时记录池塘的水质参数（表2）。
1. 2 试验方法
检测样品为养殖池塘的底泥、养殖水及罗非鱼的肌肉和肝脏组织。抗生素检测项目包括以下9项：恩诺沙星（Enrofloxacin，ENR）、呋喃它酮代谢物（Furanone metabolites，AMOZ）、呋喃妥因代谢物（Nitrofurantoin metabolites，AHD）、呋喃西林代谢物（Nitrofuran metabolites，SEM）、呋喃唑酮代谢物（Furazolidone metabolites，AOZ）、磺胺嘧啶（Sulfadiazine，SDZ）、磺胺二甲嘧啶（Sulfamethazine，SM2）、氯霉素（Chloramphenicol，CAP）和土霉素（Oxytocin，OTC）。检测时，将样品充分混匀后，随机取样进行检测。
1. 2. 1 样品前处理 检测底泥中ENR、SDZ、SM2、CAP和OTC抗生素时，样品前处理方法如下：（1）-50 ℃下冷冻干燥底泥样品48 h，研磨过100目筛，取研磨过的底泥样品5.00 g置于离心管中，加入0.2 g EDTA混合后，分别加入20 mL磷酸盐缓冲液（pH 4.0）和20 mL 0.1%甲酸乙腈混合，振荡20 min，超声波萃取20 min，15000 r/min离心10 min，上清液经滤纸过滤后转移至鸡心瓶中，残渣分别加入10 mL磷酸盐缓冲液（pH 4.0）和10 mL 0.1%甲酸乙腈混合，振荡10 min，15000 r/min离心10 min，上清液经滤纸转移至鸡心瓶中;于45 ℃下160 Pa旋转蒸发约10 min以除去提取液中的乙腈，剩余液体加入30 mL纯水混合，调节pH至3.0后过柱。（2）依次用6 mL甲醇、6 mL纯水活化淋洗HLB固相萃取柱;将上述提取液过HLB固相萃取柱，控制流速约1滴/s;萃取过后，用6 mL纯水冲洗小柱，使用真空泵抽干30 min。（3）加入6 mL甲醇洗脱，收集洗脱液于15 mL离心管中，并在45 ℃下氮气吹至近干，用乙腈∶0.1%甲酸（5∶95）混合液定容至2 mL，涡旋振荡2 min，15000 r/min离心10 min，将上清液转移至另一离心管中，加入5 mL正己烷，振荡涡旋1 min，再5000 r/min离心5 min，过0.22 μm滤器后待测。 检测水中ENR、SDZ、SM2、CAP和OTC抗生素时，样品前处理方法为：（1）将采集的水样混合后，每瓶取200 mL置于大烧杯中混匀，静置10 min，然后用快速滤纸过滤水样200 mL于锥形瓶中;准确加入0.20 g EDTA振摇溶解，用甲酸调节pH至3.0，待净化。（2）依次用6 mL甲醇、6 mL纯水对HLB固相萃取柱活化淋洗;将上述处理后的水样过HLB固相萃取柱，控制流速约1滴/s;用6 mL纯水冲洗小柱，使用真空泵抽干30 min。（3）加入6 mL甲醇洗脱，收集洗脱液于15 mL离心管中，并在45 ℃下氮气吹至近干，用乙腈∶0.1%甲酸（5∶95）混合液定容至1 mL，涡旋振荡2 min，18000 r/min离心10 min，取上清液过0.22 μm滤器后采用液相色谱—质谱联用仪测定。
检测底泥和水中AMOZ、AHD、SEM和AOZ 4种硝基呋喃代谢物时，需要进行衍生化处理，具体参考徐英江等（2009）的操作方法。
罗非鱼样本记录鱼体体长和重量，解剖取背部肌肉和肝脏组织，称重并保存于-80 ℃冰箱中待测。检测组织中抗生素的残留量时，样品处理方法如下：检测肌肉和肝脏组织中ENR、SDZ和SM2时，前处理方法参照农业部1077号公告-1-2008《水产品中17种磺胺类及15种喹诺酮类药物残留量的测定 液相色谱—串联质谱法》;检测AMOZ、AHD、SEM、AOZ残留量时，样品处理方法参照GB/T 21311—2007《动物源性食品中硝基呋喃类药物代谢物残留量检测方法 高效液相色谱—串联质谱法》;检测CAP含量时，处理方法参照GB/T 22338—2008《动物源性食品中氯霉素类药物残留量测定》;检测OTC的残留情况时，处理方法参照GB/T 21317—2007《动物源性食品中四环素类兽药残留量检测方法 液相色谱—质谱/质谱法与高效液相色谱法》。
1. 2. 2 样品中残留抗生素检测方法及参照标准 采样池塘底泥和养殖水样品中抗生素的残留检测采用液相色谱—串联质谱法。肌肉和肝脏组织中ENR、SDZ和SM2检测的检测采用液相色谱—串联质谱法;AMOZ、AHD、SEM和AOZ残留的检测采用高效液相色谱—串联质谱法;CAP残留检测的检测采用液相色谱—质谱/质谱法;OTC残留的检测采用液相色谱—质谱/质谱法。参照1.2.1中肌肉和肝脏组织样品中对应抗生素的检测标准进行判断。
1. 2. 3 评价方法 分析以上样品中抗生素的残留分布情况，将鱼体组织内抗生素的残留量分别与国标、欧盟、美国等国家和地区规定的相关标准进行比较，从而评价检测样品鱼组织内残留的抗生素是否超出标准值。检测抗生素的限量依据如表3所示。
罗非鱼组织中抗生素的残留不仅会影响产品质量安全，还会制约我国罗非鱼加工产品的出口，甚至可能危及我国其他水产品的加工出口。因此，罗非鱼成鱼组织中抗生素残留检测的意义重大。表4显示了我国和输欧盟国家和美国等国家及地区养殖水产品可食部分中9种抗生素的限量标准值。
2 结果与分析
2. 1 样品中抗生素的残留情况
本研究中检出的残留抗生素分布情况如表5所示。（1）所有被检测样品中检出的残留抗生素只有3种，分别为ENR、SM2和OTC。（2）池塘底泥和养殖水体中检出的残留抗生素有ENR、SM2和OTC，以ENR和OTC为主，鱼体组织中检出的残留抗生素是ENR和SM2。其中，池塘底泥中ENR的最低含量为1.2400 μg/kg，最高含量为19.3500 μg/kg，ENR的最大检出浓度低于广东省饮用水源地河流内25.3200 μg/kg（任珂君等，2016）和珠江口典型水产养殖区养殖水中25.6200 μg/kg（梁惜梅等，2013）的残留值;底泥中SM2的含量为4.2100 μg/kg，介于阳江某海水养殖区底泥中对应抗生素的残留量（3.100～35.2000 μg/kg）范围内（何秀婷等，2014）;底泥中OTC的最低残留量为1.3800 μg/kg，最高残留量为38.0100 μg/kg。养殖水样中ENR的最低殘留量为0.0147μg/L，最高残留量为0.0227 μg/L，与养殖海水（杨守国等，2010）及大辽河表层水体（秦延文等，2015）中ENR的最低残留量相近，但均低于贡湖湾水体中ENR的含量4.720 μg/L（武旭跃等，2016）;养殖水样中SM2的检出含量为0.0443 μg/L;OTC的检出含量为0.0327～3.2420 μg/L，最高检出量高于大辽河表层水体中OTC的最高含量0.137 μg/L（秦延文等，2015）。仅8#池塘的鱼体肌肉组织中检出抗生素残留，且检出抗生素只有ENR 1种，含量为2.8270 μg/kg，其检出值远低于我国及输韩国水产品规定可食部分中ENR为100 μg/kg的限量标准值，但在输美国、加拿大及日本等国的水产品可食部分中，ENR为禁止检出物。除ENR残留有检出外，其余抗生素在肌肉样品中均未检出，抗生素残留量符合我国及欧盟等水产品进口国对水产品的质量安全规定。肝脏组织中ENR的检出含量为1.0567～6.3230 μg/kg，SM2的检出含量为3.3000 μg/kg，远低于篮子鱼、美国红鱼等6种鱼肝组织中SM2为6.9 μg/kg的最低检出量（何秀婷等，2014）。肝脏组织中抗生素的残留量均高于肌肉组织，可能因为肝脏作为解毒器官，对抗生素类物质具有一定的累积作用。虽然肝脏组织一般不会直接被人类食用，但其通常会被作为下脚料添加在饲料中，可能对养殖区造成二次污染。（3）检测结果显示，5#池塘受OTC污染较严重，底泥中OTC含量高达38.0100 μg/kg;相较其他养殖池塘而言，8#养殖池塘受抗生素污染较严重，其中底泥样品中ENR含量高达19.3500 μg/kg，SM2含量高达4.2100 μg/kg，OTC含量高达8.4600 μg/kg;肌肉样品中ENR的残留量是2.8270 μg/kg;肝脏组织中ENR和SM2残留量分别高达6.3230和3.3000 μg/kg。本研究检出抗生素的残留量虽然较低，但仍需注意抗生素残留对生物及其环境产生的长期毒害胁迫效应。因此，建议在养殖过程中密切关注养殖环境中抗生素的残留风险。 2. 2 抗生素残留检出原因分析
1#池塘中检出的抗生素有ENR和OTC共2种，且含量较高，但该养殖池塘周边开阔平坦，且无居民住宅，养殖用水为地下水，推测抗生素检出可能是养殖户近期刚投放鱼药所致。2#池塘养殖用水为井水，周边同样无居民住宅，但水体中检出有低含量的ENR和OTC残留，也可能是养殖户近期投放鱼药所致。3#池塘为新建池塘，为井水，周边无居民住宅，几乎无抗生素残留。4#池塘周边建有虾苗繁育场，且污水直接排入鱼塘，推测抗生素残留主要是虾苗繁育场废水排放所致。建议今后在规划水产苗种繁育场时，应考虑配备污水处理装置。5#池塘附近建有养鸭场，养殖水为天然雨水，且采样当天下了暴雨，因此抗生素残留可能与周边养鸭场在养殖过程中大量使用的抗生素经地表径流和雨水冲刷进入养殖池塘有关;另外，该养殖池塘所用水源为雨水，水体交换性差可能是导致OTC在底泥中大量残留的另一主要原因。6#池塘虽周边无住宅区，养殖水为天然雨水，但在取样时发现该池塘有用鸡粪肥水的痕迹，且发现采样池塘的表面浮有许多死鱼，推测抗生素残留是使用鸡粪肥水及鱼发病后施用药物所致，因此，不主张养殖池塘采用鸡粪进行肥水。7#池塘周边无村庄和厂矿，养殖用水为井水，推测抗生素残留原因是近期养殖户投药所致。8#池塘周边建有居民住宅区，夏季养殖用水为大帽河河水，冬季改用深井井水，河流上游建有工厂，推测其受污染严重的原因主要是大帽河河水被污染，此外，有可能是养殖户在养殖过程中大量使用渔药所致。9#池塘属于农业农村部水产健康养殖示范场，周边没有居民区和厂矿等建筑，养殖水引自柳江河，推测其有抗生素检出与检测前养殖户少量使用药物有关。
3 讨论
ENR被广泛用于治疗因细菌性感染或支原体感染引发的畜禽及水生动物疾病（吴银宝等，2006），普遍认为少量使用ENR不会对动物机体造成危害。有报道指出，只有在大量使用ENR时才会在动物组织内存在累积现象，并对肝脏和肾脏产生毒性作用（Vancutsem et al.，1990）。但ENR在水生动物体内的残留时间较长，且其代谢产物环丙沙星（Ciprofloxacin）会严重威胁人体健康，因此，即将上市的水产品需在上市前20 d内停止喂药。ENR在天然水体中的降解速率主要取决于光照，自然光照3 d后天然水体中一般检测不到ENR残留。水体中未被降解的绝大部分ENR会进入底泥，并在低浓度时维持较长时间（吴银宝等，2006）。
SM2因强抗菌性、优良的消炎效果等优点被大量应用于畜牧养殖业和水产养殖业中。其在土壤中的稳定性很强，且当环境偏碱性时，土壤中的SM2会大量进入水体，对地表及地下水造成危害（王冉等，2007）。OTC是一种广谱型抗生素，广泛用于畜牧和水产养殖业中。研究表明，水体中OTC的降解速率与水体pH显著相关，水体pH升高时，OTC在水中的光解速率会加快（Jiao et al.，2008;张翠等，2016）。影响水体中OTC降解速率的另一主要因素是光照，而光解速率又会受水环境中OTC初始含量的影响（Werner et al.，2006;李圆杏等，2013）。
抗生素在进入环境后，会经过吸附沉淀、水解或见光分解及微生物降解代谢等过程（王冉等，2006），吸附作用会直接影响抗生素在环境中的迁移转化能力，吸附能力弱的抗生素容易进入水环境，其在水环境中长期富集会危及水生态系统的稳定。因此，需密切关注养殖环境中抗生素的残留风险。
4 结论
虽然广西罗非鱼主产区养殖池塘环境中残留抗生素种类较少，残留量较低，鱼体组织中抗生素累积较少，抗生素污染程度较低，肌肉组织可食无害，但仍需密切关注养殖环境中抗生系的残留风险。
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（责任编辑 邓慧灵）
关键词： 罗非鱼;养殖池塘;抗生素;残留;风险评价;广西
中图分类号： S965.12 文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2019）04-0891-07
Abstract：【Objective】The residual distribution of antibiotics in culture ponds in the main aquaculture areas of tilapia in Guangxi was clarified. It provided reference for promoting the healthy and green development of tilapia breeding industry. 【Method】This experiment selected three representative tilapia freshwater aquaculture ponds in each area of central Guangxi， southern Guangxi and northern Guangxi（No.1#-9#） as the sampling sites. The culture environment（pond water and sediment） and residue of nine major antibiotics in GIFT tilapia adults（muscle and liver） including enrofloxacin（ENR）， furanone metabolites（AMOZ）， nitrofuranotoin metabolites（AHD）， nitrofurazone metabolites（SEM）， furazolidone metabolites（AOZ）， sulfadiazine（SDZ）， sulfamethazine（SM2）， chloramphenicol（CAP） and oxytetracycline（OTC） were researched. 【Result】Only ENR， SM2 and OTC were detected in all the samples.The residual antibiotics in sediment and water samples were ENR， SM2 and OTC， ENR were detected from fish muscle， ENR and SM2 were found in liver samples. Residual detection concentrations of ENR and OTC in the sediment samples of these nine ponds ranged from 1.2400 to 19.3500 μg/kg and 1.3800 to 38.0100 μg/kg， respectively. Residues of SM2 was 4.2100 μg/kg. The ENR residue in water ranged from 0.0147 to 0.0227 μg/L， and OTC residue ranged from 0.0327 to 3.2420 μg/L. The SM2 residue was 0.0443 μg/L . The detected residual ENR in muscle was 2.8270 μg/kg. The detection range of ENR in liver tissues was 1.0567 to 6.3230 μg/kg， and the residual SM2 was 3.3000 μg/kg. In terms of the degree of antibiotic residues， the contamination level of antibiotics in 8# pond and 5# pond was more serious than other fish ponds. Among them， the ENR content in sediment samples of the 8# pond was as high as 19.3500 μg/kg， the SM2 and OTC contents were 4.2100 μg/kg and 8.4600 μg/kg， respectively. The residual amount of ENR in muscle samples was 2.8270 μg/kg. The residual amounts of ENR and SM2 in liver were as high as 6.3230 μg/kg and 3.3000 μg/kg， respectively. And 5# pond was more polluted by OTC than other fish ponds. The residual amount of OTC detected in the sediment was as high as 38.0100 μg/kg. As for food safety， in muscle tissue， only the ENR was detected in the muscle samples of fish in 8# fish pond， and the residual content was much lower than the limited maximum residue in the aquatic products set by China and Korea. But in countries such as the United States， Canada， and Japan， it was prohibited to detect ENR in the edible portion of aquatic products. In addition， no residual antibiotics were detected in the remaining muscle samples. 【Conclusion】There are relatively few residual antibiotics in the breeding pond environment in the main tilapia producing areas in Guangxi， and the cumulative residual quantity is low in the samples of fish tissues. The antibiotics pollution level is low， and the muscle is edible and harmless. But the residual risk of antibiotics in breeding environment should be closely paid attention to. Key words： tilapia; aquaculture ponds; antibiotics; residue; risk evaluation; Guangxi
0 引言
【研究意义】罗非鱼被誉为未来动物性蛋白的主要来源之一。我国是全球最大的罗非鱼养殖国家，2017年罗非鱼养殖总产量约158万t。广西是我国罗非鱼主产区之一，2017年广西罗非鱼养殖总产量约23万t，占我国罗非鱼养殖总产量的15%，罗非鱼产业已成为广西水产业的支柱产业。但近几年来，为缓减广西地区频发的罗非鱼鱼病，养殖户大量施用抗生素，不仅给环境带来了严重威胁，还危及广西地区养殖水产品的质量安全，并最终经由包括食物链传递累积在内的各种途径影响人体健康。因此，了解广西地区罗非鱼养殖主产区域内罗非鱼成鱼组织及养殖池塘环境中抗生素的残留分布，对评价罗非鱼产品的质量安全、养殖环境受抗生素的污染程度有重要意义。【前人研究进展】已报道的研究成果显示，抗生素广泛分布于畜禽养殖环境及养殖对象体内。江西省12个规模化养猪场养殖废水和下游水环境样品中存在至少6种抗生素残留物（陈军平等，2015）;一项对广州市2家典型畜牧养殖场所排污水的检测中检出13种残留抗生素（魏晓东等，2018）。同样，抗生素残留现象广泛存在于水产养殖区各环境介质及鱼体的不同组织中。刘思思等（2014）从莱州湾海水养殖区内鱼体中检测到6种残留抗生素;王华章等（2015）检测到巢湖水产品中有ENR等5种抗生素残留;中国科学院2015年的一项调查结果显示，从广州市南沙水产养殖区养殖水体和鱼体不同组织中共检出9种残留抗生素（郝勤伟等，2017）;2014年10月和2015年3月测得珠江口（珠海和大亚湾）海水养殖区的水样、沉积物及水产品（鱼类和贝类）中共有近20种残留抗生素（郝红珊等，2018）;原盛广等（2015）检测到北京农贸市场内常见4种淡水鱼鲤鱼、鲫鱼、草魚和鲢鱼体内有ENR等4种残留抗生素。抗生素残留污染是严重威胁产品质量安全的一大隐患。但由于动物机体对大多数的抗生素代谢作用较强，以及受检测方法的局限，使得目前针对养殖环境以及水生动物体内抗生素的残留情况研究较少。【本研究切入点】至今，鲜见以广西罗非鱼主产区为研究对象，较全面排查常见抗生素对广西罗非鱼主产区生产污染的研究报道。【拟解决的关键问题】通过检测桂中、桂南和桂北地区9口有代表性养殖池塘环境及罗非鱼成鱼肌肉组织中抗生素的残留状况，并通过风险评价，为农业农村部及其他相关部门的数据统计及产品质量和养殖环境安全监管提供参考，也为进一步推动广西地区罗非鱼养殖产业的健康绿色发展助力。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
分别于桂中地区选取南宁市兴宁区及西乡塘区的坛洛镇和金光镇，于桂南地区选取北海市合浦县党江镇、石康镇和常乐镇，于桂北地区选取柳州市柳北区石碑坪镇和沙塘镇为检测区域。于桂中、桂南每个区域（镇或区）和桂北地区的沙塘镇分别选取1口有代表性的罗非鱼养殖池塘，于桂北地区的柳北区石碑坪镇选取2口有代表性的罗非鱼养殖池塘进行取样检测（共9口池塘）。所检测养殖池塘中的罗非鱼遗传背景一致，且单独饲养。采样时间是2017年5月，每口池塘分别采集池塘底泥、养殖池塘水和罗非鱼成鱼。采样时，向养殖户明确养殖期间对抗生素类药物的使用情况。以下分别用符号1#～3#代表桂中地区的采样池塘，4#～6#代表桂南地区的采样池塘，7#～9#代表桂北地区的采样池塘。采样池塘基本情况如表1所示。
具体采样方法：用抓斗于池塘四角及中央位置采集底泥样品600.00 g并混匀放在黑色样品袋里。用采水器于池塘相同位置的表、中和底层各采集部分养殖水，取等量水样充分混匀后，收集3 L水样于棕色聚乙烯瓶中。以上两种样品采集好后，迅速加冰运回实验室，置于4 ℃冰箱中保存待测。试验用罗非鱼样品为吉富罗非鱼，养殖时间约180 d。每口池塘随机选取20尾（体重652.5±10.8 g/尾，体长25.2±1.6 cm/尾），活鱼充氧运回实验室后，立即取肌肉和肝脏组织，-80 ℃保存待测。取样时记录池塘的水质参数（表2）。
1. 2 试验方法
检测样品为养殖池塘的底泥、养殖水及罗非鱼的肌肉和肝脏组织。抗生素检测项目包括以下9项：恩诺沙星（Enrofloxacin，ENR）、呋喃它酮代谢物（Furanone metabolites，AMOZ）、呋喃妥因代谢物（Nitrofurantoin metabolites，AHD）、呋喃西林代谢物（Nitrofuran metabolites，SEM）、呋喃唑酮代谢物（Furazolidone metabolites，AOZ）、磺胺嘧啶（Sulfadiazine，SDZ）、磺胺二甲嘧啶（Sulfamethazine，SM2）、氯霉素（Chloramphenicol，CAP）和土霉素（Oxytocin，OTC）。检测时，将样品充分混匀后，随机取样进行检测。
1. 2. 1 样品前处理 检测底泥中ENR、SDZ、SM2、CAP和OTC抗生素时，样品前处理方法如下：（1）-50 ℃下冷冻干燥底泥样品48 h，研磨过100目筛，取研磨过的底泥样品5.00 g置于离心管中，加入0.2 g EDTA混合后，分别加入20 mL磷酸盐缓冲液（pH 4.0）和20 mL 0.1%甲酸乙腈混合，振荡20 min，超声波萃取20 min，15000 r/min离心10 min，上清液经滤纸过滤后转移至鸡心瓶中，残渣分别加入10 mL磷酸盐缓冲液（pH 4.0）和10 mL 0.1%甲酸乙腈混合，振荡10 min，15000 r/min离心10 min，上清液经滤纸转移至鸡心瓶中;于45 ℃下160 Pa旋转蒸发约10 min以除去提取液中的乙腈，剩余液体加入30 mL纯水混合，调节pH至3.0后过柱。（2）依次用6 mL甲醇、6 mL纯水活化淋洗HLB固相萃取柱;将上述提取液过HLB固相萃取柱，控制流速约1滴/s;萃取过后，用6 mL纯水冲洗小柱，使用真空泵抽干30 min。（3）加入6 mL甲醇洗脱，收集洗脱液于15 mL离心管中，并在45 ℃下氮气吹至近干，用乙腈∶0.1%甲酸（5∶95）混合液定容至2 mL，涡旋振荡2 min，15000 r/min离心10 min，将上清液转移至另一离心管中，加入5 mL正己烷，振荡涡旋1 min，再5000 r/min离心5 min，过0.22 μm滤器后待测。 检测水中ENR、SDZ、SM2、CAP和OTC抗生素时，样品前处理方法为：（1）将采集的水样混合后，每瓶取200 mL置于大烧杯中混匀，静置10 min，然后用快速滤纸过滤水样200 mL于锥形瓶中;准确加入0.20 g EDTA振摇溶解，用甲酸调节pH至3.0，待净化。（2）依次用6 mL甲醇、6 mL纯水对HLB固相萃取柱活化淋洗;将上述处理后的水样过HLB固相萃取柱，控制流速约1滴/s;用6 mL纯水冲洗小柱，使用真空泵抽干30 min。（3）加入6 mL甲醇洗脱，收集洗脱液于15 mL离心管中，并在45 ℃下氮气吹至近干，用乙腈∶0.1%甲酸（5∶95）混合液定容至1 mL，涡旋振荡2 min，18000 r/min离心10 min，取上清液过0.22 μm滤器后采用液相色谱—质谱联用仪测定。
检测底泥和水中AMOZ、AHD、SEM和AOZ 4种硝基呋喃代谢物时，需要进行衍生化处理，具体参考徐英江等（2009）的操作方法。
罗非鱼样本记录鱼体体长和重量，解剖取背部肌肉和肝脏组织，称重并保存于-80 ℃冰箱中待测。检测组织中抗生素的残留量时，样品处理方法如下：检测肌肉和肝脏组织中ENR、SDZ和SM2时，前处理方法参照农业部1077号公告-1-2008《水产品中17种磺胺类及15种喹诺酮类药物残留量的测定 液相色谱—串联质谱法》;检测AMOZ、AHD、SEM、AOZ残留量时，样品处理方法参照GB/T 21311—2007《动物源性食品中硝基呋喃类药物代谢物残留量检测方法 高效液相色谱—串联质谱法》;检测CAP含量时，处理方法参照GB/T 22338—2008《动物源性食品中氯霉素类药物残留量测定》;检测OTC的残留情况时，处理方法参照GB/T 21317—2007《动物源性食品中四环素类兽药残留量检测方法 液相色谱—质谱/质谱法与高效液相色谱法》。
1. 2. 2 样品中残留抗生素检测方法及参照标准 采样池塘底泥和养殖水样品中抗生素的残留检测采用液相色谱—串联质谱法。肌肉和肝脏组织中ENR、SDZ和SM2检测的检测采用液相色谱—串联质谱法;AMOZ、AHD、SEM和AOZ残留的检测采用高效液相色谱—串联质谱法;CAP残留检测的检测采用液相色谱—质谱/质谱法;OTC残留的检测采用液相色谱—质谱/质谱法。参照1.2.1中肌肉和肝脏组织样品中对应抗生素的检测标准进行判断。
1. 2. 3 评价方法 分析以上样品中抗生素的残留分布情况，将鱼体组织内抗生素的残留量分别与国标、欧盟、美国等国家和地区规定的相关标准进行比较，从而评价检测样品鱼组织内残留的抗生素是否超出标准值。检测抗生素的限量依据如表3所示。
罗非鱼组织中抗生素的残留不仅会影响产品质量安全，还会制约我国罗非鱼加工产品的出口，甚至可能危及我国其他水产品的加工出口。因此，罗非鱼成鱼组织中抗生素残留检测的意义重大。表4显示了我国和输欧盟国家和美国等国家及地区养殖水产品可食部分中9种抗生素的限量标准值。
2 结果与分析
2. 1 样品中抗生素的残留情况
本研究中检出的残留抗生素分布情况如表5所示。（1）所有被检测样品中检出的残留抗生素只有3种，分别为ENR、SM2和OTC。（2）池塘底泥和养殖水体中检出的残留抗生素有ENR、SM2和OTC，以ENR和OTC为主，鱼体组织中检出的残留抗生素是ENR和SM2。其中，池塘底泥中ENR的最低含量为1.2400 μg/kg，最高含量为19.3500 μg/kg，ENR的最大检出浓度低于广东省饮用水源地河流内25.3200 μg/kg（任珂君等，2016）和珠江口典型水产养殖区养殖水中25.6200 μg/kg（梁惜梅等，2013）的残留值;底泥中SM2的含量为4.2100 μg/kg，介于阳江某海水养殖区底泥中对应抗生素的残留量（3.100～35.2000 μg/kg）范围内（何秀婷等，2014）;底泥中OTC的最低残留量为1.3800 μg/kg，最高残留量为38.0100 μg/kg。养殖水样中ENR的最低殘留量为0.0147μg/L，最高残留量为0.0227 μg/L，与养殖海水（杨守国等，2010）及大辽河表层水体（秦延文等，2015）中ENR的最低残留量相近，但均低于贡湖湾水体中ENR的含量4.720 μg/L（武旭跃等，2016）;养殖水样中SM2的检出含量为0.0443 μg/L;OTC的检出含量为0.0327～3.2420 μg/L，最高检出量高于大辽河表层水体中OTC的最高含量0.137 μg/L（秦延文等，2015）。仅8#池塘的鱼体肌肉组织中检出抗生素残留，且检出抗生素只有ENR 1种，含量为2.8270 μg/kg，其检出值远低于我国及输韩国水产品规定可食部分中ENR为100 μg/kg的限量标准值，但在输美国、加拿大及日本等国的水产品可食部分中，ENR为禁止检出物。除ENR残留有检出外，其余抗生素在肌肉样品中均未检出，抗生素残留量符合我国及欧盟等水产品进口国对水产品的质量安全规定。肝脏组织中ENR的检出含量为1.0567～6.3230 μg/kg，SM2的检出含量为3.3000 μg/kg，远低于篮子鱼、美国红鱼等6种鱼肝组织中SM2为6.9 μg/kg的最低检出量（何秀婷等，2014）。肝脏组织中抗生素的残留量均高于肌肉组织，可能因为肝脏作为解毒器官，对抗生素类物质具有一定的累积作用。虽然肝脏组织一般不会直接被人类食用，但其通常会被作为下脚料添加在饲料中，可能对养殖区造成二次污染。（3）检测结果显示，5#池塘受OTC污染较严重，底泥中OTC含量高达38.0100 μg/kg;相较其他养殖池塘而言，8#养殖池塘受抗生素污染较严重，其中底泥样品中ENR含量高达19.3500 μg/kg，SM2含量高达4.2100 μg/kg，OTC含量高达8.4600 μg/kg;肌肉样品中ENR的残留量是2.8270 μg/kg;肝脏组织中ENR和SM2残留量分别高达6.3230和3.3000 μg/kg。本研究检出抗生素的残留量虽然较低，但仍需注意抗生素残留对生物及其环境产生的长期毒害胁迫效应。因此，建议在养殖过程中密切关注养殖环境中抗生素的残留风险。 2. 2 抗生素残留检出原因分析
1#池塘中检出的抗生素有ENR和OTC共2种，且含量较高，但该养殖池塘周边开阔平坦，且无居民住宅，养殖用水为地下水，推测抗生素检出可能是养殖户近期刚投放鱼药所致。2#池塘养殖用水为井水，周边同样无居民住宅，但水体中检出有低含量的ENR和OTC残留，也可能是养殖户近期投放鱼药所致。3#池塘为新建池塘，为井水，周边无居民住宅，几乎无抗生素残留。4#池塘周边建有虾苗繁育场，且污水直接排入鱼塘，推测抗生素残留主要是虾苗繁育场废水排放所致。建议今后在规划水产苗种繁育场时，应考虑配备污水处理装置。5#池塘附近建有养鸭场，养殖水为天然雨水，且采样当天下了暴雨，因此抗生素残留可能与周边养鸭场在养殖过程中大量使用的抗生素经地表径流和雨水冲刷进入养殖池塘有关;另外，该养殖池塘所用水源为雨水，水体交换性差可能是导致OTC在底泥中大量残留的另一主要原因。6#池塘虽周边无住宅区，养殖水为天然雨水，但在取样时发现该池塘有用鸡粪肥水的痕迹，且发现采样池塘的表面浮有许多死鱼，推测抗生素残留是使用鸡粪肥水及鱼发病后施用药物所致，因此，不主张养殖池塘采用鸡粪进行肥水。7#池塘周边无村庄和厂矿，养殖用水为井水，推测抗生素残留原因是近期养殖户投药所致。8#池塘周边建有居民住宅区，夏季养殖用水为大帽河河水，冬季改用深井井水，河流上游建有工厂，推测其受污染严重的原因主要是大帽河河水被污染，此外，有可能是养殖户在养殖过程中大量使用渔药所致。9#池塘属于农业农村部水产健康养殖示范场，周边没有居民区和厂矿等建筑，养殖水引自柳江河，推测其有抗生素检出与检测前养殖户少量使用药物有关。
3 讨论
ENR被广泛用于治疗因细菌性感染或支原体感染引发的畜禽及水生动物疾病（吴银宝等，2006），普遍认为少量使用ENR不会对动物机体造成危害。有报道指出，只有在大量使用ENR时才会在动物组织内存在累积现象，并对肝脏和肾脏产生毒性作用（Vancutsem et al.，1990）。但ENR在水生动物体内的残留时间较长，且其代谢产物环丙沙星（Ciprofloxacin）会严重威胁人体健康，因此，即将上市的水产品需在上市前20 d内停止喂药。ENR在天然水体中的降解速率主要取决于光照，自然光照3 d后天然水体中一般检测不到ENR残留。水体中未被降解的绝大部分ENR会进入底泥，并在低浓度时维持较长时间（吴银宝等，2006）。
SM2因强抗菌性、优良的消炎效果等优点被大量应用于畜牧养殖业和水产养殖业中。其在土壤中的稳定性很强，且当环境偏碱性时，土壤中的SM2会大量进入水体，对地表及地下水造成危害（王冉等，2007）。OTC是一种广谱型抗生素，广泛用于畜牧和水产养殖业中。研究表明，水体中OTC的降解速率与水体pH显著相关，水体pH升高时，OTC在水中的光解速率会加快（Jiao et al.，2008;张翠等，2016）。影响水体中OTC降解速率的另一主要因素是光照，而光解速率又会受水环境中OTC初始含量的影响（Werner et al.，2006;李圆杏等，2013）。
抗生素在进入环境后，会经过吸附沉淀、水解或见光分解及微生物降解代谢等过程（王冉等，2006），吸附作用会直接影响抗生素在环境中的迁移转化能力，吸附能力弱的抗生素容易进入水环境，其在水环境中长期富集会危及水生态系统的稳定。因此，需密切关注养殖环境中抗生素的残留风险。
4 结论
虽然广西罗非鱼主产区养殖池塘环境中残留抗生素种类较少，残留量较低，鱼体组织中抗生素累积较少，抗生素污染程度较低，肌肉组织可食无害，但仍需密切关注养殖环境中抗生系的残留风险。
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（责任编辑 邓慧灵）