论文部分内容阅读
摘要：【目的】明確广西南宁沃柑溃疡病病原菌种类，筛选田间能抑制该病害的药效，为当地沃柑溃疡病的防治提供依据。【方法】采用组织分离法对病原菌进行分离和纯化培养，根据柯赫氏法则进行验证，通过形态学、16S rDNA序列分析与构建系统发育进化树相结合的方法对病原菌进行鉴定。选用14种药剂，采用平板对峙法测定不同药剂对沃柑溃疡病病原菌的室内毒力;选取室内毒力测定具有一定抑菌效果的药剂进行田间防治效果试验。【结果】确定广西南宁沃柑溃疡病病原为柑桔黄单胞柑桔亚种（Xanthomonas citri subsp. citri），系A菌系。室内毒力测定结果显示，供试的14种药剂中只有80%代森锰锌可湿性粉剂、200亿活芽孢/g枯草芽孢杆菌可湿性粉剂、1.6%噻霉酮涂抹剂、1.8%辛菌胺醋酸盐水剂和3%中生菌素可湿性粉剂等5种药剂对柑橘溃疡病病原菌表现出一定的抑制效果，在500、1000、2000、4000和8000倍稀释浓度下，80%代森锰锌可湿性粉剂的抑菌效果最好，抑菌率为77.4%、75.2%、64.7%、63.0%和58.3%，有效中浓度（EC50）较低，为49.09 mg/L;200亿活芽孢/g枯草芽孢杆菌可湿性粉剂的抑菌率为73.5%、67.4%、64.5%、61.5%和51.2%， EC50较高，为81.47 mg/L。田间药效试验结果表明，200亿活芽孢/g枯草芽孢杆菌可湿性粉剂和1.6%噻霉酮涂抹剂对沃柑溃疡病有较好的防治效果，防效分别为73.45%和71.07%。【结论】从广西南宁分离出的沃柑溃疡病病原菌为强致病性柑桔黄单胞柑桔亚种A菌系，田间可选择200亿活芽孢/g枯草芽孢杆菌进行生物防治。
关键词： 沃柑;溃疡病;柑桔黄单胞柑桔亚种;病原鉴定;药剂筛选;广西南宁
中图分类号： S436.661.1 文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2019）12-2703-10
Pathogen identification and bactericide screening of
Orah citrus canker
ZHAO Hong-tao1， CHEN Dong-kui1* ， CHEN Xiang-ling1， OU Zhi-tao1，
HUANG Qi-chun1， ZHANG Lan1， LI Guo-guo1， LIU Yao-xin1， YE Yun-feng1， FU Gang2
（1Horticulture Research Institute， Guangxi Academy of Agricultural Sciences， Nanning 530007， China; 2Plant Protection Research Institute， Guangxi Academy of Agricultural Sciences， Nanning 530007， China）
Abstract：【Objective】In order to provide the basis for the control of the Orah citrus canker，the Orah citrus canker pathogen was clarified and field medicines were screened in Nanning，Guangxi. 【Method】The bacteria were isolated and purified with tissue separation.And the pathogenicity was verified according to Koch’s rule. It was identified by morphological observation and 16S rDNA sequence analysis combining establishment of the phylogenetic tree.The pathogen were tested by plate confrontation method，and 14 kinds of bactericide were used to test its toxicities in laboratory，then carried out prevention and control in field. 【Result】The pathogen of Orah citrus canker was identified，which has a strain A of Xanthomonas citri subsp. citri in Nanning，Guangxi. The toxicity test results showed that 80% mancozeb WP， 20billion/g Bacillus subtilis WP，1.6% benziothiazolinone PF，1.8% xinjunan acetate SL and 3% Zhongshengmycin WP manifested evident antibacterial effects.With the dilution of 500， 1000， 2000， 4000 and 8000 times，the 80% mancozeb WP showed the optimal effect in the inhibitory rates of 77.4%， 75.2%， 64.7%， 63.0% and 58.3%， and lower effective concentration （EC50） of 49.09 mg/L; the inhibitory rates of 20 billion/g B.subtilis WP inhibitory rates were 73.5%，67.4%，64.5%，61.5% and 51.2%， and high EC50 was 81.47 mg/L. Field efficacy trials have shown 20 billion/g B. subtilis WP and 1.6% benziothiazolinone PF had good control effect on Orah canker，the control effects were 73.45% and 71.07% respectively. 【Conclusion】The pathogenof Orah citrus canker is identified as X.citri subsp. citri strain A isolated from Nanning， Guangxi. The 20 billion/g B.subtilis WP can be a good choice for a biological control of Orah citrus canker disease. Key words： Orah; citrus canker; Xanthomonas citri subsp. citri; pathogen identification; bactericide screening; Nanning， Guangxi
0 引言
【研究意义】沃柑（Orah）为坦普尔桔橙与单西红桔的杂交种，具有树势强健、果实外观漂亮、品质优良、晚熟高糖、早结丰产等优点（江东和曹立，2011;黄其椿等，2014;赵洪涛等，2016），2012年引种到广西南宁种植，因其优异的表现，2014年后呈暴发式扩张，截至2018年底广西沃柑种植面积接近10万ha，约占全国总面积的一半。沃柑是当前我国种植面积和影响力最大的晚熟柑橘品种，在广西是继沙糖桔后最主要的柑橘品种。但沃柑对溃疡病敏感，溃疡病已成为沃柑种植区最严重的病害，是制约沃柑产业进一步发展的重要因素。柑橘溃疡病是世界范围内危害柑橘产业的重要细菌性检疫病害，主要在柑橘新梢抽发期和幼果期为害叶片、枝梢和果实，受害处出现病斑或木栓化，严重的会造成落叶、枯梢、落果，影响柑橘的产量和品质，该病害传播速度快、防治难度大。溃疡病菌系分化较复杂，不同菌系在基因和致病性方面存在差异。因此，研究沃柑溃疡病病原菌种类并有针对性地进行防治药剂筛选，对沃柑溃疡病防控具有重要意义。【前人研究进展】柑橘溃疡病菌系根据地理分布及对寄主植物的致病性差异分为A、B、C、D和E等5个菌系，A菌系又称亚洲种，属柑橘黄单胞柑橘亚种（Xanthomonas citri subsp.citri），是致病力最强、最广泛的菌系;B菌系为美洲种（X. fuscans pv. aurantifolii），主要危害南美洲的柠檬和墨西哥莱檬;C菌系从巴西圣保罗的墨西哥莱檬中分离获得，可侵染酸橙;D菌系发现于墨西哥科利马地区，主要侵染墨西哥莱檬;E菌系发现于美国佛罗里达，只侵染墨西哥莱檬（姚廷山等，2015）;后来有学者又进一步发现A菌系中存在AW和A*的变异菌系（Vauterin et al.，2000;da Silva et al.，2002）。虽然溃疡病的发生至今已有100多年历史，但目前仍无有效方法可完全根治，生产上主要依靠化学药剂进行防治。美国多采用大面积焚毁根除法（Graham et al.，2004），但损失巨大;我国疫区以化学防治为主，根据药剂分类，主要为铜制剂、链霉素类及其他药剂。不同药剂因柑橘品种和实验地点不同，其防治效果也存在差异（袁承东，1993）。孙惠敏等（2011）研究了非铜药剂和含铜药剂对柑橘溃疡病的毒力，结果表明代森锰锌和福美双等的抑菌作用最强;成秀娟等（2012）研究表明，400 mg/kg的松脂酸铜20%可湿性粉剂对溃疡病的防治效果达70.69%～75.35%，是较理想的柑橘溃疡病防治药剂;李建挥等（2013）研究表明，表面活性剂能提高铜制剂对冰糖橙上溃疡病的防治效果;宋晓兵等（2014）连续2年研究了复配药剂25%春雷霉素·叶枯唑WP对柑橘溃疡病的田间防治效果，结果显示25%春雷霉素·叶枯唑WP 500 mg/kg处理2年的平均防效分别为80.80%和84.64%， 显著高于对照药剂处理。但长期施用化学药剂防治会产生药物残留和环境污染等问题，并造成病菌抗药性增强（Behlaiu et al.，2011），因此利用生防微生物進行以菌治菌的绿色防治尤为重要。生防微生物主要包括枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、荧光假单胞菌（Pseudomonas fuorescens）、草生欧氏杆菌（Erwinia herbicala）和丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae）等（Das，2003）。姚廷山等（2014）从土壤中筛选的拮抗放线菌A16对柑橘溃疡病菌有较强的拮抗作用，抑菌圈直径为26.00 mm;刘冰等（2015）通过枯草芽孢杆菌与农用链霉素混用后抑菌效果提高20.7%。【本研究切入点】前人已对其他柑橘类溃疡病防治进行了相关研究，但有关沃柑溃疡病病原菌种类及防治药剂的研究未见报道。【拟解决的关键问题】通过病原菌形态学特征观察、病原菌验证并结合16S rDNA基因序列分析进行广西南宁沃柑溃疡病病原菌鉴定，同时测定14种常用药剂对该病原菌的室内防效，筛选出能有效抑制该病原菌菌丝生长的药剂，继而进行田间药效试验，以期为柑橘溃疡病的防控提供科学依据。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
1. 1. 1 供试样品 2017年7月在广西南宁市武鸣区城厢镇广西鸣鸣果园沃柑基地的东南西北中5点进行采样，每点选择1株感染溃疡病的沃柑树，戴无菌手套采集具有典型溃疡病的叶片，每株采集10张叶片，5个点共采集50张样品，未经处理分别装入干净的密封袋中常温保存送至实验室进行处理。接种用健康沃柑叶片采集于广西农业科学院科研基地避雨防虫网棚内沃柑树。
1. 1. 2 供试药剂 14种供试药剂见表1。
1. 2 病原菌分离及鉴定
1. 2. 1 病原菌分离纯化 参照方中达（2001）的方法进行病原菌分离。选取病健交界处叶片组织，切成0.5 cm×0.5 cm小块，用75%乙醇浸泡30 s，0.1%升汞消毒1 min，再用无菌水漂洗3次;选取10块已消毒好的叶片组织置于灭菌研钵，加入1 mL无菌水，用灭菌研磨棒进行研磨;用接种环蘸取研磨液在牛肉膏蛋白胨琼脂（NA）培养基上进行划线，于28 ℃下培养48 h，挑取单菌落进行纯化培养。
NA培养基：牛肉浸膏3.0 g、蛋白胨5.0 g、葡萄糖2.5 g、琼脂18.0 g，加水定容至1000 mL，pH 7.0，121 ℃灭菌20 min。
1. 2. 2 病原菌验证 参照李云锋和李祥（2000）的方法进行病原菌验证。将分离纯化的细菌菌株接种到NA培养基上，于28 ℃下培养48 h，将培养的细菌用无菌水配制成浓度约108 CFU/mL的菌悬液。在广西农业科学院科研基地从3株健康的沃柑采集夏梢叶片，每株采集9片共27片沃柑叶片，放置于密封袋常温保存带回实验室用自来水冲洗干净，晾干用于病原菌接种。用灭菌大头针在健康柑桔叶片上刺出伤口，再用移液器吸取20 μL菌液接种到伤口上，每个菌株测试3张叶片，3次重复共9张叶片，每张叶片接种4个伤口，以接种等量无菌水作对照。接种叶片置于28 ℃下保湿培养，定期观察叶片发病情况，对发病叶片进行病原菌再分离，并通过柯赫氏法则验证病原菌。 1. 2. 3 病原菌形态学鉴定 对病原菌在NA培养基上的菌落形态进行观察和描述，进行病原菌形态学鉴定。
1. 2. 4 16S rDNA分子生物学鉴定 参考楼兵干等（2009）的方法进行病原菌分子生物学鉴定。采用试剂盒提取病原菌基因组DNA，使用通用引物27F/1492R（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和5'-G GTTACCTTGTTACGACTT-3'）进行16S rDNA序列扩增。PCR反应体系25.0 ?L：10×Ex Buffer 2.5 ?L，dNTP（2.5 mmol/L）2.0 ?L，引物27F（10 ?mol/L） 1.0 ?L，引物1492R（10 ?mol/L）1.0 ?L，DNA模板100 ng，Ex Taq DNA聚合酶（5 U/?L）0.5 ?L，ddH2O补足至25.0 ?L。扩增程序：95 ℃预变性5 min;95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 80 s，进行35个循环;72 ℃延伸10 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳回收目的片段，委托上海鼎安生物科技有取公司采用ABI 3730型基因分析仪进行测序，测序结果用BLAST在GenBank数据库中进行同源性比对，运用ClustalW对序列进行多重比较，使用MEGA 6.0以NJ法进行聚类分析，构建系统发育进化树。
1. 3 14种药剂对溃疡病病原菌的室内毒力测定
1. 3. 1 含菌培养基制备 将鉴定的柑橘溃疡病病原菌菌株接种于含NA培养基的平皿中，于28 ℃下培养48 h，在培养皿中加入25 mL无菌水，用无菌接种环刮下菌苔，制成浓度为1010 CUF/mL的菌悬液，用移液器吸取1 mL菌悬液加入99 mL冷却至45 ℃的NA培养基中充分摇匀，制成含菌浓度为108 CUF/mL的含菌培养基，然后倒皿，每皿倒20 mL培养基。
1. 3. 2 药剂配制及稀释 供试的14种药剂由高浓度向低浓度成倍稀释。先用無菌水配制500倍溶液，依次向低浓度稀释获得1000、2000、4000和8000倍药液，药剂的含量分别为2000、1000、500、250和125 mg/L，以清水为对照（CK）。
1. 3. 3 抑菌作用测定 用直径为6 mm的灭菌打孔器在含菌培养基上打出等边三角形的3个孔，吹干孔内水分。各取不同浓度的药剂50 μL加入到孔中，每个浓度重复3次，无菌水作对照，28 ℃恒温培养48 h后用十字交叉法测量抑菌圈直径，计算不同浓度药剂下的抑菌圈平均值。
1. 3. 4 数据处理 根据抑菌圈直径计算相对抑菌率，相对抑菌率（%）=（处理抑菌圈直径-对照抑菌圈直径）/处理抑菌圈直径×100。以药剂浓度对数值为自变量（x）、相对抑菌率的几率值为因变量（y），建立毒力回归方程，计算相关系数（R）和抑菌有效中浓度（EC50）。
1. 4 防治药剂田间效果测定
1. 4. 1 试验材料 选取室内防治药剂筛选中表现出一定抑菌效果的5种药剂（80%代森锰锌可湿性粉剂、200亿活芽孢/g枯草芽孢杆菌可湿性粉剂、1.6%噻霉酮涂抹剂、1.8%辛菌胺醋酸盐水剂和3%中生菌素可湿性粉剂）进行田间柑橘溃疡病防治试验。
试验在南宁市武鸣区城厢镇九联村广西鸣鸣果业有限公司基地进行，品种为沃柑，树龄四年，长势强壮，株行距2 m×4 m，密度为1245株/ha，肥水管理较好，溃疡病发生程度中等。
1. 4. 2 试验设计 试验设80%代森锰锌可湿性粉剂500倍液、200亿活芽孢/g枯草芽孢杆菌可湿性粉剂500倍液、1.6%噻霉酮涂抹剂400倍液、1.8%辛菌胺醋酸盐水剂600倍液、3%中生菌素可湿性粉剂900倍液和清水对照，共6个处理，每处理4次重复，共24个小区。每个供试药剂为一处理小区，小区随机区组排列，每小区10株沃柑树，小区间设1行分隔树，各小区的树龄、树势和管理水平等均基本一致。对不同药剂采用人工喷雾法进行溃疡病防治，将药液均匀喷布于叶片正面和背面及果实上。
1. 4. 3 调查项目及方法 于夏梢新叶展开时（2018年5月20日）开始第1次喷药，每隔10～15 d喷1次，共喷3次（5月30日喷第2次，6月15日喷第3次），末次喷药后15 d（6月30日）调查夏梢叶片溃疡病发病情况。由于药前夏梢叶片尚未发病，故未作病情基数调查。每试验小区选择有代表性的2株沃柑树进行调查，每株树按东南西北中5个方位取样，每个方位调查2个秋梢的全部叶片，2株树共调查20个梢。
病情分级标准：0级，无病斑;1级，每叶有1～5个病斑;3级，每叶有6～10个病斑;5级，每叶有11～15个病斑;7级，每叶有16～20个病斑;9级，每叶有21个以上病斑。
病情指数（%）=[∑（各级病叶数×相对级数值）/调查总叶数×9]×100
防治效果（%）=（对照区病情指数-处理区病情指数）/对照区病情况指数×100
1. 4. 4 统计分析 采用SPSS 17.0的ANOVA法对试验数据进行方差分析，采用Duncan’s新复极差法比较各处理的防治效果，分析其差异显著性。
2 结果与分析
2. 1 病害症状
溃疡病菌一般只侵染幼嫩的组织，如嫩叶、嫩梢和幼叶，叶片被侵染后在其背面出现针头大小的油渍状斑点，然后扩大穿透叶片，在叶片正面出来近圆形病斑，表面粗糙，后期组织木栓化形成火山口开裂，病健交界处出现黄绿晕圈，危害枝条和果实时木栓化更严重，形成木栓化病斑，但溃疡病对果肉没有影响（图1）。
2. 2 病原菌分离及鉴定
2. 2. 1 病原菌分离和验证 从沃柑病叶组织上分离获得2株细菌，分别命名为G1和G2，将2株细菌通过针刺接种法接种到健康的柑桔叶片上，接种G1菌株的叶片在接种后第8 d出现明显的褐色水渍状病斑（图2-a），第10 d针刺点叶背出现隆起，病斑处出现白色海绵状物质堆积，呈典型的火山口突起（图2-b）;而接种G2菌株的叶片未出现病症，对照叶片也未出现病症（图2-c）。通过柯赫氏证病试验，从离体叶片发病部位分离出的病原菌与接种的G1菌株相同。 2. 2. 2 病原菌形态学鉴定结果 病原菌G1在NA培养基上形成的菌落呈黄色、黏液状、圆形、表面光滑、稍隆起（图3-a），菌落背面也为黄色（图3-b），与已报道的柑橘溃疡病菌相似（吴明琼，2018）。
2. 2. 3 生物信息学分析结果 对沃柑溃疡病病原菌G1菌株16S rDNA序列的PCR扩增产物进行测序，结果获得1417 bp的片段序列（登录号MK121207），BLAST比对结果（图4）显示，其序列与柑桔黄单胞柑桔亚种（X. citri subsp. citri）的同源性为100%，因此将G1菌株鉴定为柑桔黄单胞柑桔亚种。从构建的系统发育进化树（图5）也可看出，G1菌株与多个已报道的柑桔黄单胞柑桔亚种聚在一个分支内。
综合病原菌的形态特征、致病性、16S rDNA序列分析和系统发育进化树结果，进一步将沃柑溃疡病病原菌鉴定为柑桔黄单胞柑桔亚种，为溃疡病A菌系（姚廷山等，2015）。
2. 3 14种药剂对溃疡病病原菌的室内毒力测定结果及毒力回归方程
室内抑菌试验结果（表2）显示，供试的14种药剂中只有80%代森锰锌可湿性粉剂、200亿活芽孢/g枯草芽孢杆菌可湿性粉剂、1.6%噻霉酮涂抹剂、1.8%辛菌胺醋酸盐水剂和3%中生菌素可湿性粉剂等5种药剂对沃柑溃疡病病原菌表现出一定的抑制效果。在500、1000、2000、4000和8000倍稀释浓度下，80%代森锰锌可湿性粉剂的抑菌效果最好，抑菌率分别为77.4%、75.2%、64.7%、63.0%和58.3%，其次是200亿活芽孢/g枯草芽孢杆菌可湿性粉剂，抑菌率分别为73.5%、67.4%、64.5%、61.5%和51.2%，而1.6%噻霉酮涂抹剂、1.8%辛菌胺醋酸盐水剂和3%中生菌素可湿性粉剂在药剂稀释倍数较低的情况下有一定的抑菌作用但效果较差，在药剂稀释倍数较高的情况下无抑菌效果。其余9种药剂没有抑菌效果。
根据抑菌圈直径，建立供试药剂的毒力回归方程，计算、比较80%代森锰锌可湿性粉剂和200亿活芽孢/g枯草芽孢杆菌可湿性粉剂的EC50。结果显示，80%代森锰锌可湿性粉剂的毒力回归方程为y=0.463x+4.217，R=0.933，EC50较低，为49.09 mg/L，抑菌效果较好;而200亿活芽孢/g枯草芽孢杆菌可湿性粉剂的毒力回归方程为y=0.449x+4.142，R=0.948，EC50较高，为81.47 mg/L，抑菌效果稍差。
2. 4 田间药剂筛选结果
选取室内药剂筛选中表现出一定抑制效果的5种药剂（80%代森锰锌可湿性粉剂、200亿活芽孢/g枯草芽孢杆菌可湿性粉剂、1.6%噻霉酮涂抹剂、1.8%辛菌胺醋酸盐水剂和3%中生菌素可湿性粉剂）进行田间防治试验，结果（表3）显示，5种防治药剂对沃柑溃疡病的防治效果在61.81%～73.45%，防治效果排序为200亿活芽孢/g枯草芽孢杆菌可湿性粉剂（73.45%）>1.6%噻霉酮涂抹剂（71.07%）>1.8%辛菌胺醋酸盐水剂（66.53%）>80%代森锰锌可湿性粉剂（65.14%）>3%中生菌素可湿性粉剂（61.81%）;其中，除3%中生菌素可湿性粉剂外，其余各处理对沃柑溃疡病的防治效果差异不显著（P>0.05）。
3 讨论
柑橘溃疡病菌系具有品种特异性，但所产生的症状无明显差异，需借助血清学、噬菌体敏感性、分子标记及寄主范围等多种生物学特征进行病原菌分类鉴定。目前根据基因测序的差异可将柑橘溃疡病分为柑橘黄单胞亚种（X. citri subsp. citri）、棕色黄单胞莱檬亚种（X. fuscans subsp. aurantifolii）和苜蓿黄单胞枳柚亚种（X. alfalfae subsp. citrumelonis）等3个亚种（Schaad et al.，2006）。本研究结合形态学观察、致病性验症和分子鉴定，明确从广西沃柑溃疡病病叶上分离到的病原菌为柑橘黄单胞柑橘亚种，系柑橘溃疡A菌系，与Schaad等（2006）的研究结果一致，是我国柑橘溃疡病病原菌主要类型。
室内毒力是衡量药剂对有害生物毒力作用大小的指标之一，是药剂对有害生物所具有的内在致死能力，而田间药效试验更接近生产实际。本研究的室内毒力鉴定结果表明，14种供试药剂中80%代森锰锌可湿性粉剂、200亿活芽孢/g枯草芽孢杆菌可湿性粉剂、1.6%噻霉酮涂抹剂、1.8%辛菌胺醋酸盐水剂和3%中生菌素可湿性粉剂对柑橘溃疡病病原菌表现出一定的抑制效果，其余药剂对病菌无抑制作用;田间药效试验结果表明，所选药剂对沃柑溃疡病的防治效果在61.81%～73.45%，其中200亿活芽孢/g枯草芽孢杆菌可湿性粉剂的防效最好，1.6%噻霉酮涂抹剂次之。本研究中，常用的铜制剂如氢氧化铜没有表现出抑菌效果，其原因可能是果园连续大量使用铜制剂防治溃疡病，导致抗铜制剂的菌株产生。陈雪凤等（2012）测定广东、江西和广西等地不同产区的21个柑橘溃疡病菌对化学药剂的敏感性，结果表明部分溃疡病菌对药剂产生了不同程度的抗药性，其中有18个菌株对硫酸铜（必备）产生了不同程度的抗性，特别是来自广东的菌株对硫酸铜已产生较强的抗性，来自江西的菌株对溃疡克星产生中等以上抗性，来自广西桂林的菌株对链霉素产生抗性，而枯草芽孢杆菌在广西沃柑产区使用还较少，溃疡病菌可能对其还未产生抗性。另外，田间防治效果与室内毒力测定结果不一致，可能与在实验室毒力测定时的病菌浓度和田间药剂试验时树体所带的病菌浓度不一致有关;也可能是实验室药剂是直接与病菌接触起到杀菌或抑菌作用，而在田间喷施，药剂不一定直接接触到病菌，有些溃疡病菌在植株组织内部，如果不是内吸性药剂就不能直接接触到病菌;也可能是不同地区病原菌存在生理分化，或柑桔品种与栽培管理水平不同，病原菌在寄主上生长的适合度也不同，因而存在品种间感病性差异所致;以及与有些药剂需在植物內活化后才能激活防治作用有关（姚廷山等，2011），具体原因还需进一步探究。在防治药剂的筛选上，生防微生物制剂是未来绿色农业的选择方向，谭小艳等（2006）从枯草芽孢杆菌分离出的Bv10变种对柑橘溃疡病菌有较好的抑制作用;陈娇梅等（2014）鉴定短小芽孢杆菌和芽孢杆菌对柑橘溃疡病的防效达90.0%～100.0%。结合室内毒力测定和田间药效试验，本研究筛选的200亿活芽孢/g枯草芽孢杆菌可湿性粉剂属于生防微生物药剂，作为柑橘溃疡病防治药剂可降低化学药剂的使用量，减少环境污染。 姚廷山，周彦，周常勇. 2015. 柑橘溃疡病菌分化及防治研究进展[J]. 园艺学报，42（9）：1699-1706. [Yao T S，Zhou Y，Zhou C Y. 2015. Research development of the diffe-rentiation and control of citrus bacterial canker disease[J]. Acta Horticulturae Sinica，42（9）：1699-1706.]
袁承东. 1993. 柑桔溃疡病在国内外的危害防治及研究综述[J]. 植物检疫，7（5）：369-373. [Yuan C D.1993. Review on the harm control and research of Citrus bacteria canker disease at home and abroad[J]. Plant Quarantine，7（5）：369-373.]
张戈壁，阳廷密，李喜庆，陈竹生. 2004. 不同柑桔品种对柑桔溃疡病抗病能力的测定[J]. 植物保护学报， 31（2）：221-222. [Zhang G B，Yang T M，Li X Q， Chen Z S. 2004. The resistance of citrus varieties to citrus canker caused by Xanthomonas citri[J]. Journal of Plant Protection， 31（2）：221-222.]
赵洪涛，李果果，刘要鑫，张兰，欧智涛，赵小龙，陈东奎，黄其椿，廖惠红，王茜，黄宏明，莫凯琳，陈香玲. 2016. 沃柑在广西发展的优劣分析及对策探讨[J]. 南方园艺，27（3）：12-16. [Zhao H T，Li G G，Liu Y X，Zhang L，Ou Z T，Zhao X L，Chen D K，Huang Q C，Liao H H，Wang X，Huang H M，Mo K L，Chen X L.2016. Analysis and countermeasures of the development of “Orah” in Guangxi[J]. Southern Horticulture，27（3）：12-16.]
Behlaiu F，Canteros B L，Minsavage G V，Jones J B，Graham J H. 2011. Molecular characterization of copper resistance genes from Xanthomonas citri subsp. citri and Xanthomonas alfalfa subsp. citrumelonis[J]. Applied and Ervironmental Microbiology，77（12）：4089-4096.
da Sliva A C，Ferro J A，Reinach F C，Farah C S，Furian L R，Quaggio R B，Monteiro-Vitorello C B，van Sluys M A，Almeida N F，Alves L M C，do Amaral A M，Bertolini M C，Camargo L E A，Camarotte G，Cannavan F，Cardozo J，Chambergo F，Ciapina L P. 2002. Comparison of the genomes of two Xanthomonas pathogens with diffe-ring host specificities[J]. Nature，417（6887）：459-463.
Das A K. 2003. Citrus canker-a revies[J]. Journal of Applied Horticulture，5（1）：52-60.
Graham J H，Gottwald T R，Gubero J，Achor D S. 2004. Xanthomonas axonopdis pv.citri：Factors affecting successful eradication of citrus canker[J]. Molecular Plant Pathology，5（1）：1-15.
Schaad N W，Elena P，George L，Aaron S，Irina A，Stromberg P E，Stromberg V K，Vidaver A K. 2006. Emended classification of Xanthomonad pathogens on citrus[J]. Systema-tic and Applied Microbiology，29（8）：690-695.
Vauterin L，Rademarker J，Swings J. 2000. Synopsis on the taxonomy of the genus Xanthmonas[J]. Phytopathology， 90（7）： 677-682.
（責任编辑 麻小燕）
关键词： 沃柑;溃疡病;柑桔黄单胞柑桔亚种;病原鉴定;药剂筛选;广西南宁
中图分类号： S436.661.1 文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2019）12-2703-10
Pathogen identification and bactericide screening of
Orah citrus canker
ZHAO Hong-tao1， CHEN Dong-kui1* ， CHEN Xiang-ling1， OU Zhi-tao1，
HUANG Qi-chun1， ZHANG Lan1， LI Guo-guo1， LIU Yao-xin1， YE Yun-feng1， FU Gang2
（1Horticulture Research Institute， Guangxi Academy of Agricultural Sciences， Nanning 530007， China; 2Plant Protection Research Institute， Guangxi Academy of Agricultural Sciences， Nanning 530007， China）
Abstract：【Objective】In order to provide the basis for the control of the Orah citrus canker，the Orah citrus canker pathogen was clarified and field medicines were screened in Nanning，Guangxi. 【Method】The bacteria were isolated and purified with tissue separation.And the pathogenicity was verified according to Koch’s rule. It was identified by morphological observation and 16S rDNA sequence analysis combining establishment of the phylogenetic tree.The pathogen were tested by plate confrontation method，and 14 kinds of bactericide were used to test its toxicities in laboratory，then carried out prevention and control in field. 【Result】The pathogen of Orah citrus canker was identified，which has a strain A of Xanthomonas citri subsp. citri in Nanning，Guangxi. The toxicity test results showed that 80% mancozeb WP， 20billion/g Bacillus subtilis WP，1.6% benziothiazolinone PF，1.8% xinjunan acetate SL and 3% Zhongshengmycin WP manifested evident antibacterial effects.With the dilution of 500， 1000， 2000， 4000 and 8000 times，the 80% mancozeb WP showed the optimal effect in the inhibitory rates of 77.4%， 75.2%， 64.7%， 63.0% and 58.3%， and lower effective concentration （EC50） of 49.09 mg/L; the inhibitory rates of 20 billion/g B.subtilis WP inhibitory rates were 73.5%，67.4%，64.5%，61.5% and 51.2%， and high EC50 was 81.47 mg/L. Field efficacy trials have shown 20 billion/g B. subtilis WP and 1.6% benziothiazolinone PF had good control effect on Orah canker，the control effects were 73.45% and 71.07% respectively. 【Conclusion】The pathogenof Orah citrus canker is identified as X.citri subsp. citri strain A isolated from Nanning， Guangxi. The 20 billion/g B.subtilis WP can be a good choice for a biological control of Orah citrus canker disease. Key words： Orah; citrus canker; Xanthomonas citri subsp. citri; pathogen identification; bactericide screening; Nanning， Guangxi
0 引言
【研究意义】沃柑（Orah）为坦普尔桔橙与单西红桔的杂交种，具有树势强健、果实外观漂亮、品质优良、晚熟高糖、早结丰产等优点（江东和曹立，2011;黄其椿等，2014;赵洪涛等，2016），2012年引种到广西南宁种植，因其优异的表现，2014年后呈暴发式扩张，截至2018年底广西沃柑种植面积接近10万ha，约占全国总面积的一半。沃柑是当前我国种植面积和影响力最大的晚熟柑橘品种，在广西是继沙糖桔后最主要的柑橘品种。但沃柑对溃疡病敏感，溃疡病已成为沃柑种植区最严重的病害，是制约沃柑产业进一步发展的重要因素。柑橘溃疡病是世界范围内危害柑橘产业的重要细菌性检疫病害，主要在柑橘新梢抽发期和幼果期为害叶片、枝梢和果实，受害处出现病斑或木栓化，严重的会造成落叶、枯梢、落果，影响柑橘的产量和品质，该病害传播速度快、防治难度大。溃疡病菌系分化较复杂，不同菌系在基因和致病性方面存在差异。因此，研究沃柑溃疡病病原菌种类并有针对性地进行防治药剂筛选，对沃柑溃疡病防控具有重要意义。【前人研究进展】柑橘溃疡病菌系根据地理分布及对寄主植物的致病性差异分为A、B、C、D和E等5个菌系，A菌系又称亚洲种，属柑橘黄单胞柑橘亚种（Xanthomonas citri subsp.citri），是致病力最强、最广泛的菌系;B菌系为美洲种（X. fuscans pv. aurantifolii），主要危害南美洲的柠檬和墨西哥莱檬;C菌系从巴西圣保罗的墨西哥莱檬中分离获得，可侵染酸橙;D菌系发现于墨西哥科利马地区，主要侵染墨西哥莱檬;E菌系发现于美国佛罗里达，只侵染墨西哥莱檬（姚廷山等，2015）;后来有学者又进一步发现A菌系中存在AW和A*的变异菌系（Vauterin et al.，2000;da Silva et al.，2002）。虽然溃疡病的发生至今已有100多年历史，但目前仍无有效方法可完全根治，生产上主要依靠化学药剂进行防治。美国多采用大面积焚毁根除法（Graham et al.，2004），但损失巨大;我国疫区以化学防治为主，根据药剂分类，主要为铜制剂、链霉素类及其他药剂。不同药剂因柑橘品种和实验地点不同，其防治效果也存在差异（袁承东，1993）。孙惠敏等（2011）研究了非铜药剂和含铜药剂对柑橘溃疡病的毒力，结果表明代森锰锌和福美双等的抑菌作用最强;成秀娟等（2012）研究表明，400 mg/kg的松脂酸铜20%可湿性粉剂对溃疡病的防治效果达70.69%～75.35%，是较理想的柑橘溃疡病防治药剂;李建挥等（2013）研究表明，表面活性剂能提高铜制剂对冰糖橙上溃疡病的防治效果;宋晓兵等（2014）连续2年研究了复配药剂25%春雷霉素·叶枯唑WP对柑橘溃疡病的田间防治效果，结果显示25%春雷霉素·叶枯唑WP 500 mg/kg处理2年的平均防效分别为80.80%和84.64%， 显著高于对照药剂处理。但长期施用化学药剂防治会产生药物残留和环境污染等问题，并造成病菌抗药性增强（Behlaiu et al.，2011），因此利用生防微生物進行以菌治菌的绿色防治尤为重要。生防微生物主要包括枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、荧光假单胞菌（Pseudomonas fuorescens）、草生欧氏杆菌（Erwinia herbicala）和丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae）等（Das，2003）。姚廷山等（2014）从土壤中筛选的拮抗放线菌A16对柑橘溃疡病菌有较强的拮抗作用，抑菌圈直径为26.00 mm;刘冰等（2015）通过枯草芽孢杆菌与农用链霉素混用后抑菌效果提高20.7%。【本研究切入点】前人已对其他柑橘类溃疡病防治进行了相关研究，但有关沃柑溃疡病病原菌种类及防治药剂的研究未见报道。【拟解决的关键问题】通过病原菌形态学特征观察、病原菌验证并结合16S rDNA基因序列分析进行广西南宁沃柑溃疡病病原菌鉴定，同时测定14种常用药剂对该病原菌的室内防效，筛选出能有效抑制该病原菌菌丝生长的药剂，继而进行田间药效试验，以期为柑橘溃疡病的防控提供科学依据。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
1. 1. 1 供试样品 2017年7月在广西南宁市武鸣区城厢镇广西鸣鸣果园沃柑基地的东南西北中5点进行采样，每点选择1株感染溃疡病的沃柑树，戴无菌手套采集具有典型溃疡病的叶片，每株采集10张叶片，5个点共采集50张样品，未经处理分别装入干净的密封袋中常温保存送至实验室进行处理。接种用健康沃柑叶片采集于广西农业科学院科研基地避雨防虫网棚内沃柑树。
1. 1. 2 供试药剂 14种供试药剂见表1。
1. 2 病原菌分离及鉴定
1. 2. 1 病原菌分离纯化 参照方中达（2001）的方法进行病原菌分离。选取病健交界处叶片组织，切成0.5 cm×0.5 cm小块，用75%乙醇浸泡30 s，0.1%升汞消毒1 min，再用无菌水漂洗3次;选取10块已消毒好的叶片组织置于灭菌研钵，加入1 mL无菌水，用灭菌研磨棒进行研磨;用接种环蘸取研磨液在牛肉膏蛋白胨琼脂（NA）培养基上进行划线，于28 ℃下培养48 h，挑取单菌落进行纯化培养。
NA培养基：牛肉浸膏3.0 g、蛋白胨5.0 g、葡萄糖2.5 g、琼脂18.0 g，加水定容至1000 mL，pH 7.0，121 ℃灭菌20 min。
1. 2. 2 病原菌验证 参照李云锋和李祥（2000）的方法进行病原菌验证。将分离纯化的细菌菌株接种到NA培养基上，于28 ℃下培养48 h，将培养的细菌用无菌水配制成浓度约108 CFU/mL的菌悬液。在广西农业科学院科研基地从3株健康的沃柑采集夏梢叶片，每株采集9片共27片沃柑叶片，放置于密封袋常温保存带回实验室用自来水冲洗干净，晾干用于病原菌接种。用灭菌大头针在健康柑桔叶片上刺出伤口，再用移液器吸取20 μL菌液接种到伤口上，每个菌株测试3张叶片，3次重复共9张叶片，每张叶片接种4个伤口，以接种等量无菌水作对照。接种叶片置于28 ℃下保湿培养，定期观察叶片发病情况，对发病叶片进行病原菌再分离，并通过柯赫氏法则验证病原菌。 1. 2. 3 病原菌形态学鉴定 对病原菌在NA培养基上的菌落形态进行观察和描述，进行病原菌形态学鉴定。
1. 2. 4 16S rDNA分子生物学鉴定 参考楼兵干等（2009）的方法进行病原菌分子生物学鉴定。采用试剂盒提取病原菌基因组DNA，使用通用引物27F/1492R（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和5'-G GTTACCTTGTTACGACTT-3'）进行16S rDNA序列扩增。PCR反应体系25.0 ?L：10×Ex Buffer 2.5 ?L，dNTP（2.5 mmol/L）2.0 ?L，引物27F（10 ?mol/L） 1.0 ?L，引物1492R（10 ?mol/L）1.0 ?L，DNA模板100 ng，Ex Taq DNA聚合酶（5 U/?L）0.5 ?L，ddH2O补足至25.0 ?L。扩增程序：95 ℃预变性5 min;95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 80 s，进行35个循环;72 ℃延伸10 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳回收目的片段，委托上海鼎安生物科技有取公司采用ABI 3730型基因分析仪进行测序，测序结果用BLAST在GenBank数据库中进行同源性比对，运用ClustalW对序列进行多重比较，使用MEGA 6.0以NJ法进行聚类分析，构建系统发育进化树。
1. 3 14种药剂对溃疡病病原菌的室内毒力测定
1. 3. 1 含菌培养基制备 将鉴定的柑橘溃疡病病原菌菌株接种于含NA培养基的平皿中，于28 ℃下培养48 h，在培养皿中加入25 mL无菌水，用无菌接种环刮下菌苔，制成浓度为1010 CUF/mL的菌悬液，用移液器吸取1 mL菌悬液加入99 mL冷却至45 ℃的NA培养基中充分摇匀，制成含菌浓度为108 CUF/mL的含菌培养基，然后倒皿，每皿倒20 mL培养基。
1. 3. 2 药剂配制及稀释 供试的14种药剂由高浓度向低浓度成倍稀释。先用無菌水配制500倍溶液，依次向低浓度稀释获得1000、2000、4000和8000倍药液，药剂的含量分别为2000、1000、500、250和125 mg/L，以清水为对照（CK）。
1. 3. 3 抑菌作用测定 用直径为6 mm的灭菌打孔器在含菌培养基上打出等边三角形的3个孔，吹干孔内水分。各取不同浓度的药剂50 μL加入到孔中，每个浓度重复3次，无菌水作对照，28 ℃恒温培养48 h后用十字交叉法测量抑菌圈直径，计算不同浓度药剂下的抑菌圈平均值。
1. 3. 4 数据处理 根据抑菌圈直径计算相对抑菌率，相对抑菌率（%）=（处理抑菌圈直径-对照抑菌圈直径）/处理抑菌圈直径×100。以药剂浓度对数值为自变量（x）、相对抑菌率的几率值为因变量（y），建立毒力回归方程，计算相关系数（R）和抑菌有效中浓度（EC50）。
1. 4 防治药剂田间效果测定
1. 4. 1 试验材料 选取室内防治药剂筛选中表现出一定抑菌效果的5种药剂（80%代森锰锌可湿性粉剂、200亿活芽孢/g枯草芽孢杆菌可湿性粉剂、1.6%噻霉酮涂抹剂、1.8%辛菌胺醋酸盐水剂和3%中生菌素可湿性粉剂）进行田间柑橘溃疡病防治试验。
试验在南宁市武鸣区城厢镇九联村广西鸣鸣果业有限公司基地进行，品种为沃柑，树龄四年，长势强壮，株行距2 m×4 m，密度为1245株/ha，肥水管理较好，溃疡病发生程度中等。
1. 4. 2 试验设计 试验设80%代森锰锌可湿性粉剂500倍液、200亿活芽孢/g枯草芽孢杆菌可湿性粉剂500倍液、1.6%噻霉酮涂抹剂400倍液、1.8%辛菌胺醋酸盐水剂600倍液、3%中生菌素可湿性粉剂900倍液和清水对照，共6个处理，每处理4次重复，共24个小区。每个供试药剂为一处理小区，小区随机区组排列，每小区10株沃柑树，小区间设1行分隔树，各小区的树龄、树势和管理水平等均基本一致。对不同药剂采用人工喷雾法进行溃疡病防治，将药液均匀喷布于叶片正面和背面及果实上。
1. 4. 3 调查项目及方法 于夏梢新叶展开时（2018年5月20日）开始第1次喷药，每隔10～15 d喷1次，共喷3次（5月30日喷第2次，6月15日喷第3次），末次喷药后15 d（6月30日）调查夏梢叶片溃疡病发病情况。由于药前夏梢叶片尚未发病，故未作病情基数调查。每试验小区选择有代表性的2株沃柑树进行调查，每株树按东南西北中5个方位取样，每个方位调查2个秋梢的全部叶片，2株树共调查20个梢。
病情分级标准：0级，无病斑;1级，每叶有1～5个病斑;3级，每叶有6～10个病斑;5级，每叶有11～15个病斑;7级，每叶有16～20个病斑;9级，每叶有21个以上病斑。
病情指数（%）=[∑（各级病叶数×相对级数值）/调查总叶数×9]×100
防治效果（%）=（对照区病情指数-处理区病情指数）/对照区病情况指数×100
1. 4. 4 统计分析 采用SPSS 17.0的ANOVA法对试验数据进行方差分析，采用Duncan’s新复极差法比较各处理的防治效果，分析其差异显著性。
2 结果与分析
2. 1 病害症状
溃疡病菌一般只侵染幼嫩的组织，如嫩叶、嫩梢和幼叶，叶片被侵染后在其背面出现针头大小的油渍状斑点，然后扩大穿透叶片，在叶片正面出来近圆形病斑，表面粗糙，后期组织木栓化形成火山口开裂，病健交界处出现黄绿晕圈，危害枝条和果实时木栓化更严重，形成木栓化病斑，但溃疡病对果肉没有影响（图1）。
2. 2 病原菌分离及鉴定
2. 2. 1 病原菌分离和验证 从沃柑病叶组织上分离获得2株细菌，分别命名为G1和G2，将2株细菌通过针刺接种法接种到健康的柑桔叶片上，接种G1菌株的叶片在接种后第8 d出现明显的褐色水渍状病斑（图2-a），第10 d针刺点叶背出现隆起，病斑处出现白色海绵状物质堆积，呈典型的火山口突起（图2-b）;而接种G2菌株的叶片未出现病症，对照叶片也未出现病症（图2-c）。通过柯赫氏证病试验，从离体叶片发病部位分离出的病原菌与接种的G1菌株相同。 2. 2. 2 病原菌形态学鉴定结果 病原菌G1在NA培养基上形成的菌落呈黄色、黏液状、圆形、表面光滑、稍隆起（图3-a），菌落背面也为黄色（图3-b），与已报道的柑橘溃疡病菌相似（吴明琼，2018）。
2. 2. 3 生物信息学分析结果 对沃柑溃疡病病原菌G1菌株16S rDNA序列的PCR扩增产物进行测序，结果获得1417 bp的片段序列（登录号MK121207），BLAST比对结果（图4）显示，其序列与柑桔黄单胞柑桔亚种（X. citri subsp. citri）的同源性为100%，因此将G1菌株鉴定为柑桔黄单胞柑桔亚种。从构建的系统发育进化树（图5）也可看出，G1菌株与多个已报道的柑桔黄单胞柑桔亚种聚在一个分支内。
综合病原菌的形态特征、致病性、16S rDNA序列分析和系统发育进化树结果，进一步将沃柑溃疡病病原菌鉴定为柑桔黄单胞柑桔亚种，为溃疡病A菌系（姚廷山等，2015）。
2. 3 14种药剂对溃疡病病原菌的室内毒力测定结果及毒力回归方程
室内抑菌试验结果（表2）显示，供试的14种药剂中只有80%代森锰锌可湿性粉剂、200亿活芽孢/g枯草芽孢杆菌可湿性粉剂、1.6%噻霉酮涂抹剂、1.8%辛菌胺醋酸盐水剂和3%中生菌素可湿性粉剂等5种药剂对沃柑溃疡病病原菌表现出一定的抑制效果。在500、1000、2000、4000和8000倍稀释浓度下，80%代森锰锌可湿性粉剂的抑菌效果最好，抑菌率分别为77.4%、75.2%、64.7%、63.0%和58.3%，其次是200亿活芽孢/g枯草芽孢杆菌可湿性粉剂，抑菌率分别为73.5%、67.4%、64.5%、61.5%和51.2%，而1.6%噻霉酮涂抹剂、1.8%辛菌胺醋酸盐水剂和3%中生菌素可湿性粉剂在药剂稀释倍数较低的情况下有一定的抑菌作用但效果较差，在药剂稀释倍数较高的情况下无抑菌效果。其余9种药剂没有抑菌效果。
根据抑菌圈直径，建立供试药剂的毒力回归方程，计算、比较80%代森锰锌可湿性粉剂和200亿活芽孢/g枯草芽孢杆菌可湿性粉剂的EC50。结果显示，80%代森锰锌可湿性粉剂的毒力回归方程为y=0.463x+4.217，R=0.933，EC50较低，为49.09 mg/L，抑菌效果较好;而200亿活芽孢/g枯草芽孢杆菌可湿性粉剂的毒力回归方程为y=0.449x+4.142，R=0.948，EC50较高，为81.47 mg/L，抑菌效果稍差。
2. 4 田间药剂筛选结果
选取室内药剂筛选中表现出一定抑制效果的5种药剂（80%代森锰锌可湿性粉剂、200亿活芽孢/g枯草芽孢杆菌可湿性粉剂、1.6%噻霉酮涂抹剂、1.8%辛菌胺醋酸盐水剂和3%中生菌素可湿性粉剂）进行田间防治试验，结果（表3）显示，5种防治药剂对沃柑溃疡病的防治效果在61.81%～73.45%，防治效果排序为200亿活芽孢/g枯草芽孢杆菌可湿性粉剂（73.45%）>1.6%噻霉酮涂抹剂（71.07%）>1.8%辛菌胺醋酸盐水剂（66.53%）>80%代森锰锌可湿性粉剂（65.14%）>3%中生菌素可湿性粉剂（61.81%）;其中，除3%中生菌素可湿性粉剂外，其余各处理对沃柑溃疡病的防治效果差异不显著（P>0.05）。
3 讨论
柑橘溃疡病菌系具有品种特异性，但所产生的症状无明显差异，需借助血清学、噬菌体敏感性、分子标记及寄主范围等多种生物学特征进行病原菌分类鉴定。目前根据基因测序的差异可将柑橘溃疡病分为柑橘黄单胞亚种（X. citri subsp. citri）、棕色黄单胞莱檬亚种（X. fuscans subsp. aurantifolii）和苜蓿黄单胞枳柚亚种（X. alfalfae subsp. citrumelonis）等3个亚种（Schaad et al.，2006）。本研究结合形态学观察、致病性验症和分子鉴定，明确从广西沃柑溃疡病病叶上分离到的病原菌为柑橘黄单胞柑橘亚种，系柑橘溃疡A菌系，与Schaad等（2006）的研究结果一致，是我国柑橘溃疡病病原菌主要类型。
室内毒力是衡量药剂对有害生物毒力作用大小的指标之一，是药剂对有害生物所具有的内在致死能力，而田间药效试验更接近生产实际。本研究的室内毒力鉴定结果表明，14种供试药剂中80%代森锰锌可湿性粉剂、200亿活芽孢/g枯草芽孢杆菌可湿性粉剂、1.6%噻霉酮涂抹剂、1.8%辛菌胺醋酸盐水剂和3%中生菌素可湿性粉剂对柑橘溃疡病病原菌表现出一定的抑制效果，其余药剂对病菌无抑制作用;田间药效试验结果表明，所选药剂对沃柑溃疡病的防治效果在61.81%～73.45%，其中200亿活芽孢/g枯草芽孢杆菌可湿性粉剂的防效最好，1.6%噻霉酮涂抹剂次之。本研究中，常用的铜制剂如氢氧化铜没有表现出抑菌效果，其原因可能是果园连续大量使用铜制剂防治溃疡病，导致抗铜制剂的菌株产生。陈雪凤等（2012）测定广东、江西和广西等地不同产区的21个柑橘溃疡病菌对化学药剂的敏感性，结果表明部分溃疡病菌对药剂产生了不同程度的抗药性，其中有18个菌株对硫酸铜（必备）产生了不同程度的抗性，特别是来自广东的菌株对硫酸铜已产生较强的抗性，来自江西的菌株对溃疡克星产生中等以上抗性，来自广西桂林的菌株对链霉素产生抗性，而枯草芽孢杆菌在广西沃柑产区使用还较少，溃疡病菌可能对其还未产生抗性。另外，田间防治效果与室内毒力测定结果不一致，可能与在实验室毒力测定时的病菌浓度和田间药剂试验时树体所带的病菌浓度不一致有关;也可能是实验室药剂是直接与病菌接触起到杀菌或抑菌作用，而在田间喷施，药剂不一定直接接触到病菌，有些溃疡病菌在植株组织内部，如果不是内吸性药剂就不能直接接触到病菌;也可能是不同地区病原菌存在生理分化，或柑桔品种与栽培管理水平不同，病原菌在寄主上生长的适合度也不同，因而存在品种间感病性差异所致;以及与有些药剂需在植物內活化后才能激活防治作用有关（姚廷山等，2011），具体原因还需进一步探究。在防治药剂的筛选上，生防微生物制剂是未来绿色农业的选择方向，谭小艳等（2006）从枯草芽孢杆菌分离出的Bv10变种对柑橘溃疡病菌有较好的抑制作用;陈娇梅等（2014）鉴定短小芽孢杆菌和芽孢杆菌对柑橘溃疡病的防效达90.0%～100.0%。结合室内毒力测定和田间药效试验，本研究筛选的200亿活芽孢/g枯草芽孢杆菌可湿性粉剂属于生防微生物药剂，作为柑橘溃疡病防治药剂可降低化学药剂的使用量，减少环境污染。 姚廷山，周彦，周常勇. 2015. 柑橘溃疡病菌分化及防治研究进展[J]. 园艺学报，42（9）：1699-1706. [Yao T S，Zhou Y，Zhou C Y. 2015. Research development of the diffe-rentiation and control of citrus bacterial canker disease[J]. Acta Horticulturae Sinica，42（9）：1699-1706.]
袁承东. 1993. 柑桔溃疡病在国内外的危害防治及研究综述[J]. 植物检疫，7（5）：369-373. [Yuan C D.1993. Review on the harm control and research of Citrus bacteria canker disease at home and abroad[J]. Plant Quarantine，7（5）：369-373.]
张戈壁，阳廷密，李喜庆，陈竹生. 2004. 不同柑桔品种对柑桔溃疡病抗病能力的测定[J]. 植物保护学报， 31（2）：221-222. [Zhang G B，Yang T M，Li X Q， Chen Z S. 2004. The resistance of citrus varieties to citrus canker caused by Xanthomonas citri[J]. Journal of Plant Protection， 31（2）：221-222.]
赵洪涛，李果果，刘要鑫，张兰，欧智涛，赵小龙，陈东奎，黄其椿，廖惠红，王茜，黄宏明，莫凯琳，陈香玲. 2016. 沃柑在广西发展的优劣分析及对策探讨[J]. 南方园艺，27（3）：12-16. [Zhao H T，Li G G，Liu Y X，Zhang L，Ou Z T，Zhao X L，Chen D K，Huang Q C，Liao H H，Wang X，Huang H M，Mo K L，Chen X L.2016. Analysis and countermeasures of the development of “Orah” in Guangxi[J]. Southern Horticulture，27（3）：12-16.]
Behlaiu F，Canteros B L，Minsavage G V，Jones J B，Graham J H. 2011. Molecular characterization of copper resistance genes from Xanthomonas citri subsp. citri and Xanthomonas alfalfa subsp. citrumelonis[J]. Applied and Ervironmental Microbiology，77（12）：4089-4096.
da Sliva A C，Ferro J A，Reinach F C，Farah C S，Furian L R，Quaggio R B，Monteiro-Vitorello C B，van Sluys M A，Almeida N F，Alves L M C，do Amaral A M，Bertolini M C，Camargo L E A，Camarotte G，Cannavan F，Cardozo J，Chambergo F，Ciapina L P. 2002. Comparison of the genomes of two Xanthomonas pathogens with diffe-ring host specificities[J]. Nature，417（6887）：459-463.
Das A K. 2003. Citrus canker-a revies[J]. Journal of Applied Horticulture，5（1）：52-60.
Graham J H，Gottwald T R，Gubero J，Achor D S. 2004. Xanthomonas axonopdis pv.citri：Factors affecting successful eradication of citrus canker[J]. Molecular Plant Pathology，5（1）：1-15.
Schaad N W，Elena P，George L，Aaron S，Irina A，Stromberg P E，Stromberg V K，Vidaver A K. 2006. Emended classification of Xanthomonad pathogens on citrus[J]. Systema-tic and Applied Microbiology，29（8）：690-695.
Vauterin L，Rademarker J，Swings J. 2000. Synopsis on the taxonomy of the genus Xanthmonas[J]. Phytopathology， 90（7）： 677-682.
（責任编辑 麻小燕）