论文部分内容阅读
摘要 [目的]找出一种准确、简捷的测定方法，应用于保健食品的日常检测。[方法]以香草醛-高氯酸为显色剂，采用紫外分光光度计标准曲线外标法测定。[结果]标准曲线法测定的线性范围为0.020～0.250 mg/mL，决定系数R2=0.998 9，在不同的保健食品中平均加标回收率均在95.8%～104.2%，RSD≤3.0（n=6）。[结论]该方法简便快捷、准确、灵敏度高、重复性好，达到检验分析的要求，具有实用推广价值。
关键词 保健食品；总皂苷；紫外分光光度计标准曲线外标法
中图分类号 TS207文献标识码 A文章编号 0517-6611（2018）15-0163-04
Abstract [Objective] The research aimed to find an accurate and simple determination method， which is applied to the daily detection of healthone.[Method] Using vanillin-perchloric acid as a color reagent， UV spectrophotometer standard curve external standard method was used for the determination.[Result]The linear range of the standard curve method was 0.020-0.250 mg/mL， and the determination coefficient was 0.998 9. The average standard recovery rate was 95.8%-104.2% in different healthone， and the RSD was less than 3.0 （n=6）.[Conclusion]The method is simple， quick， accurate， high sensitivity， good reproducibility， meets the requirements of inspection and analysis， and has practical application value.
Key words Healthone；Total saponins；UV spectrophotometer standard curve external standard method
目前有大量的以中草药为主要原料的保健食品，其中有以人参和西洋参为原料的产品，其主要活性成分为总皂苷，具有抗疲劳、促进记忆、保护心血管系统等作用，为保健食品中的功能性成分。总皂苷的分析方法较多，有高效液相色谱法[1] 、超高压液相测定技术[2]、近红外光谱技术[3]、紫外分光光度法[4-7]、比色法等，高效液相色谱法、超高压液相测定技术、近红外光谱技术检测结果精准，但操作步骤较繁琐、耗时、费用较高；紫外分光光度法较简便迅速费用较少，應用较广泛。笔者在《保健食品检验规范与评价技术规范》中保健食品中总皂苷测定方法[8]的基础上对费时费力、容易引起误差的操作步骤进行研究改进，采用超声提取[9-11]、大孔树脂分离纯化[12]、真空旋转浓缩蒸干，以人参皂苷Re为标准品，采用标准曲线法检测各种保健食品中的人参总皂苷含量，建立一个准确、简捷的测定方法，对保健食品中总皂苷含量进行有效控制。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 样品。江西6家生产企业生产的12批保健食品，包括西洋参川贝枇杷膏、灵芝洋参胶囊、无糖型西洋参含片、养鹿人牌参茸枸杞酒、高丽参茶、洋参蜂王浆冻干粉胶囊、西洋参氨基酸口服液、灵芝蛹虫草茯苓酸枣仁颗粒、黄芪白术西洋参口服液、鹿茸人参酒、西洋参提取物、人参粉。
1.1.2 仪器。紫外可见分光光度计（岛津UV-2600）；层析柱（直径1.5 cm，长度20 cm）；双频数控超声波清洗器（KQ-300VDE型）；旋转蒸发真空控制系统（V-300+L-300）；sartorius电子天平；恒温水浴锅。
1.1.3 试剂。XAD-2大孔树脂（SUPELCO Bellefonte，PA），使用前应先用乙醇浸泡1～2 h进行充分激活，然后再用大量清水反复洗涤4～6次，至树脂中已无明显乙醇气味时方可使用。中性氧化铝，100～200目；人参皂苷Re标准品（中国食品药品检定研究所，含量97.4 %，批号110754-201626）；乙醇、香草醛、冰乙酸、高氯酸为分析纯。水为蒸馏水，经Millipore纯水处理系统纯水所得。
1.2 方法
1.2.1 试样处理。
1.2.1.1 固体试样。称取适量样品（根据试样含总皂苷量而定），精密称定，置于100 mL容量瓶中，加少量水，超声30 min，冷却至室温，用水定容至100 mL，摇匀，过滤，吸取1.0 mL续滤液进行柱析层。
1.2.1.2 液体试样。含乙醇的保健酒类等，吸取1.0 mL试样放水浴挥干，用水溶解残渣，用此液进行柱层析。非乙醇类的液体保健食品，吸取试样1.0 mL样品（浓度高或颜色深则稀释后再取1.0 mL）进行柱层析。
1.2.2 柱层析。取层析柱，内装3 cm XAD-2大孔树脂，上加1 cm中性氧化铝。预处理先用25 mL 70%乙醇洗柱弃去洗脱液，再用25 mL水洗柱弃去洗脱液。预处理完毕后，精密量取1.0 mL已处理好的“1.2.1”中试样溶液至层析柱，用25 mL水洗柱弃去洗脱液，用25 mL 70%乙醇洗脱人参皂苷，收集洗脱液于50 mL的旋转蒸发瓶中，置旋转蒸发真空控制系统（真空150 mbar保持10 min，50 mbar 30 min；温度60 ℃）浓缩至干。 1.2.3 显色。在上述浓缩至干的回流瓶中加入0.2 mL 5%香草醛冰乙酸溶液，转动回流瓶，使残渣全部溶解，再加0.8 mL高氯酸，混匀后移入10 mL带塞刻度离心管中，60 ℃水浴加热10 min，取出，冰浴2 min冷却后，准确加入冰乙酸5.0 mL，摇匀后待测。
1.2.4 标准溶液的制备。精密称取人参皂苷Re标准品20 mg，置100 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容，即得人参皂苷Re标准溶液0.2 mg/mL。精密量取人参皂苷标准溶液（0.2 mg/mL）0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.25 mL分别浓缩至干，按“1.2.3”进行显色。
1.2.5 上机测定。按照紫外分光光度法，以1 cm的比色池于560 nm波长处分别对上述空白试剂、标准溶液、样品的显色液进行测定。
2 结果与分析
2.1 线性关系考察
取标准系列溶液，按照“1.2.5”方法测定，以吸光度为横坐标、人参皂苷Re含量（mg/mL）为纵坐标绘制标准曲线，得出回归方程为y=0.250 2x+0.010 5（R2=0.998 9），表明总皂苷（以人参皂苷Re计）在0.020～0.250 mg/mL線性关系良好。
2.2 显色后溶液稳定性试验
取样品和标准溶液分别于显色后5、10、20、30、45、60、90 min测定吸光度，显色后样品溶液和标准溶液30 min的RSD分别为2.87%和2.97%，45 min后RSD分别为4.75%和4.00%，结果显示吸光度在45 min后明显下降（表1）。因此显色后应在30 min内测定完，以保证结果的准确性。
2.3 样品含量测定
分别取12批次保健品，根据预估含量，调整取样量和稀释倍数，使样品中总皂苷（以人参皂苷Re计）的量在0.020～0.250 mg/mL，测定结果均在企业标准规定的标示范围内（表2），与企业投料量基本一致，表明结果可靠。
2.4 加标回收率和重复性试验
精密称取样品，分别加入样品含量约50%、100%、150%的比例加标，按“1.2.2”和“1.2.3”进行层析和测定，并分别计算回收率，其中西洋参川贝枇杷膏的低、中、高比例分别加标6份样品的平均回收率为100.8%、98.5%、101.1%，RSD分别为2.93%、2.67%、2.34%（表3）；灵芝洋参胶囊加标6份样品平均回收率为99.7%，RSD为2.05%（表4）；无糖型西洋参含片加标6份样品平均回收率为100.9%，RSD为2.05%（表5）；养鹿人牌参茸枸杞酒加标6份样品平均回收率为98.6%，RSD为2.76%（表6）；高丽参茶加标6份样品平均回收率为99.8%，RSD为2.51%（表7）；西洋参蜂王浆冻干粉胶囊平均回收率为98.8%，RSD为1.41%（表8）；西洋参氨基酸口服液加标6份样品平均回收率为98.9%，RSD为2.83%（表9）；灵芝蛹虫草茯苓酸枣仁颗粒加标6份样品平均回收率为98.6%，RSD为2.89%（表10）。由此可见，各品种不同梯度的加标回收率均在95.8%～104.2%，RSD≤3%，表明该方法准确度良好。
3 讨论
3.1 标准曲线的选择
在现有的2003年版《保健食品检验与评价技术规范》中，标准点仅测一个点，用的单点外标法，对于含量不一的样品，其吸光度差异较大，对结果影响较大。该试验采用标准曲线法，吸光度在0.020～0.250 mg/mL均能准确定量。
3.2 温度和真空度的选择
在现有的2003年版《保健食品检验与评价技术规范》和部分企业标准及现有的文献中，将洗脱液收集于蒸发皿中，置于60 ℃水浴挥干，这个过程时间太长，常需要4～5 h才能挥干，费时费力。该试验考察了60 ℃，真空度为150、100、50 mbar，发现真空150 mbar保持10 min，50 mbar保持30 min最省时省力，又不会引起暴沸导致损失，因此为了提高效率，故采用水浴60 ℃，真空150 mbar保持10 min，50 mbar保持30 min，浓缩至干。
3.3 测定时间的选择
由于该试验为显色反应，显色后随着时间的推移，吸光度变化很大，考察了标准溶液显色24 h后，吸光度将会从0.720 0降至0.361 2，因此应严格控制测定时间，样品显色后从60 ℃水浴上取出，立即冰浴2 min，精密加入5 mL冰乙酸，摇匀后保证显色完全，进行测定。该试验考察了5、10、20、30、45、60、90 min的吸光度，发现要30 min内完成测定，吸光度RSD小于3%，才能保证数据的准确性，减少误差。
3.4 前处理方法的调整
该试验用到的保健品包括片剂、胶囊、口服液、糖浆、酒类、粉剂、颗粒剂等，由于样品的状态和总皂苷含量不同，因此前处理方法稍有适当的调整。称量样和稀释倍数调整后，应使显色后测定的量在曲线范围内，保证结果的准确性。
4 结论
该试验以香草醛-高氯酸为显色剂，采用标准曲线外标法测定，结果发现，标准曲线法测定的线性范围为0.020～0.250 mg/mL，决定系数R2=0.998 9，在不同的保健食品中平均加标回收率均在95.8%～104.2%，RSD≤3.0（n=6），表明该方法简便快捷、准确、灵敏度高、重复性好，达到检验分析的要求，具有实用推广价值。
参考文献
[1] 李向阳，屠万倩.HPLC测定活力源片中人参皂苷 Re 、Rg1及五味子醇甲的含量[J].中成药，2006，3（28）：346-350.
[2] 李净，祁星星，吕洁，等.超高压液相测定技术在人参皂苷含量测定中的应用[J].河南科技，2012（8）：79.
[3] 汪静静，闫述模，杨滨.近红外光谱技术对人参药材人参皂苷含量测定及产地识别的研究[J].光谱学与光谱分析，2015，35（7）：1885-1888.
[4] 王紫燕，李春沁，董佳悦，等.补肾活血方中人参总皂苷含量测定[J].中药与临床，2016，7（2）：39-41.
[5] 王磊，孙德水，郑东梅.人参糖果中人参总皂苷含量的测定[J].人参研究，2013，25（4）：28-30.
[6] 田健，朱凯.紫外可见分光光度法测定人参中总皂苷的含量[J].吉林中医药，2016，36（8）：832-834.
[7] 徐媛，白少伟，庞文生，等.保健酒中总皂苷含量测定方法研究[J].中国民族民间医药，2014（6）：30.
[8] 中华人民共和国卫生部.保健食品检验与评价技术规范[S].中华人民共和国卫生部，2003：306-307.
[9] 桂双英，周亚球.比色法测定人参中人参总皂苷的含量[J].安徽中医学院学报，2003，22（4）：51-52.
[10] 杜月，陈新梅.比色法测定人参皂苷含量的方法探讨[J].化工时刊，2016，30（9）：25-26.
[11] 王玉，陈洁，黄慧琼.比色法测定保健食品中的总皂苷[J].海峡药学，2013，25（8）：90-92.
[12] 张崇禧，郑友兰，张春红，等.大孔树脂吸附人参总皂苷工艺及再生使用研究[J].中国药学杂志，2003，38（9）：661-664.
关键词 保健食品；总皂苷；紫外分光光度计标准曲线外标法
中图分类号 TS207文献标识码 A文章编号 0517-6611（2018）15-0163-04
Abstract [Objective] The research aimed to find an accurate and simple determination method， which is applied to the daily detection of healthone.[Method] Using vanillin-perchloric acid as a color reagent， UV spectrophotometer standard curve external standard method was used for the determination.[Result]The linear range of the standard curve method was 0.020-0.250 mg/mL， and the determination coefficient was 0.998 9. The average standard recovery rate was 95.8%-104.2% in different healthone， and the RSD was less than 3.0 （n=6）.[Conclusion]The method is simple， quick， accurate， high sensitivity， good reproducibility， meets the requirements of inspection and analysis， and has practical application value.
Key words Healthone；Total saponins；UV spectrophotometer standard curve external standard method
目前有大量的以中草药为主要原料的保健食品，其中有以人参和西洋参为原料的产品，其主要活性成分为总皂苷，具有抗疲劳、促进记忆、保护心血管系统等作用，为保健食品中的功能性成分。总皂苷的分析方法较多，有高效液相色谱法[1] 、超高压液相测定技术[2]、近红外光谱技术[3]、紫外分光光度法[4-7]、比色法等，高效液相色谱法、超高压液相测定技术、近红外光谱技术检测结果精准，但操作步骤较繁琐、耗时、费用较高；紫外分光光度法较简便迅速费用较少，應用较广泛。笔者在《保健食品检验规范与评价技术规范》中保健食品中总皂苷测定方法[8]的基础上对费时费力、容易引起误差的操作步骤进行研究改进，采用超声提取[9-11]、大孔树脂分离纯化[12]、真空旋转浓缩蒸干，以人参皂苷Re为标准品，采用标准曲线法检测各种保健食品中的人参总皂苷含量，建立一个准确、简捷的测定方法，对保健食品中总皂苷含量进行有效控制。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 样品。江西6家生产企业生产的12批保健食品，包括西洋参川贝枇杷膏、灵芝洋参胶囊、无糖型西洋参含片、养鹿人牌参茸枸杞酒、高丽参茶、洋参蜂王浆冻干粉胶囊、西洋参氨基酸口服液、灵芝蛹虫草茯苓酸枣仁颗粒、黄芪白术西洋参口服液、鹿茸人参酒、西洋参提取物、人参粉。
1.1.2 仪器。紫外可见分光光度计（岛津UV-2600）；层析柱（直径1.5 cm，长度20 cm）；双频数控超声波清洗器（KQ-300VDE型）；旋转蒸发真空控制系统（V-300+L-300）；sartorius电子天平；恒温水浴锅。
1.1.3 试剂。XAD-2大孔树脂（SUPELCO Bellefonte，PA），使用前应先用乙醇浸泡1～2 h进行充分激活，然后再用大量清水反复洗涤4～6次，至树脂中已无明显乙醇气味时方可使用。中性氧化铝，100～200目；人参皂苷Re标准品（中国食品药品检定研究所，含量97.4 %，批号110754-201626）；乙醇、香草醛、冰乙酸、高氯酸为分析纯。水为蒸馏水，经Millipore纯水处理系统纯水所得。
1.2 方法
1.2.1 试样处理。
1.2.1.1 固体试样。称取适量样品（根据试样含总皂苷量而定），精密称定，置于100 mL容量瓶中，加少量水，超声30 min，冷却至室温，用水定容至100 mL，摇匀，过滤，吸取1.0 mL续滤液进行柱析层。
1.2.1.2 液体试样。含乙醇的保健酒类等，吸取1.0 mL试样放水浴挥干，用水溶解残渣，用此液进行柱层析。非乙醇类的液体保健食品，吸取试样1.0 mL样品（浓度高或颜色深则稀释后再取1.0 mL）进行柱层析。
1.2.2 柱层析。取层析柱，内装3 cm XAD-2大孔树脂，上加1 cm中性氧化铝。预处理先用25 mL 70%乙醇洗柱弃去洗脱液，再用25 mL水洗柱弃去洗脱液。预处理完毕后，精密量取1.0 mL已处理好的“1.2.1”中试样溶液至层析柱，用25 mL水洗柱弃去洗脱液，用25 mL 70%乙醇洗脱人参皂苷，收集洗脱液于50 mL的旋转蒸发瓶中，置旋转蒸发真空控制系统（真空150 mbar保持10 min，50 mbar 30 min；温度60 ℃）浓缩至干。 1.2.3 显色。在上述浓缩至干的回流瓶中加入0.2 mL 5%香草醛冰乙酸溶液，转动回流瓶，使残渣全部溶解，再加0.8 mL高氯酸，混匀后移入10 mL带塞刻度离心管中，60 ℃水浴加热10 min，取出，冰浴2 min冷却后，准确加入冰乙酸5.0 mL，摇匀后待测。
1.2.4 标准溶液的制备。精密称取人参皂苷Re标准品20 mg，置100 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容，即得人参皂苷Re标准溶液0.2 mg/mL。精密量取人参皂苷标准溶液（0.2 mg/mL）0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.25 mL分别浓缩至干，按“1.2.3”进行显色。
1.2.5 上机测定。按照紫外分光光度法，以1 cm的比色池于560 nm波长处分别对上述空白试剂、标准溶液、样品的显色液进行测定。
2 结果与分析
2.1 线性关系考察
取标准系列溶液，按照“1.2.5”方法测定，以吸光度为横坐标、人参皂苷Re含量（mg/mL）为纵坐标绘制标准曲线，得出回归方程为y=0.250 2x+0.010 5（R2=0.998 9），表明总皂苷（以人参皂苷Re计）在0.020～0.250 mg/mL線性关系良好。
2.2 显色后溶液稳定性试验
取样品和标准溶液分别于显色后5、10、20、30、45、60、90 min测定吸光度，显色后样品溶液和标准溶液30 min的RSD分别为2.87%和2.97%，45 min后RSD分别为4.75%和4.00%，结果显示吸光度在45 min后明显下降（表1）。因此显色后应在30 min内测定完，以保证结果的准确性。
2.3 样品含量测定
分别取12批次保健品，根据预估含量，调整取样量和稀释倍数，使样品中总皂苷（以人参皂苷Re计）的量在0.020～0.250 mg/mL，测定结果均在企业标准规定的标示范围内（表2），与企业投料量基本一致，表明结果可靠。
2.4 加标回收率和重复性试验
精密称取样品，分别加入样品含量约50%、100%、150%的比例加标，按“1.2.2”和“1.2.3”进行层析和测定，并分别计算回收率，其中西洋参川贝枇杷膏的低、中、高比例分别加标6份样品的平均回收率为100.8%、98.5%、101.1%，RSD分别为2.93%、2.67%、2.34%（表3）；灵芝洋参胶囊加标6份样品平均回收率为99.7%，RSD为2.05%（表4）；无糖型西洋参含片加标6份样品平均回收率为100.9%，RSD为2.05%（表5）；养鹿人牌参茸枸杞酒加标6份样品平均回收率为98.6%，RSD为2.76%（表6）；高丽参茶加标6份样品平均回收率为99.8%，RSD为2.51%（表7）；西洋参蜂王浆冻干粉胶囊平均回收率为98.8%，RSD为1.41%（表8）；西洋参氨基酸口服液加标6份样品平均回收率为98.9%，RSD为2.83%（表9）；灵芝蛹虫草茯苓酸枣仁颗粒加标6份样品平均回收率为98.6%，RSD为2.89%（表10）。由此可见，各品种不同梯度的加标回收率均在95.8%～104.2%，RSD≤3%，表明该方法准确度良好。
3 讨论
3.1 标准曲线的选择
在现有的2003年版《保健食品检验与评价技术规范》中，标准点仅测一个点，用的单点外标法，对于含量不一的样品，其吸光度差异较大，对结果影响较大。该试验采用标准曲线法，吸光度在0.020～0.250 mg/mL均能准确定量。
3.2 温度和真空度的选择
在现有的2003年版《保健食品检验与评价技术规范》和部分企业标准及现有的文献中，将洗脱液收集于蒸发皿中，置于60 ℃水浴挥干，这个过程时间太长，常需要4～5 h才能挥干，费时费力。该试验考察了60 ℃，真空度为150、100、50 mbar，发现真空150 mbar保持10 min，50 mbar保持30 min最省时省力，又不会引起暴沸导致损失，因此为了提高效率，故采用水浴60 ℃，真空150 mbar保持10 min，50 mbar保持30 min，浓缩至干。
3.3 测定时间的选择
由于该试验为显色反应，显色后随着时间的推移，吸光度变化很大，考察了标准溶液显色24 h后，吸光度将会从0.720 0降至0.361 2，因此应严格控制测定时间，样品显色后从60 ℃水浴上取出，立即冰浴2 min，精密加入5 mL冰乙酸，摇匀后保证显色完全，进行测定。该试验考察了5、10、20、30、45、60、90 min的吸光度，发现要30 min内完成测定，吸光度RSD小于3%，才能保证数据的准确性，减少误差。
3.4 前处理方法的调整
该试验用到的保健品包括片剂、胶囊、口服液、糖浆、酒类、粉剂、颗粒剂等，由于样品的状态和总皂苷含量不同，因此前处理方法稍有适当的调整。称量样和稀释倍数调整后，应使显色后测定的量在曲线范围内，保证结果的准确性。
4 结论
该试验以香草醛-高氯酸为显色剂，采用标准曲线外标法测定，结果发现，标准曲线法测定的线性范围为0.020～0.250 mg/mL，决定系数R2=0.998 9，在不同的保健食品中平均加标回收率均在95.8%～104.2%，RSD≤3.0（n=6），表明该方法简便快捷、准确、灵敏度高、重复性好，达到检验分析的要求，具有实用推广价值。
参考文献
[1] 李向阳，屠万倩.HPLC测定活力源片中人参皂苷 Re 、Rg1及五味子醇甲的含量[J].中成药，2006，3（28）：346-350.
[2] 李净，祁星星，吕洁，等.超高压液相测定技术在人参皂苷含量测定中的应用[J].河南科技，2012（8）：79.
[3] 汪静静，闫述模，杨滨.近红外光谱技术对人参药材人参皂苷含量测定及产地识别的研究[J].光谱学与光谱分析，2015，35（7）：1885-1888.
[4] 王紫燕，李春沁，董佳悦，等.补肾活血方中人参总皂苷含量测定[J].中药与临床，2016，7（2）：39-41.
[5] 王磊，孙德水，郑东梅.人参糖果中人参总皂苷含量的测定[J].人参研究，2013，25（4）：28-30.
[6] 田健，朱凯.紫外可见分光光度法测定人参中总皂苷的含量[J].吉林中医药，2016，36（8）：832-834.
[7] 徐媛，白少伟，庞文生，等.保健酒中总皂苷含量测定方法研究[J].中国民族民间医药，2014（6）：30.
[8] 中华人民共和国卫生部.保健食品检验与评价技术规范[S].中华人民共和国卫生部，2003：306-307.
[9] 桂双英，周亚球.比色法测定人参中人参总皂苷的含量[J].安徽中医学院学报，2003，22（4）：51-52.
[10] 杜月，陈新梅.比色法测定人参皂苷含量的方法探讨[J].化工时刊，2016，30（9）：25-26.
[11] 王玉，陈洁，黄慧琼.比色法测定保健食品中的总皂苷[J].海峡药学，2013，25（8）：90-92.
[12] 张崇禧，郑友兰，张春红，等.大孔树脂吸附人参总皂苷工艺及再生使用研究[J].中国药学杂志，2003，38（9）：661-664.