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摘 要：多环芳烃（PAHs）是一种自然界中普遍存在的持久性有机污染物。到目前为止，对于PAHs的健康风险研究主要集中于其致癌性和致突变性，而PAHs对于微生物抗生素抗性的影响还未见报道。评价PAHs对于微生物抗生素抗性的影响对于评估PAHs对于环境和人类健康的潜在风险具有重要的意义。在本研究中，考察了两种典型的多环芳烃，萘（Nap）和菲（Phe）对近海微生物群落抗生素抗性基因的影响。结果表明，100mg/L的Nap和10mg/L的Phe可以显著地提升近海微生物群落中第一类整合酶基因（intI1）、磺胺抗性基因（sulI）和氨基糖苷类抗性基因（aadA2）的丰度。PAHs暴露可以诱导微生物群落中发生由整合子介导的水平基因转移，促进了ARGs在微生物群落中的传播。
关键词：抗生素抗性基因；多环芳烃；整合子；水平基因转移
1研究目的和意义
石油污染最主要发生在海洋。据统计，每年通过各种渠道倾注到海洋的石油量达200万吨～1000万吨。我国沿海地区海水含油量已超过国家规定的海水水质标准2倍～8倍，石油污染十分严重。现在对于海洋石油泄漏主要的处理方法是投加表面活性剂进行吸附，接种高效的石油降解菌种进行降解，这些方法会对原本的海洋群落结构产生冲击，可能对生态环境产生风险。
抗性基因现在已经普遍被当作是一种新型的污染物质，抗性基因的大量传播会对生态环境、人类健康等造成不利的影响。已经有研究表明重金属、消毒剂等非抗生素类物质可以造成抗性基因的传播，我们有理由相信石油中的烃类物质或在石油处理中投加的表面活性剂等物质也可能造成抗性基因的传播，从而产生生态环境风险。
本研究目的：在对近海环境典型复合污染处理的过程中同时达到对ARGs风险的控制。ARGs现在已经被普遍认为是一种新型的污染物质，但对于受污染地区微生物群落中ARGs的变化情况的研究还很少，因此在这方面的研究是必要的。
2.研究说明
2.1反应体系设计与运行
2.1.1样品采集及处理
海水微生物样品取自大连市区附近海域，海水样品在采集2h内运送至实验室，经过0.22μm孔径的微孔滤膜过滤为微生物进行富集，富集好的微生物重新悬于一定量的灭菌海水中4℃保存。
對富集的海洋微生物应用2261E培养基[1]进行扩大培养。对培养24h后的海洋微生物群落在10000rpm下离心5分钟进行收集，悬于一定体积灭菌海水中-80℃保存备用。
2.1.2微生物群落PAHs暴露实验
萘和菲用正己烷配置标准浓度的储备液，在4℃冰箱中保存。向250mL锥形瓶中加入100mL配置好的人工海水，高压灭菌，再加入10mg/L和30mg/L的萘或菲，室温下静置30分钟使正己烷挥发。之后向锥形瓶中加入一定量的近海海水浓缩菌液（浓度约为1x104cells/L），在30℃、150rpm摇床中培养，每3天更换一次人工海水并加入新的相同量的PAHs。更换人工海水过程中，微生物通过12000rpm离心5分钟收集，并悬于1mL人工海水中，500μL加入到新更换的锥形瓶中，另500μL存于-80℃冰箱中。实验周期为24天。
共进行两次高冲击实验，①菌源为近海海水微生物群落，②菌源为经过10mg/L的PAHs长期暴露后的微生物群落，步骤如下：
向250mL锥形瓶中加入100mL配置好的人工海水，灭菌，之后加入100ppm的萘和菲，静置30分钟使正己烷挥发，再向锥形瓶中加入一定量的近海海水浓缩菌液（浓度约为1x105cells/L）。在30℃，150rpm摇床中培养，共配置10个锥形瓶，5个加入萘，5个加入菲。第一次取样在加入高浓度的萘和菲之后的1天，之后每隔5天取一次样品。取样时，取一个锥形瓶，10000rpm离心5分钟收集微生物，将其存于-80℃冰箱中备用。
2.2 实验方法
2.2.1 DNA提取和PCR扩增
对PAHs暴露实验样品和近海海水富集微生物样品进行DNA提取，DNA提取采用试剂盒提取法，应用试剂盒为Water DNA Isolation Kit。提取后的DNA样品应用1%的琼脂糖凝胶，150V电压下电泳20min进行检测，提取成功的DNA样品存于-20℃冰箱中用于后续的实验。
应用表1中的引物，对intI1、sulⅠ、基因盒、nahAC和16S rRNA基因对PAHs暴露样品和近海海水富集微生物样品进行PCR检测，特异性的引物5`CS和3`CS用于检测Ⅰ型整合子中的可变区域，根据对基因盒中常见的DNA序列信息，设计引物aadAF/aadAR对于基因盒中携带的aadA2基因进行PCR检测，nahAC基因由于在PAHs降解中的关键作用，被选作微生物群落对于PAHs降解能力的标志基因，应用特异性的引物nahF/nahR进行检测。对于不同的样品和不同的引物对，PCR反应同时进行2份，以无菌水作为阴性对照。
PCR产物通过1%琼脂糖凝胶在150V电压下电泳20min进
行检测，对于不同目标基因的扩增产物应用SanPrep Column PCR Product Purification Kit对PCR产物进行纯化，纯化后的产物进行测序。
2.2.2 qRT-PCR实验
应用实时定量PCR技术对PAHs暴露样品和近海海水富集微生物中的intI1、sulⅠ、aadA2、nahAC和16S rRNA基因进行定量检测，qRT-PCR所用引物与PCR相同（表1）。qRT-PCR的反应体系为20μL反应体系中包含10μL SYBR? Premix DimerEraser?，10μM的前后引物各0.8μL，ROX Reference Dye 0.4μL和2μL的模板DNA。扩增反应和荧光检测在ABI StepOnePlus?中进行，实验数据用软件StepOne Software v2.1进行分析。qRT-PCR反应条件为：95℃ 30s，95℃ 5s、退火温度72℃ 30s进行40个扩增循环，最后进行一个20min的融解曲线分析。每个样品对于每个目的基因同时测定三次，以无菌水作为阴性对照。 应用pMD?18-T Vector Cloning Kit对各个目标基因的PCR产物进行克隆，携带目标基因的质粒应用General Plasmid Mini Kit按照说明书进行质粒提取操作。各个携带目的基因的质粒溶液中目的基因的拷贝数浓度按照以下公式进行计算[6]：
各个目标基因拷贝数的标准曲线，应用携带目标基因的质粒通过十倍梯度稀释后进行qRT-PCR反应得出，根据标准曲线，通过未知浓度样品的Ct值来计算样品中目标基因的拷贝数。
2.2.3 第一类整合子转移实验
根据之前报道的第一类整合子转移实验进行本次实验[3]。首先筛选得到两株不同的微生物，一个携带intI1和sulI基因的Aerococcus sp.作为供体菌，另一个不携带这两种基因的Pseudoalteromonas sp.作为受体菌。两株菌在形态学上具有明显差异，供体菌为白色菌株，受体菌为黄色。供体菌和受体菌分别在2261E培养基中30度下培养14 h。培养后的菌株离心收集，并用人工海水调整到合适的微生物浓度。将等量的供体菌和受体菌进行混合，向混合菌液中加入PAHs，在30 和150 rpm下培养12 h。将培养后的混合菌液在含有100 mg/L磺胺、30 mg/L 链霉素和20 mg/L四环素的2261E平板上进行涂板，计算可以在磺胺和链霉素下生长的受体菌的数量，并通过PCR和DNA测序方法证明第一类整合子从供体菌转移到受体菌。
2.3数据及分析结果
2.3.1群落中整合子和基因盒的存在
PCR扩增结果表明intI1存在于近海海洋富集微生物群落中，PCR结果如图1所示，PCR产物经过测序确认为intI1基因。
应用引物5`CS和3`CS对不同PAHs暴露样品进行PCR，结果显示不同样品中存在多种不同大小、不同类型的基因盒。（图2）
对PCR产物中浓度较高的具有代表性的基因盒进行切胶回收，测序，其序列信息见表1。
2.3.2 PAHs暴露前后第一类整合子和相关抗性基因qPCR定量结果
qPCR结果见图3。10ppm的菲暴露使群落中intI1基因（1.61x10-2 一ntI1/16S rRNA）相对于原始海水微生物群落（2.16x10-4 intI1/16S rRNA）提升了74倍（图3 B）。100ppm的萘暴露使群落中intI1基因（5.69x10-3 intI1/16S rRNA）相对于原始海水微生物群落（2.16x10-4 intI1/16S rRNA）提升26倍（图3C）。intI1基因的丰度与PAHs的浓度存在剂量效应关系，随着萘浓度的升高，intI1的变化幅度越来越大。随着菲浓度的升高，intI1基因丰度呈现逐渐降低的趋势（图3 A～E）。aadA2基因变化更明显，10ppm的菲暴露使群落中aadA2基因（4.9x10-3 aadA2/16S rRNA）相对于原始海洋微生物群落（2.49x10-5 aadA2/16S rRNA）提升了200倍。100ppm的萘暴露是群落中aadA2基因（1.41x10-3 aadA2/16S rRNA）相对于原始海水微生物群落（2.49x10-5 aadA2/16S rRNA）提升了56倍。
sul1基因的变化不是很明显，10ppm的菲暴露使群落中的sul1基因提升了22倍，100ppm的萘暴露仅使群落中sul1基因提升了10倍。
经过低浓度PAHs暴露后的微生物群落再次经过100ppmPAHs高负荷冲击后，intI1、sul1和aadA基因变化发生明显不同，100ppm萘暴露后相关基因只变化了2倍左右，而100ppm的菲暴露后相关基因含量明显下降。
2.3.3 PAHs促进第一类整合子介导的水平基因转移
经过水平转移实验之后，受体菌获得了在磺胺和链霉素存在条件下生长的能力，说明受体菌获得了磺胺和链霉素抗性。经测序检测，发现水平转移试验后的受体菌中，存在intI1、sulI和aadA2基因，且这些基因的序列与供体菌完全相同。在未添加PAHs的对照组中，获得抗性的受体菌的数量要远远小于添加PAHs的实验组。说明PAHs可以存进第一类整合子介导的水平基因转移，从而促进微生物群落中ARGs的转移。
3结语
本研究中，经过不同浓度PAHs暴露后的近海微生物群落中含有多种长度不同的基因盒序列，经过测序分析，这些基因盒序列分別与以下基因序列相似：fadD基因和fadK基因分别编码长链脂肪酸CoA连接酶和AMP依赖的合成酶和连接酶；tnpX基因编码tnpX位点特异性重组酶；aadA2基因编码3`-腺苷酰转移酶；qacG基因编码季胺类抗性蛋白。tnpX基因虽然未在环境样品的基因盒中检出，但是其它功能相似的tnp基因被检测到存在于基因盒序列中，aadA2和qacG基因都是常见的基因盒携带基因，在环境样品的基因盒序列中检出频率较高。fadD和fadK基因从未被发现存在于基因盒中，fadD和fadK基因的功能是脂肪酸的生成和其与CoA的链接，fadD和fadK可能与微生物对PAHs的完全矿化有关，因此，PAHs暴露可能会促进fadD和fadK基因盒在微生物群落中的转移和传播，从而间接促进其它含有ARGs的基因盒在微生物群落中传播。
无论是萘或者菲的暴露都会对近海微生物群落中intI1基因和其它抗生素抗性基因含量产生不同程度的提高，并且ARGs的提高与PAHs的浓度存在一定的关联性，菲对ARGs传播的影响更为显著。随着萘浓度的增加intI1和ARGs的浓度也同时增加，但是随着菲浓度的增加intI1和ARGs的浓度变化却呈现相反的趋势。原因可能是由于菲相对于萘在结构方面更为复杂，更难降解，因此相同浓度情况下，菲对于微生物群落造成的压力更大，使多数微生物处于受损状态，所以在低浓度条件下，菲的暴露就可以使微生物群落中intI1和ARGs的浓度显著提高。而随着污染物质浓度的增加，菲对于微生物群落产生的压力越打越大，这会使相当一部分微生物死亡，不利于ARGs的传播。相反，随着萘浓度的升高，高浓度的萘可以为微生物间ARGs传播提供足够的选择性压力，从而增大ARGs的传播。
关键词：抗生素抗性基因；多环芳烃；整合子；水平基因转移
1研究目的和意义
石油污染最主要发生在海洋。据统计，每年通过各种渠道倾注到海洋的石油量达200万吨～1000万吨。我国沿海地区海水含油量已超过国家规定的海水水质标准2倍～8倍，石油污染十分严重。现在对于海洋石油泄漏主要的处理方法是投加表面活性剂进行吸附，接种高效的石油降解菌种进行降解，这些方法会对原本的海洋群落结构产生冲击，可能对生态环境产生风险。
抗性基因现在已经普遍被当作是一种新型的污染物质，抗性基因的大量传播会对生态环境、人类健康等造成不利的影响。已经有研究表明重金属、消毒剂等非抗生素类物质可以造成抗性基因的传播，我们有理由相信石油中的烃类物质或在石油处理中投加的表面活性剂等物质也可能造成抗性基因的传播，从而产生生态环境风险。
本研究目的：在对近海环境典型复合污染处理的过程中同时达到对ARGs风险的控制。ARGs现在已经被普遍认为是一种新型的污染物质，但对于受污染地区微生物群落中ARGs的变化情况的研究还很少，因此在这方面的研究是必要的。
2.研究说明
2.1反应体系设计与运行
2.1.1样品采集及处理
海水微生物样品取自大连市区附近海域，海水样品在采集2h内运送至实验室，经过0.22μm孔径的微孔滤膜过滤为微生物进行富集，富集好的微生物重新悬于一定量的灭菌海水中4℃保存。
對富集的海洋微生物应用2261E培养基[1]进行扩大培养。对培养24h后的海洋微生物群落在10000rpm下离心5分钟进行收集，悬于一定体积灭菌海水中-80℃保存备用。
2.1.2微生物群落PAHs暴露实验
萘和菲用正己烷配置标准浓度的储备液，在4℃冰箱中保存。向250mL锥形瓶中加入100mL配置好的人工海水，高压灭菌，再加入10mg/L和30mg/L的萘或菲，室温下静置30分钟使正己烷挥发。之后向锥形瓶中加入一定量的近海海水浓缩菌液（浓度约为1x104cells/L），在30℃、150rpm摇床中培养，每3天更换一次人工海水并加入新的相同量的PAHs。更换人工海水过程中，微生物通过12000rpm离心5分钟收集，并悬于1mL人工海水中，500μL加入到新更换的锥形瓶中，另500μL存于-80℃冰箱中。实验周期为24天。
共进行两次高冲击实验，①菌源为近海海水微生物群落，②菌源为经过10mg/L的PAHs长期暴露后的微生物群落，步骤如下：
向250mL锥形瓶中加入100mL配置好的人工海水，灭菌，之后加入100ppm的萘和菲，静置30分钟使正己烷挥发，再向锥形瓶中加入一定量的近海海水浓缩菌液（浓度约为1x105cells/L）。在30℃，150rpm摇床中培养，共配置10个锥形瓶，5个加入萘，5个加入菲。第一次取样在加入高浓度的萘和菲之后的1天，之后每隔5天取一次样品。取样时，取一个锥形瓶，10000rpm离心5分钟收集微生物，将其存于-80℃冰箱中备用。
2.2 实验方法
2.2.1 DNA提取和PCR扩增
对PAHs暴露实验样品和近海海水富集微生物样品进行DNA提取，DNA提取采用试剂盒提取法，应用试剂盒为Water DNA Isolation Kit。提取后的DNA样品应用1%的琼脂糖凝胶，150V电压下电泳20min进行检测，提取成功的DNA样品存于-20℃冰箱中用于后续的实验。
应用表1中的引物，对intI1、sulⅠ、基因盒、nahAC和16S rRNA基因对PAHs暴露样品和近海海水富集微生物样品进行PCR检测，特异性的引物5`CS和3`CS用于检测Ⅰ型整合子中的可变区域，根据对基因盒中常见的DNA序列信息，设计引物aadAF/aadAR对于基因盒中携带的aadA2基因进行PCR检测，nahAC基因由于在PAHs降解中的关键作用，被选作微生物群落对于PAHs降解能力的标志基因，应用特异性的引物nahF/nahR进行检测。对于不同的样品和不同的引物对，PCR反应同时进行2份，以无菌水作为阴性对照。
PCR产物通过1%琼脂糖凝胶在150V电压下电泳20min进
行检测，对于不同目标基因的扩增产物应用SanPrep Column PCR Product Purification Kit对PCR产物进行纯化，纯化后的产物进行测序。
2.2.2 qRT-PCR实验
应用实时定量PCR技术对PAHs暴露样品和近海海水富集微生物中的intI1、sulⅠ、aadA2、nahAC和16S rRNA基因进行定量检测，qRT-PCR所用引物与PCR相同（表1）。qRT-PCR的反应体系为20μL反应体系中包含10μL SYBR? Premix DimerEraser?，10μM的前后引物各0.8μL，ROX Reference Dye 0.4μL和2μL的模板DNA。扩增反应和荧光检测在ABI StepOnePlus?中进行，实验数据用软件StepOne Software v2.1进行分析。qRT-PCR反应条件为：95℃ 30s，95℃ 5s、退火温度72℃ 30s进行40个扩增循环，最后进行一个20min的融解曲线分析。每个样品对于每个目的基因同时测定三次，以无菌水作为阴性对照。 应用pMD?18-T Vector Cloning Kit对各个目标基因的PCR产物进行克隆，携带目标基因的质粒应用General Plasmid Mini Kit按照说明书进行质粒提取操作。各个携带目的基因的质粒溶液中目的基因的拷贝数浓度按照以下公式进行计算[6]：
各个目标基因拷贝数的标准曲线，应用携带目标基因的质粒通过十倍梯度稀释后进行qRT-PCR反应得出，根据标准曲线，通过未知浓度样品的Ct值来计算样品中目标基因的拷贝数。
2.2.3 第一类整合子转移实验
根据之前报道的第一类整合子转移实验进行本次实验[3]。首先筛选得到两株不同的微生物，一个携带intI1和sulI基因的Aerococcus sp.作为供体菌，另一个不携带这两种基因的Pseudoalteromonas sp.作为受体菌。两株菌在形态学上具有明显差异，供体菌为白色菌株，受体菌为黄色。供体菌和受体菌分别在2261E培养基中30度下培养14 h。培养后的菌株离心收集，并用人工海水调整到合适的微生物浓度。将等量的供体菌和受体菌进行混合，向混合菌液中加入PAHs，在30 和150 rpm下培养12 h。将培养后的混合菌液在含有100 mg/L磺胺、30 mg/L 链霉素和20 mg/L四环素的2261E平板上进行涂板，计算可以在磺胺和链霉素下生长的受体菌的数量，并通过PCR和DNA测序方法证明第一类整合子从供体菌转移到受体菌。
2.3数据及分析结果
2.3.1群落中整合子和基因盒的存在
PCR扩增结果表明intI1存在于近海海洋富集微生物群落中，PCR结果如图1所示，PCR产物经过测序确认为intI1基因。
应用引物5`CS和3`CS对不同PAHs暴露样品进行PCR，结果显示不同样品中存在多种不同大小、不同类型的基因盒。（图2）
对PCR产物中浓度较高的具有代表性的基因盒进行切胶回收，测序，其序列信息见表1。
2.3.2 PAHs暴露前后第一类整合子和相关抗性基因qPCR定量结果
qPCR结果见图3。10ppm的菲暴露使群落中intI1基因（1.61x10-2 一ntI1/16S rRNA）相对于原始海水微生物群落（2.16x10-4 intI1/16S rRNA）提升了74倍（图3 B）。100ppm的萘暴露使群落中intI1基因（5.69x10-3 intI1/16S rRNA）相对于原始海水微生物群落（2.16x10-4 intI1/16S rRNA）提升26倍（图3C）。intI1基因的丰度与PAHs的浓度存在剂量效应关系，随着萘浓度的升高，intI1的变化幅度越来越大。随着菲浓度的升高，intI1基因丰度呈现逐渐降低的趋势（图3 A～E）。aadA2基因变化更明显，10ppm的菲暴露使群落中aadA2基因（4.9x10-3 aadA2/16S rRNA）相对于原始海洋微生物群落（2.49x10-5 aadA2/16S rRNA）提升了200倍。100ppm的萘暴露是群落中aadA2基因（1.41x10-3 aadA2/16S rRNA）相对于原始海水微生物群落（2.49x10-5 aadA2/16S rRNA）提升了56倍。
sul1基因的变化不是很明显，10ppm的菲暴露使群落中的sul1基因提升了22倍，100ppm的萘暴露仅使群落中sul1基因提升了10倍。
经过低浓度PAHs暴露后的微生物群落再次经过100ppmPAHs高负荷冲击后，intI1、sul1和aadA基因变化发生明显不同，100ppm萘暴露后相关基因只变化了2倍左右，而100ppm的菲暴露后相关基因含量明显下降。
2.3.3 PAHs促进第一类整合子介导的水平基因转移
经过水平转移实验之后，受体菌获得了在磺胺和链霉素存在条件下生长的能力，说明受体菌获得了磺胺和链霉素抗性。经测序检测，发现水平转移试验后的受体菌中，存在intI1、sulI和aadA2基因，且这些基因的序列与供体菌完全相同。在未添加PAHs的对照组中，获得抗性的受体菌的数量要远远小于添加PAHs的实验组。说明PAHs可以存进第一类整合子介导的水平基因转移，从而促进微生物群落中ARGs的转移。
3结语
本研究中，经过不同浓度PAHs暴露后的近海微生物群落中含有多种长度不同的基因盒序列，经过测序分析，这些基因盒序列分別与以下基因序列相似：fadD基因和fadK基因分别编码长链脂肪酸CoA连接酶和AMP依赖的合成酶和连接酶；tnpX基因编码tnpX位点特异性重组酶；aadA2基因编码3`-腺苷酰转移酶；qacG基因编码季胺类抗性蛋白。tnpX基因虽然未在环境样品的基因盒中检出，但是其它功能相似的tnp基因被检测到存在于基因盒序列中，aadA2和qacG基因都是常见的基因盒携带基因，在环境样品的基因盒序列中检出频率较高。fadD和fadK基因从未被发现存在于基因盒中，fadD和fadK基因的功能是脂肪酸的生成和其与CoA的链接，fadD和fadK可能与微生物对PAHs的完全矿化有关，因此，PAHs暴露可能会促进fadD和fadK基因盒在微生物群落中的转移和传播，从而间接促进其它含有ARGs的基因盒在微生物群落中传播。
无论是萘或者菲的暴露都会对近海微生物群落中intI1基因和其它抗生素抗性基因含量产生不同程度的提高，并且ARGs的提高与PAHs的浓度存在一定的关联性，菲对ARGs传播的影响更为显著。随着萘浓度的增加intI1和ARGs的浓度也同时增加，但是随着菲浓度的增加intI1和ARGs的浓度变化却呈现相反的趋势。原因可能是由于菲相对于萘在结构方面更为复杂，更难降解，因此相同浓度情况下，菲对于微生物群落造成的压力更大，使多数微生物处于受损状态，所以在低浓度条件下，菲的暴露就可以使微生物群落中intI1和ARGs的浓度显著提高。而随着污染物质浓度的增加，菲对于微生物群落产生的压力越打越大，这会使相当一部分微生物死亡，不利于ARGs的传播。相反，随着萘浓度的升高，高浓度的萘可以为微生物间ARGs传播提供足够的选择性压力，从而增大ARGs的传播。