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摘 要 目的：对建立的阿奇霉素片含量测定的高效液相色谱法进行方法验证。方法：色谱柱为Waters XBridge C18（4.6 mm×75 mm， 5 μm），流动相为磷酸盐缓冲液-甲醇-乙腈（8∶3∶9），检测波长210 nm，流速1.5 ml/min，柱温50 ℃，进样体积50 ml。结果：该方法的专属性、系统适用性、重复性、中间精密度、溶液稳定性、耐用性均符合验证可接受标准，阿奇霉素在149. 47～348.77 mg/ml范围内线性关系良好，相关系数r=0.999 99，平均加样回收率为100.7%，RSD为0.68%（n=9）。结论：该方法准确可靠，适用于阿奇霉素片含量的定量分析。
关键词 高效液相色谱法 阿奇霉素片 含量
中图分类号：R927.2 文献标志码：A 文章编号：1006-1533（2018）17-0076-04
Determination of the content of azithromycin tablets by HPLC
WU Qingyi*， QU Yanping， ZHOU Xuru
（Shanghai Shyndec Pharmaceutical Co.， Ltd.， Shanghai 200137， China）
ABSTRACT Objective： To validate the method for determination of the content of azithromycin tablets by HPLC. Methods： HPLC was carried out on a Waters XBridge C18 column （4.6 mm×75 mm， 5 μm） with a mixture of phosphate buffermethanol-acetonitrile （8：3：9） as the mobile phase at the detection wavelength of 210 nm， the flow velocity of 1.5 ml/min and the column temperature of 50 ℃ with sample volume of 50 μl. Results： The specificity， system applicability， repeatability， intermediate precision， stability of the solution and durability of this method could meet the criteria for validation， the standard curve of azithromycin showed good linearity in the range of 149.47-348.77 mg/ml with the correlation coefficient （r） of 0.999 99. The average recovery of samples was 100.7% with RSD of 0.68% （n=9）. Conclusion： This method is accurate and reliable and suitable for quantitative assay of azithromycin tablets.
KEy WORDS HPLC； azithromycin tablets； assay
阿奇霉素（azithromycin）是第一個十五元环大环内酯类抗生素，也是第一个氮杂内酯类抗生素，相比红霉素，其最大的特点是对酸稳定。本品临床给药次数少，疗程短，被认为是一个很有效的大环内酯类抗生素，临床应用广泛，尤其适合于混合感染的治疗[1]。其制剂阿奇霉素片被列为国家基本药物，具有广泛的市场。本公司为了提高产品质量，对其处方及工艺进行了改进。为了保证分析检测结果准确、可靠，可有效地控制药品的内在质量，必须对所采用的分析方法进行验证。依据《中国药典》药品质量标准分析方法验证指导原则及《药品GMP指南》要求[2-3]，本研究对阿奇霉素片含量测定的HPLC法进行验证，并对每个验证参数设立了可接受标准。通过方法验证，确定该方法可以在本实验室用于阿奇霉素片含量的定量分析，确保检验结果的准确性。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
Waters e2695高效液相色谱仪（美国Waters公司）；XS205电子分析天平（瑞士Mettler公司）；DL-800B智能超声清洗器（上海之信仪器有限公司）；L600型台式低速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；阿奇霉素对照品（批号：130593-201301，含量：94.4%，中国食品药品检定研究院）；阿奇霉素原料药（批号：AIF-1609001，含量：94.34%，上海现代制药股份有限公司海门基地）；磷酸氢二钾、1-辛烷磺酸钠、磷酸二氢铵（HPLC纯，Alfa Aesar公司）；甲醇、乙腈（HPLC纯，美国默克公司）；磷酸（HPLC纯，美国TEDIA公司）；氨水（分析纯，上海凌峰化学试剂有限公司）。
1.2 方法
1.2.1 溶液配制
1）稀释液 磷酸二氢铵溶液（称取磷酸二氢铵1.73 g，加水1 000 ml溶解，用氨水调节pH至10.0±0.05）-甲醇-乙腈（7∶7∶6）。
2）对照品溶液 精密称取阿奇霉素对照品约26.2 mg，置于100 ml量瓶中，加稀释液适量使其溶解，再用稀释液定容，摇匀，作为对照品溶液。
3）供试品溶液 取本品20片，研磨成细粉，精密称取细粉约92 mg（约含阿奇霉素50 mg），置200 ml量瓶中，加入稀释液约150 ml，超声15 min，冷却至室温后加入稀释液定容，摇匀。取溶液适量，以6 000 r/min离心10 min，取上清液作为供试品溶液。 4）空白全辅料溶液 精密称取空白全辅料约39.6 mg，置200 ml量瓶中，余同供试品溶液操作，取上清液作为空白全辅料溶液。
5）线性测试溶液 精密称取阿奇霉素对照品约26.2 mg，置于50 ml量瓶中，加稀释液适量使其溶解，再用稀释液定容，摇匀，作为对照品贮备液。分别精密量取该溶液3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 ml置10 ml量瓶中，用稀释液稀释至刻度，摇匀，作为不同浓度的线性测试溶液。
6）回收率测试溶液 精密称取空白全辅料3份各39.6 mg，分别与阿奇霉素41.9、52.4、62.9 mg一起置于3個200 ml量瓶中，余同供试品溶液操作，配制成80%、100%和120%的回收率测试溶液各3份。
1.2.2 色谱条件
色谱柱为Waters XBridge C18柱（4.6 mm×75 mm，5μm），流动相为磷酸盐缓冲液（4.4 g磷酸氢二钾和0.5 g 1-辛烷磺酸钠溶解于1 000 ml水中，用磷酸调节pH至8.2）-甲醇-乙腈（8∶3∶9），检测波长210 nm，流速1.5 ml/min，柱温50 ℃，进样体积50 ml，进样时间：15 min。
2 结果
2.1 专属性试验
分别精密吸取空白溶剂（稀释液）、空白全辅料溶液、对照品溶液各50 ml，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果表明空白溶剂（稀释液）、空白全辅料溶液在阿奇霉素峰位置无杂质峰（图1中保留时间6.506 min），对阿奇霉素含量测定无干扰。
2.2 系统适用性试验
5次连续进样测定的主峰面积RSD为0.49%（应≤1.5%），对照品溶液主峰理论板数为4 574（应≥1 000），拖尾因子为1.42（应≤2.0）（表1）。结果表明系统重复性良好，系统适用性符合规定。
2.3 线性关系试验
以线性溶液浓度C为横坐标、阿奇霉素峰面积A为纵坐标进行线性回归，得回归方程A=3 220 442C+844，r=0.999 99，表明该方法在149.47～348.77 mg/ml浓度范围内，线性关系良好（表2）。
2.4 准确度试验（含量测定中加样回收率的检测）
取3种不同浓度的回收率测试溶液分别进样测试，每个浓度样品进行3次平行测试。回收率按外标法以峰面积的平均值计算。结果表明，平均回收率为100.7%（应为98.0%～102.0%），RSD为0.68%（应≤2.0%），均符合规定（表3）。
2.5 重复性试验
取阿奇霉素片171107批，按含量测定方法，配制6份供试品溶液进行检测，6份平行样的含量分别为100.98%、100.78%、99.34%、99.69%、99.84%、99.41%，平均含量为100.01%，RSD为0.71%（应≤2.0%），符合规定。
2.6 中间精密度试验
取阿奇霉素片171107批，由不同人在不同日期及不同仪器按含量测定方法进行检测，即2人各做3份，6次数据分别为99.69%、99.84%、99.41%、98.88%、98.19%、98.96%，平均含量为99.16%，RSD为0.62%（应≤2.0%），符合规定。
2.7 溶液的稳定性试验
对照品溶液和供试品溶液于室温放置0、4、8、12、16、20、24 h时分别进样测试，结果表明：对照品溶液和供试品溶液于室温下放置20 h内稳定，其主峰面积的RSD分别为0.50%，0.88%（应≤1.5%），符合规定。
2.8 耐用性
平行制备供试品溶液2份，每份进样2次，分别考察预定不同的有机相比例的流动相（①甲醇比例不动，盐相和乙腈比例±5%；②盐相比例不动，甲醇和乙腈比例±5%）、波长±2 nm、柱温±5 ℃、流速±0.2 ml/min条件下的系统适用性及含量。实验结果表明各条件波动范围内，对照品溶液主峰的理论板数均≥1 000、拖尾因子均≤2.0，符合要求；各条件下含量（n=6）的RSD均<1.5%（应≤1.5%）。试验结果表明，本方法的耐用性良好。
2.9 样品检测
取三批阿奇霉素片，按本法进行含量检测，结果分别为100.88%、98.92%、98.89%（应为90.0%～110.0%），均符合规定。
3 讨论
《中国药典》2005年版采用抗生素微生物检定法进行阿奇霉素的含量分析，尽管该法能真实体现该药品的抗菌活性，但检验周期较长、操作较繁琐。而HPLC法专属性强，灵敏度高，准确度和重复性好，省时方便，是阿奇霉素含量测定的有效手段[4-5]。
《中国药典》2015年版的含量检测方法[6]，需要进系统适用性溶液，且应与标准系统适用性图谱一致，故使用250 mm长柱，主峰出峰时间约为30 min，流动相配制过程对pH的要求较高。
潘强[4]、韩正爽等[5]的含量测定方法选用250 mm长柱，流动相组分中无甲醇，流速较低，以致检测时间延长，工作效率偏低。
本研究建立的方法参照美国药典方法[7-8]，选用75 mm长的短柱，使得主峰出峰时间提早到6～7 min，考虑空白辅料的影响，每针检测时间只需15 min，大大缩短检测时间，提高工作效率；且不需使用系统适用性对照品，系统适用性试验阿奇霉素对照品溶液主峰理论板数（应≥1 000），拖尾因子（应≤2.0）符合规定即可。含量测定的色谱条件与溶出度的一致，使得检验过程更加便捷。故该方法简便、快速，能有效地降低分析成本，减小实验室污染。并且本法用离心的方法获得供试品溶液，杜绝了使用过滤器带来的不利影响。同时，在检测中减少了不必要的稀释步骤，严格控制实验条件，在湿度符合要求的情况下，称量过程中由一人操作，避免多人操作带来的人为误差。因标准溶液的配制过程对阿奇霉素含量测定准确度的影响较大[9]，故本法可以通过加大对照品称样量，来减少不确定度对结果的影响，从而更好地控制药物分析的测量结果。
参考文献
[1] 商鼎. 阿奇霉素片的溶出度研究[J]. 上海医药， 2017， 38（13）： 63-66.
[2] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典（2015年版）四部[M]. 北京： 中国医药科技出版社， 2015： 374-377.
[3] 国家食品药品监督管理局药品认证管理中心. 药品GMP指南： 质量控制实验室与物料系统[M]. 北京： 中国医药科技出版社， 2011： 129-143.
[4] 潘强. HPLC法测定阿奇霉素片的含量[J]. 中国药品标准， 2009， 10（4）： 301-303.
[5] 韩振爽， 李玮玮. 高效液相色谱法测定阿奇霉素片中阿奇霉素含量[J]. 天津药学， 2013， 25（1）： 15-16.
[6] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典 （2015年版） 二部[M]. 北京： 中国医药科技出版社， 2015： 561-561.
[7] The United States Pharmacopeia Convention. Azithromycin tablets[EB/OL]. [2018-03-22]. http：//www.drugfuture.com/ Pharmacopoeia/usp36/PDF/1264-1266.pdf.
[8] The United States Pharmacopeia Convention. Azithromycin tablets[EB/OL]. [2018-03-22]. http：// www.drugfuture.com/Pharmacopoeia/USP40/download. aspx？filename=850Azithromycin%20Tablets.
[9] 张竹. 高效液相色谱法测定阿奇霉素片含量的不确定度分析[J]. 中国药物经济学， 2016， 11（12）： 22-25.
关键词 高效液相色谱法 阿奇霉素片 含量
中图分类号：R927.2 文献标志码：A 文章编号：1006-1533（2018）17-0076-04
Determination of the content of azithromycin tablets by HPLC
WU Qingyi*， QU Yanping， ZHOU Xuru
（Shanghai Shyndec Pharmaceutical Co.， Ltd.， Shanghai 200137， China）
ABSTRACT Objective： To validate the method for determination of the content of azithromycin tablets by HPLC. Methods： HPLC was carried out on a Waters XBridge C18 column （4.6 mm×75 mm， 5 μm） with a mixture of phosphate buffermethanol-acetonitrile （8：3：9） as the mobile phase at the detection wavelength of 210 nm， the flow velocity of 1.5 ml/min and the column temperature of 50 ℃ with sample volume of 50 μl. Results： The specificity， system applicability， repeatability， intermediate precision， stability of the solution and durability of this method could meet the criteria for validation， the standard curve of azithromycin showed good linearity in the range of 149.47-348.77 mg/ml with the correlation coefficient （r） of 0.999 99. The average recovery of samples was 100.7% with RSD of 0.68% （n=9）. Conclusion： This method is accurate and reliable and suitable for quantitative assay of azithromycin tablets.
KEy WORDS HPLC； azithromycin tablets； assay
阿奇霉素（azithromycin）是第一個十五元环大环内酯类抗生素，也是第一个氮杂内酯类抗生素，相比红霉素，其最大的特点是对酸稳定。本品临床给药次数少，疗程短，被认为是一个很有效的大环内酯类抗生素，临床应用广泛，尤其适合于混合感染的治疗[1]。其制剂阿奇霉素片被列为国家基本药物，具有广泛的市场。本公司为了提高产品质量，对其处方及工艺进行了改进。为了保证分析检测结果准确、可靠，可有效地控制药品的内在质量，必须对所采用的分析方法进行验证。依据《中国药典》药品质量标准分析方法验证指导原则及《药品GMP指南》要求[2-3]，本研究对阿奇霉素片含量测定的HPLC法进行验证，并对每个验证参数设立了可接受标准。通过方法验证，确定该方法可以在本实验室用于阿奇霉素片含量的定量分析，确保检验结果的准确性。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
Waters e2695高效液相色谱仪（美国Waters公司）；XS205电子分析天平（瑞士Mettler公司）；DL-800B智能超声清洗器（上海之信仪器有限公司）；L600型台式低速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；阿奇霉素对照品（批号：130593-201301，含量：94.4%，中国食品药品检定研究院）；阿奇霉素原料药（批号：AIF-1609001，含量：94.34%，上海现代制药股份有限公司海门基地）；磷酸氢二钾、1-辛烷磺酸钠、磷酸二氢铵（HPLC纯，Alfa Aesar公司）；甲醇、乙腈（HPLC纯，美国默克公司）；磷酸（HPLC纯，美国TEDIA公司）；氨水（分析纯，上海凌峰化学试剂有限公司）。
1.2 方法
1.2.1 溶液配制
1）稀释液 磷酸二氢铵溶液（称取磷酸二氢铵1.73 g，加水1 000 ml溶解，用氨水调节pH至10.0±0.05）-甲醇-乙腈（7∶7∶6）。
2）对照品溶液 精密称取阿奇霉素对照品约26.2 mg，置于100 ml量瓶中，加稀释液适量使其溶解，再用稀释液定容，摇匀，作为对照品溶液。
3）供试品溶液 取本品20片，研磨成细粉，精密称取细粉约92 mg（约含阿奇霉素50 mg），置200 ml量瓶中，加入稀释液约150 ml，超声15 min，冷却至室温后加入稀释液定容，摇匀。取溶液适量，以6 000 r/min离心10 min，取上清液作为供试品溶液。 4）空白全辅料溶液 精密称取空白全辅料约39.6 mg，置200 ml量瓶中，余同供试品溶液操作，取上清液作为空白全辅料溶液。
5）线性测试溶液 精密称取阿奇霉素对照品约26.2 mg，置于50 ml量瓶中，加稀释液适量使其溶解，再用稀释液定容，摇匀，作为对照品贮备液。分别精密量取该溶液3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 ml置10 ml量瓶中，用稀释液稀释至刻度，摇匀，作为不同浓度的线性测试溶液。
6）回收率测试溶液 精密称取空白全辅料3份各39.6 mg，分别与阿奇霉素41.9、52.4、62.9 mg一起置于3個200 ml量瓶中，余同供试品溶液操作，配制成80%、100%和120%的回收率测试溶液各3份。
1.2.2 色谱条件
色谱柱为Waters XBridge C18柱（4.6 mm×75 mm，5μm），流动相为磷酸盐缓冲液（4.4 g磷酸氢二钾和0.5 g 1-辛烷磺酸钠溶解于1 000 ml水中，用磷酸调节pH至8.2）-甲醇-乙腈（8∶3∶9），检测波长210 nm，流速1.5 ml/min，柱温50 ℃，进样体积50 ml，进样时间：15 min。
2 结果
2.1 专属性试验
分别精密吸取空白溶剂（稀释液）、空白全辅料溶液、对照品溶液各50 ml，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果表明空白溶剂（稀释液）、空白全辅料溶液在阿奇霉素峰位置无杂质峰（图1中保留时间6.506 min），对阿奇霉素含量测定无干扰。
2.2 系统适用性试验
5次连续进样测定的主峰面积RSD为0.49%（应≤1.5%），对照品溶液主峰理论板数为4 574（应≥1 000），拖尾因子为1.42（应≤2.0）（表1）。结果表明系统重复性良好，系统适用性符合规定。
2.3 线性关系试验
以线性溶液浓度C为横坐标、阿奇霉素峰面积A为纵坐标进行线性回归，得回归方程A=3 220 442C+844，r=0.999 99，表明该方法在149.47～348.77 mg/ml浓度范围内，线性关系良好（表2）。
2.4 准确度试验（含量测定中加样回收率的检测）
取3种不同浓度的回收率测试溶液分别进样测试，每个浓度样品进行3次平行测试。回收率按外标法以峰面积的平均值计算。结果表明，平均回收率为100.7%（应为98.0%～102.0%），RSD为0.68%（应≤2.0%），均符合规定（表3）。
2.5 重复性试验
取阿奇霉素片171107批，按含量测定方法，配制6份供试品溶液进行检测，6份平行样的含量分别为100.98%、100.78%、99.34%、99.69%、99.84%、99.41%，平均含量为100.01%，RSD为0.71%（应≤2.0%），符合规定。
2.6 中间精密度试验
取阿奇霉素片171107批，由不同人在不同日期及不同仪器按含量测定方法进行检测，即2人各做3份，6次数据分别为99.69%、99.84%、99.41%、98.88%、98.19%、98.96%，平均含量为99.16%，RSD为0.62%（应≤2.0%），符合规定。
2.7 溶液的稳定性试验
对照品溶液和供试品溶液于室温放置0、4、8、12、16、20、24 h时分别进样测试，结果表明：对照品溶液和供试品溶液于室温下放置20 h内稳定，其主峰面积的RSD分别为0.50%，0.88%（应≤1.5%），符合规定。
2.8 耐用性
平行制备供试品溶液2份，每份进样2次，分别考察预定不同的有机相比例的流动相（①甲醇比例不动，盐相和乙腈比例±5%；②盐相比例不动，甲醇和乙腈比例±5%）、波长±2 nm、柱温±5 ℃、流速±0.2 ml/min条件下的系统适用性及含量。实验结果表明各条件波动范围内，对照品溶液主峰的理论板数均≥1 000、拖尾因子均≤2.0，符合要求；各条件下含量（n=6）的RSD均<1.5%（应≤1.5%）。试验结果表明，本方法的耐用性良好。
2.9 样品检测
取三批阿奇霉素片，按本法进行含量检测，结果分别为100.88%、98.92%、98.89%（应为90.0%～110.0%），均符合规定。
3 讨论
《中国药典》2005年版采用抗生素微生物检定法进行阿奇霉素的含量分析，尽管该法能真实体现该药品的抗菌活性，但检验周期较长、操作较繁琐。而HPLC法专属性强，灵敏度高，准确度和重复性好，省时方便，是阿奇霉素含量测定的有效手段[4-5]。
《中国药典》2015年版的含量检测方法[6]，需要进系统适用性溶液，且应与标准系统适用性图谱一致，故使用250 mm长柱，主峰出峰时间约为30 min，流动相配制过程对pH的要求较高。
潘强[4]、韩正爽等[5]的含量测定方法选用250 mm长柱，流动相组分中无甲醇，流速较低，以致检测时间延长，工作效率偏低。
本研究建立的方法参照美国药典方法[7-8]，选用75 mm长的短柱，使得主峰出峰时间提早到6～7 min，考虑空白辅料的影响，每针检测时间只需15 min，大大缩短检测时间，提高工作效率；且不需使用系统适用性对照品，系统适用性试验阿奇霉素对照品溶液主峰理论板数（应≥1 000），拖尾因子（应≤2.0）符合规定即可。含量测定的色谱条件与溶出度的一致，使得检验过程更加便捷。故该方法简便、快速，能有效地降低分析成本，减小实验室污染。并且本法用离心的方法获得供试品溶液，杜绝了使用过滤器带来的不利影响。同时，在检测中减少了不必要的稀释步骤，严格控制实验条件，在湿度符合要求的情况下，称量过程中由一人操作，避免多人操作带来的人为误差。因标准溶液的配制过程对阿奇霉素含量测定准确度的影响较大[9]，故本法可以通过加大对照品称样量，来减少不确定度对结果的影响，从而更好地控制药物分析的测量结果。
参考文献
[1] 商鼎. 阿奇霉素片的溶出度研究[J]. 上海医药， 2017， 38（13）： 63-66.
[2] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典（2015年版）四部[M]. 北京： 中国医药科技出版社， 2015： 374-377.
[3] 国家食品药品监督管理局药品认证管理中心. 药品GMP指南： 质量控制实验室与物料系统[M]. 北京： 中国医药科技出版社， 2011： 129-143.
[4] 潘强. HPLC法测定阿奇霉素片的含量[J]. 中国药品标准， 2009， 10（4）： 301-303.
[5] 韩振爽， 李玮玮. 高效液相色谱法测定阿奇霉素片中阿奇霉素含量[J]. 天津药学， 2013， 25（1）： 15-16.
[6] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典 （2015年版） 二部[M]. 北京： 中国医药科技出版社， 2015： 561-561.
[7] The United States Pharmacopeia Convention. Azithromycin tablets[EB/OL]. [2018-03-22]. http：//www.drugfuture.com/ Pharmacopoeia/usp36/PDF/1264-1266.pdf.
[8] The United States Pharmacopeia Convention. Azithromycin tablets[EB/OL]. [2018-03-22]. http：// www.drugfuture.com/Pharmacopoeia/USP40/download. aspx？filename=850Azithromycin%20Tablets.
[9] 张竹. 高效液相色谱法测定阿奇霉素片含量的不确定度分析[J]. 中国药物经济学， 2016， 11（12）： 22-25.