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摘要 目的：探討寿胎丸治疗早发性卵巢功能不全的网络药理学特征。方法：利用中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）、中医分子机制生物信息学分析工具（BATMAN-TCM）、GeneCards数据库获得寿胎丸活性成分及疾病靶点，利用Venn在线工具筛选二者交集基因，依托STRING数据库，采用Cytoscape 3.7.0软件构建活性成分-靶点网络图和靶点间蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络图;通过DAVID数据库对交集基因进行基因本体（GO）富集分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析，构建活性成分-靶点-关键通路网络图来展示寿胎丸治疗早发性卵巢功能不全的相关作用机制。结果：筛选出寿胎丸活性成分21个，成分靶点591个及疾病靶点2 438个，主要化合物有槲皮素、赖氨酸等。获得交集基因共67个，寿胎丸可能通过过氧化氢酶（CAT）、表皮生长因子（EGF）等靶点发挥作用，GO分析结果显示，其生物过程主要是药物反应，细胞组分主要是血红素结合反应，分子功能主要集中在线粒体基质。主要涉及的相关信号通路有缺氧诱导因子1（HIF-1）信号通路，磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（PI3K-AKT）信号通路。结论：寿胎丸的多种活性成分可能作用于CAT、EGF等相关靶点，通过HIF-1、PI3K/AKT等主要信号通路，多靶点、多通路的发挥治疗早发性卵巢功能不全的作用。
关键词 寿胎丸;早发性卵巢功能不全;网络药理学;活性成分;靶点;信号通路;作用机制
Abstract Objective：To investigate the network pharmacology of Shou Tai Pills in the treatment of premature ovarian insufficiency.Methods：Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform（TCMSP），Bioinformatics Analysis Tool for Molecular mechanism of Traditional Chinese Medicine（BATMAN-TCM） and GeneCards database were used to obtain the active ingredient and disease targets of Shou Tai Pills; Venn online tools were used to screen both intersection genes; relying on the STRING database，Cytoscape 3.7.0 software were used to build active ingredient-targets between network diagram and the target protein-protein interaction（PPI） network diagram; Gene ontology（GO） enrichment analysis and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG） pathway enrichment analysis were performed on the intersection genes by David database，and a network diagram of active ingredients-target-key pathway was constructed to demonstrate the relevant mechanism of Shou Tai Wan in the treatment of premature ovarian insufficiency.Results：A total of 21 active components，591 components targets and 2 438 disease targets were screened out，the main compounds were quercetin，lysine，etc.A total of 67 overlapping genes were obtained，suggesting that Shou Tai Wan may act through catalase（CAT），epidermal growth factor（EGF） and other targets.GO analysis results showed that the biological process of Shou Tai Wan was mainly drug reaction，the cell component was mainly heme binding reaction，and the molecular function was mainly concentrated in mitochondrial matrix.The major related signaling pathways involved are hypoxia inducible factor 1（HIF-1） signaling pathway and phosphatidylinositol 3 kinase/protein kinase B（PI3K-AKT） signaling pathway.Conclusion：A variety of active ingredients of Shou Tai Pills may act on CAT，EGF and other related targets，and play a role in the treatment of premature ovarian insufficiency through HIF-1，PI3K/AKT and other major signaling pathways. Keywords Shou Tai Pills; Premature ovarian insufficiency; Network pharmacology; Active ingredients; Target; Signal path; Action mechanism
中图分类号：R285文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.18.003
早发性卵巢功能不全（Premature Ovarian Insufficiency，POI）是指女性在40岁前出现的一种生殖内分泌疾病，具有代谢紊乱和生殖障碍的特征。常伴有月经紊乱、生育力下降、烦躁失眠、潮热汗出及性欲减退等，其发病与卵巢衰老过程有关，根据欧洲人类生殖与胚胎学会（ESHRE）专家共识所规范的诊断标准，当月经稀发或停经大于4个月，且伴有至少2次血清基础卵泡刺激素（FSH）>25 IU/L（间隔>4周）或一次性FSH>40 IU/L即可诊断POI。POI的发病率为1%～5%，发病原因暂不明确，可能与遗传、免疫、心理、医源性因素和环境感染等有关。目前，POI的主要治疗方法为激素替代治疗（HRT），其他辅助方法有免疫治疗、干细胞治疗、促生育治疗、基因治疗等[1]，虽然在短期治疗中有一定的临床疗效和优点，但在技术方法和相关伦理道德的标准上具有一定的局限所在。
中医学无此病名，但根据早发性卵巢功能不全的主要特征，可以将其归于“月经过少”“闭经”“不孕”“经断前后诸症”等病的范畴。《黄帝内经》载：“女子七岁，肾气盛……七七，任脉虚，太冲脉衰，天癸竭，地道不通，故形坏而无子也。”《傅青主女科》曰：“经水出诸肾。”中医认为，肾为先天之本，主司人体生长发育与生殖，调控着女子月经来潮及养精种子，是故肾气充盛，则天癸盛，肾气衰少，则天癸竭。故历代医家认为早发性卵巢功能不全的发生总归于肾虚，导致肾-天癸-冲任-胞宫轴功能失衡，兼以脾虚、气血两虚、肝郁、血瘀、痰浊等，从而致病。故临床多以补肾为基本法，以治肾为要，辅以疏肝健脾、活血化瘀等，从扶正补虚这一角度治疗POI。
寿胎丸是治疗胎漏、胎动不安的经典方剂，由菟丝子、续断、桑寄生、阿胶组成，源于清代名医张锡纯《医学衷中参西录》，具有补肾、固冲、安胎之效。方中菟丝子为补肾安胎之要药，故重用为君;臣以续断、桑寄生补益肝肾，调理冲任;佐使血肉有情之品阿胶以滋养阴血，使冲任血旺，共奏补肾固冲安胎之效。临床常使用寿胎丸治疗相关妇科疾病，并具有一定疗效[2]，但其作用机制尚不明确，缺乏现代药理学依据，此外中药及其复方成分的复杂性也是制约系统研究其具体活性成分及相关信号通路、靶点的关键因素。网络药理学是网络数据挖掘及分析的一种方法，基于现代生物信息技术，通过对药物、活性成分、作用靶点、疾病间的相互关系，发掘及阐述中药治疗相关疾病的潜在作用机制，在中医证候、方剂配伍规律及不良反应等方面的研究中发挥积极作用，其能从客观角度帮助我们进行中医药的研究[3]。故本研究将通过网络药理学方法探讨寿胎丸治疗POI的作用机制，为其提供基础生物学信息依据，对临床治疗POI提供新的思路。
1 资料与方法
1.1 寿胎丸活性成分及靶点蛋白的筛选 利用TCMSP（http：//tcmspw.com/tcmsp.php），搜索菟丝子、续断、桑寄生的主要化学成分，对比药物动力学参数（ADME），将其标准设定为口服生物利用度（OB）≥30%、类药性（DL）≥0.18，初步挑选寿胎丸的潜在药物活性化合物，依托BATMAN-TCM数据库（http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）检索与阿胶相关的有效化学成分，以相关阈值Score cutoff≥20，P值≤0.001作为限定条件初步筛选阿胶活性化合物。选取具有明确作用靶点的活性成分作为寿胎丸候选活性化合物，同时，提取它们的蛋白质靶点，并通过UniProt数据库（https：//www.uniprot.org/）规范靶点蛋白名称。
1.2 POI相关靶点的筛选 在GeneCards数据库（https：//www.genecards.org/）中检索与早发性卵巢功能不全疾病相关的靶点基因，并记录靶点基因的Score值，将Score值大于中位值的目标靶点作为早发性卵巢功能不全的候选靶点。
1.3 构建寿胎丸主要活性成分-疾病靶点网络图 为明确寿胎丸活性成分靶点与早发性卵巢功能不全疾病靶点间的关系，将已获得的寿胎丸活性成分靶点与POI疾病靶点，利用Venn在线工具（http：//bioinformatics.psb.u-gent.be/webtools/Venn/）繪制韦恩图，获得交集基因。将其通过Cytoscape 3.7.0软件可视化展示寿胎丸主要活性成分-疾病靶点网络图。
1.4 构建寿胎丸与POI交集基因的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络 将交集基因导入STRING数据库（https：//string-db.org），将生物种类设定为“Homo Sapiens”，最小相互作用阈值设定为“medium confidence>0.4”，同时隐藏游离点，其余设置均为默认，构建PPI网络图，并通过Cytoscape3.7.0软件进行可视化展示。
1.5 交集基因的富集分析 为阐明寿胎丸治疗早发性卵巢功能不全靶点在信号通路中的作用，利用DAVID数据库（https：//david.ncifcrf.gov/），对所提取的交集基因进行基因本体（Gene Ontology，GO）富集分析和京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析，设定P<0.001，P值越小，则富集结果显著性越高，将GO及KEGG分析结果的P值由小到大排序，并将分析结果通过微生信在线作图平台（http：//www.bioinformatics.com.cn/）进行可视化展示。 1.6 构建活性成分-靶点-关键通路网络图 将KEGG通路富集分析中前15条关键通路与寿胎丸的活性成分、作用靶点相对应，通过Cytoscape3.7.0软件构建相关网络图，直观地展现寿胎丸治疗早发性卵巢功能不全的复杂网络关系，阐述寿胎丸对治疗早发性卵巢功能不全的潜在作用机制。
2 结果
2.1 寿胎丸有效活性成分及作用靶点蛋白的筛选结果 通过TCMSP及BATMAN-TCM数据库检索获得菟丝子活性成分11个，桑寄生活性成分2个，续断活性成分8个，阿胶活性成分3个，合并去重后获得寿胎丸活性成分21个。见表1。并通过TCMSP查询这21个活性成分作用的靶点信息，合并去重后得到寿胎丸的靶点数目为591个，将其通过UniProt数据库经行规范化命名，最终得到寿胎丸的相关基因靶点。
2.2 POI靶点的收集结果 通過GeneCards数据库获取“POI”及“Primary Ovarian Insufficiency”的相关靶点基因，共得到POI靶点基因5 092个，Primary Ovarian Insufficiency靶点基因227个，将靶点基因Score值从小到大排列，取其中位数4.57，将其大于4.57的靶点基因选取，合并去重后得到POI相关靶点基因2 438个。
2.3 寿胎丸主要活性成分-疾病靶点图的构建结果 利用Venn在线工具绘制韦恩图，可以得到其交集基因67个，将其交集基因对比寿胎丸活性成分作用靶点，可以得到寿胎丸的有效活性成分数目为6个。见图1。通过Cytoscape3.7.0软件，导入寿胎丸、活性成分、交集基因、POI的相关信息，制作活性成分-疾病靶点网络图。见图2。以节点表示药物、活性成分、疾病和交集基因，节点之间的以边相连;活性成分-疾病靶点网络包含节点75个，其中药物节点1个，疾病节点1个，活性成分节点6个，靶点基因节点67个，寿胎丸有效活性成分与靶点基因的边106条，活性物质节点连接度平均值为17.7，节点度值越大，表示该节点在网络中的地位越重要。故选取节点连接度大于平均值的活性成分作为候选，其中最高的是槲皮素（Quercetin，节点连接度为56），其次是赖氨酸（Lysine，节点连接度为36）。这表明它们在活性成分-疾病靶点网络图占有核心地位，故此可预测槲皮素和赖氨酸是寿胎丸治疗POI的主要活性成分。
2.4 PPI网络的构建及分析结果 寿胎丸活性成分与早发性卵巢功能不全交集基因的PPI网络图。见图3。该网络图含节点67个，节点度值越高，颜色越深。经软件分析可得平均节点度值为7.82，选取节点度值最多的前20个靶点基因作为其核心基因。见图4。寿胎丸可能通过过氧化氢酶（CAT）、表皮生长因子（EGF）、内皮型一氧化氮合酶（NOS3）、激活蛋白1（JUN）等关键靶点发挥治疗POI的作用。
2.5 交集基因的富集分析
2.5.1 GO功能富集 将交集基因导入DAVID数据库进行GO分析，共得到相关条目258个，其中生物过程（BP）199个，细胞组分（CC）22个，分子功能（MF）37个，主要涉及药物反应、血红素结合反应等，其主要集中在线粒体基质。见表2、图5。
2.5.2 KEGG通路富集分析 将寿胎丸和早发性卵巢功能不全的交集基因通过DAVID数据库进行富集分析，导出分析结果，共得到63条KEGG信号通路，将其中P值最小的前15条信号通路作为寿胎丸治疗POI的主要信号通路。见表3。并通过微生信在线作图平台进行可视化展示。见图6。图中P值代表该信号通路的富集程度，P值越小，则富集程度越大，颜色越红，反之P值越大则富集程度越小，颜色越绿。气泡的大小代表所富集的基因个数。参与寿胎丸治疗作用的信号通路主要有HIF-1信号通路、精氨酸生物合成（Arginine biosynthesis）信号通路、PI3K-AKT信号通路、炎症性肠病（Inflammatory Bowel Disease）信号通路、非受体酪氨酸激酶家族（JAK-STAT）信号通路等。由此可见，寿胎丸是通过多靶点，多通路来干预POI从而达到治疗目的。
2.6 活性成分-靶点-信号通路网络图构建结果 将前面得到的寿胎丸活性成分、潜在作用靶点及KEGG筛选出来的前15条信号通路一一对应，经Cytoscape3.7.0软件制作活性成分-靶点-关键通路图。见图7。寿胎丸治疗POI涉及多个活性成分、靶点及信号通路。主要活性成分包含槲皮素、赖氨酸等，主要靶点为CAT、JUN、EGF、NOS3等，涉及的主要信号通路有HIF-1、PI3K-AKT、炎症性肠病、精氨酸生物合成、JAK-STAT信号通路等。见图7。
3 讨论
近年来早发性卵巢功能不全的发病率逐渐上升，增加了如骨质疏松、糖尿病、高血压及心脑血管等疾病的发生风险，严重影响了育龄期妇女的身心健康及生命质量。ESHRE将“原发性”改为“早发性”[1]，为的是及时对POI作出早期诊断及早期治疗。现国内外治疗POI的主要方法为HRT，通过补充体内所缺乏的性激素，调节下丘脑-垂体-卵巢（HPO）轴的功能起到一定作用，但停药后常易反复，并增加乳腺癌、子宫内膜癌、中风等相关疾病的发病危险，在POI的长期治疗及管理中存在一定缺陷，且具有一定的禁忌证[4]。其他辅助治疗方法虽具有一定优势，但其治疗方法较为复杂，所需费用也较多，且存在一定的伦理问题，临床上对此类方法的应用较为有限。中药对调节女性内分泌功能颇有疗效，有研究发现中药可以通过其拟雌激素作用及调节内分泌功能促进卵巢功能的恢复[5]，维持肾-天癸-冲任-胞宫轴功能的平衡，这与现代医学HRT治疗早发性卵巢功能不全有着一定的趋同性，且较之不良反应低，花费少，故在临床上更易被患者所接受。对于治疗POI的长期管理更具优势。寿胎丸是治疗妇科疾病的常用基础方之一，具有补肾固冲助孕安胎之功，现代药理学研究显示，菟丝子的主要药理学作用包括抗氧化、抗衰老、抑制细胞凋亡、调节内分泌、改善生殖功能等[6]，桑寄生的主要药理作用有抗氧化、降血糖、降血脂等[7]，续断的主要药理学作用包括抗衰老、保护神经等[8]，阿胶的主要药理作用有抗氧化、增强免疫、抗疲劳等作用[9]。由于生育力降低贯穿POI的全过程，故对四者合方的寿胎丸治疗POI的研究具有一定的现实意义。相关研究发现寿胎丸在临床上治疗流产、不孕、月经病等妇科相关疾病疗效较好[2]，但其相关配伍和药理学研究较少，因此本研究通过网络药理学的相关技术及方法，基于现代生物信息数据，对寿胎丸治疗早发性卵巢功能不全的潜在作用机制进行一定的深入研究。 3.1 寿胎丸活性成分与相关靶点的分析 本研究共筛选出寿胎丸潜在活性成分21种，其中部分化合物已通过研究证实具有调节卵巢功能、延缓其衰老的作用。寿胎丸的核心化学物质槲皮素具有抗氧化、抗炎等药理作用[10]，黄长盛等[11]发现，槲皮素具有拟雌激素活性，对卵巢功能衰退的小鼠有一定的治疗效果，同时也可以改善卵泡质量，促进各级卵泡的发育及卵巢颗粒细胞的增殖，增加体内雌二醇（E2）的分泌，升高AMH数值，减少FSH、黄体生成素（LH）的含量，进而恢复卵巢功能。雌激素缺乏会导致钙的流失，故POI患者都或多或少伴随着骨密度的降低。闵珺[12]发现槲皮素可以有效改善去卵巢小鼠的骨代谢，通过抑制破骨细胞对骨基质的吸收，增强成骨细胞分化活性，从而提高骨密度，从根本上改善因雌激素缺乏导致的骨质疏松的症状。有研究发现，在一定條件下可以通过补充槲皮素来减少卵巢颗粒细胞凋亡，增高CAT等抗氧化物质的含量，提高机体抗氧化能力，减轻卵巢组织氧化损伤，进而维持原始卵泡正常形态，保护卵巢功能[13]。寿胎丸的另一个核心化合物质——赖氨酸，是维持正常生命功能的人体必需氨基酸之一，具有增强免疫、促进发育、营养神经等功能。阿孜古丽·要力瓦斯[14]通过实验发现赖氨酸可以通过增强卵巢早衰小鼠的免疫力来改善卵巢功能，缓解卵巢功能衰退的进程。Yang等[15]发现赖氨酸可以促进卵泡的发育，提高E2含量，增强卵泡支持卵母细胞成熟的能力。本研究发现，槲皮素及赖氨酸在其网络图中具有重要地位，这表明这2种化合物在寿胎丸维持卵巢功能，延缓其衰老的治疗过程中起着主要作用，其他化合物如精氨酸（Arginine）、芝麻素（Sesamin）等起到辅助作用。这几种物质可能是寿胎丸治疗POI的主要有效成分，但目前对于这几种活性成分的研究较少，缺少对其具体的相关作用机制、作用途径的研究，故有待我们进一步的研究探讨。本研究发现，寿胎丸可能通过CAT、EGF、JUN、NOS3等关键靶点发挥治疗作用，早发性卵巢功能不全的发生有多靶点、多生物过程及多信号通路的参与。目前相关研究发现，CAT是细胞叉形头转录因子1（FoxO1）信号通路的下游靶点，参与细胞的氧化应激（OS）、细胞凋亡过程，当卵巢发生再灌注损伤导致OS发生时，CAT含量的增加会增强卵巢抗氧化能力，减轻OS对卵巢的破坏，抑制细胞凋亡，并提高成骨细胞的增殖，延缓骨质疏松，当CAT含量异常时，则会导致卵泡的凋亡，造成卵巢功能衰竭，并导致骨密度的下降[16-18]。EGF是一种小分子多肽，其正常表达可以激活细胞外信号调节蛋白激酶（ERK1/2）、PI3K等下游信号通路，并协同FSH，有效降低卵巢颗粒细胞的凋亡，减轻卵巢颗粒细胞的损伤，并增强机体抗氧化能力，为卵母细胞的生长、成熟及发育提供一个适当的环境，有保护卵巢颗粒细胞及卵母细胞的作用[19-21]，从而促进E2的分泌，维持卵巢功能[22]。目前研究发现JUN在细胞生长发育、细胞凋亡、免疫调节等方面发挥重要作用，但相关研究较少，其作用机制尚未明确[23]。由于POI的发病可能与自身免疫类疾病有关，如甲减患者中抗甲状腺抗体会引起卵巢功能受损[24]，原发性慢性肾上腺皮质功能减退症患者抗肾上腺皮质抗体阳性会导致卵巢功能的衰退[25]，故猜测JUN可能是通过促进卵巢颗粒细胞的生长发育、抑制细胞凋亡、调节自身相关免疫系统疾病的相关过程，起到间接治疗POI的作用。Taguchi等[26]发现NOS3的正常表达可以在一定程度上改善子宫内膜容受性，提高子宫内膜局部组织的血供，利于胚胎着床，增加妊娠概率，从而改善早发性卵巢功能不全患者的生育功能。由此可见，寿胎丸可能通过以上核心靶点，通过增强细胞抗氧化能力、减轻细胞凋亡，调节免疫、促进生育等方面来发挥治疗POI的作用。
3.2 寿胎丸GO功能富集分析 寿胎丸治疗POI涉及多种生物过程、细胞组分及分子功能。生物过程主要涉及药物反应、脂多糖反应、过氧化氢生物合成、过氧化氢反应等。其中，过氧化氢反应与POI的发生有着密切关系。相关研究发现，FSH具有调节窦卵泡抗氧化应激的能力，其含量与总氧化剂状态、OS指数正相关，当FSH上调的抗氧化防御机制失衡而撤退，或暴露于活性氧（ROS）时，ROS会进一步通过OS过程激活下游信息分子，引起卵泡闭锁，降低卵泡质量及数量，同时，体内过多的过氧化氢会严重抑制LH的敏感性及类固醇的产生，通过影响体内类固醇代谢导致机体甾体合成途径受阻，导致颗粒细胞分泌E2减少，从上游进一步导致卵巢功能的破坏[27-30]。当机体处于OS状态时，通过添加抗氧化物质可以显著提高CAT、超氧化物歧化酶（SOD）活性，降低卵巢ROS水平，从而保护卵巢的正常功能，减少POI的发生[31-32]。细胞组分主要与血红素结合反应相关，该反应通过血红素结合蛋白（Hpx）的表达来起到抗氧化、调节免疫反应、调控信号通路的作用[33]。由于卵巢中含有丰富的血供，Hpx在血液中可以诱导相关酶的基因表达，钝化ROS，并通过其降解产物如胆绿素等来调节OS[34]，另一方面，在血红素促脂质过氧化反应过程，Hpx复合物可以阻断其反应发生，从而有效减少血红素带来的细胞氧化损伤[35]。邓玉洁等[36]发现多芳香烃暴露对卵巢颗粒细胞基因表达、生长发育和细胞间的信号转导等有影响，可损伤卵母细胞并使生长卵泡发生闭锁，导致组织发生损伤效应，而Hpx的表达会随多环芳烃暴露程度的加重而增加，故可以检测Hpx指标来作为机体化学暴露的指标之一，对预测POI的发生提供了相关指标[37]。分子功能的发生主要集中在线粒体基质，线粒体功能的异常常伴随着人类疾病及衰老的发生，同时也是细胞氧化应激发生的主要场所。相关研究发现线粒体功能异常与卵巢衰老密切相关，当卵巢衰老过程发生时，常伴随着卵母细胞线粒体功能及结构的异常[38]。王博[39]通过实验发现线粒体受外来化学物质干扰时，其膜电势会降低，同时抑制线粒体复合物I的活性，诱导线粒体发生氧化应激，破坏卵巢功能，而补肾中药可以有效改善POI小鼠卵母细胞线粒体形态、数量、分布及其活力水平，调节激素水平和氧化应激反应，进而恢复卵巢功能[40]，所以可以通过改善线粒体功能，增加线粒体数量来维持卵母细胞的正常功能，延缓POI的发生。以上均表明，寿胎丸治疗POI可能涉及多种生物过程、细胞组分及相应分子功能。 3.3 关键信号通路的相关机制分析 HIF-1信号通路是POI的核心通路之一。HIF-1是组织细胞缺氧状态下广泛存在的一种转录因子，在机体氧化应激过程中起着关键作用。HIF-1信号通路可以由HIF-1的异常表达而被激活，从而诱导卵巢中HIF-1αmRNA和蛋白表达的增加，并特异性表达于卵巢颗粒细胞，且与雌激素受体的表达正相关，而雌激素受体主要存在于卵囊泡膜细胞，这表明HIF-1信号通路可能直接作用于卵巢[41-42]。相关研究表明，温经汤可以参与OS过程，纠正局部组织缺氧状态，调控HIF-1信号通路的表达，防止卵巢早衰[43]。PI3K-AKT信号通路是广泛表达于机体各处的基础信号通路之一，同时也是细胞增殖、凋亡最主要的传导通路之一。有研究发现，卵母细胞中存在大量的PI3K和AKT，PI3K-AKT信号通路参与调节卵母细胞生长、原始卵泡发育以及颗粒细胞的增殖、分化[44]。当其正常表达时，可以促进颗粒细胞的增殖，维持卵巢的正常功能，同时也能与分布在卵巢颗粒细胞的特异性受体结合，增加雌孕激素的分泌，延缓其衰老。当PI3K受到缺氧、细胞因子等细胞外信号刺激时可被过度激活，进而诱导AKT，通过调控其下游哺乳动物雷帕霉素（mTOR）来诱导卵母细胞的闭锁，而如果PI3K的信号终止，也可引起原始卵泡的提前发育，使其过快凋亡，从而导致POI的发生[45-46]。
本研究基于网络药理学相关方法，将现代生物学信息技术与传统中医药理论相结合，对寿胎丸组成药物的化合物、有效活性成分、靶点、疾病靶点及信号通路进行分析，运用相关数据库及信息软件构建活性成分-疾病靶点网络图，直观体现了寿胎丸治疗POI是通过多成分、多靶点的方式发挥其功效，同时PPI网络图也反映了该药治疗POI相关各靶点间的联系程度，并结合GO富集分析与KEGG信号通路分析，初步探讨了寿胎丸治疗POI复杂的作用机制[47]。本研究发现，POI的发病涉及多种反应机制，如氧化应激、细胞凋亡、免疫反应等，寿胎丸对POI的作用主要通过提高机体抗氧化能力，抑制细胞凋亡等发挥治疗作用，并激发与卵巢发育有关的mRNA及相关蛋白的表达，发挥拟雌激素样作用，刺激原始卵泡和卵母细胞的生长发育，从而延缓卵巢衰老，维持其正常生理功能。虽然通过活性成分-疾病靶点-信号通路网络图可以清楚表明寿胎丸复杂的作用机制，但缺乏相关研究，对于各靶点、信号通路之间关系的阐述不够充分，且由于中药复方之间化学成分的复杂作用机制尚不明确，故本研究具有一定的局限性。同时，除现有已经明确的对POI有治疗效果的活性成分及信号通路外，本研究还发现了其他潜在成分（精氨酸、芝麻素等）、靶点（EGF、JUN等）及信号通路（Jak-STAT、IBD等），为POI后续研究、临床药物的使用及相关治疗药物的研发提供了一定参考。
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（2021-01-20收稿 责任编辑：魏庆双）
关键词 寿胎丸;早发性卵巢功能不全;网络药理学;活性成分;靶点;信号通路;作用机制
Abstract Objective：To investigate the network pharmacology of Shou Tai Pills in the treatment of premature ovarian insufficiency.Methods：Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform（TCMSP），Bioinformatics Analysis Tool for Molecular mechanism of Traditional Chinese Medicine（BATMAN-TCM） and GeneCards database were used to obtain the active ingredient and disease targets of Shou Tai Pills; Venn online tools were used to screen both intersection genes; relying on the STRING database，Cytoscape 3.7.0 software were used to build active ingredient-targets between network diagram and the target protein-protein interaction（PPI） network diagram; Gene ontology（GO） enrichment analysis and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG） pathway enrichment analysis were performed on the intersection genes by David database，and a network diagram of active ingredients-target-key pathway was constructed to demonstrate the relevant mechanism of Shou Tai Wan in the treatment of premature ovarian insufficiency.Results：A total of 21 active components，591 components targets and 2 438 disease targets were screened out，the main compounds were quercetin，lysine，etc.A total of 67 overlapping genes were obtained，suggesting that Shou Tai Wan may act through catalase（CAT），epidermal growth factor（EGF） and other targets.GO analysis results showed that the biological process of Shou Tai Wan was mainly drug reaction，the cell component was mainly heme binding reaction，and the molecular function was mainly concentrated in mitochondrial matrix.The major related signaling pathways involved are hypoxia inducible factor 1（HIF-1） signaling pathway and phosphatidylinositol 3 kinase/protein kinase B（PI3K-AKT） signaling pathway.Conclusion：A variety of active ingredients of Shou Tai Pills may act on CAT，EGF and other related targets，and play a role in the treatment of premature ovarian insufficiency through HIF-1，PI3K/AKT and other major signaling pathways. Keywords Shou Tai Pills; Premature ovarian insufficiency; Network pharmacology; Active ingredients; Target; Signal path; Action mechanism
中图分类号：R285文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.18.003
早发性卵巢功能不全（Premature Ovarian Insufficiency，POI）是指女性在40岁前出现的一种生殖内分泌疾病，具有代谢紊乱和生殖障碍的特征。常伴有月经紊乱、生育力下降、烦躁失眠、潮热汗出及性欲减退等，其发病与卵巢衰老过程有关，根据欧洲人类生殖与胚胎学会（ESHRE）专家共识所规范的诊断标准，当月经稀发或停经大于4个月，且伴有至少2次血清基础卵泡刺激素（FSH）>25 IU/L（间隔>4周）或一次性FSH>40 IU/L即可诊断POI。POI的发病率为1%～5%，发病原因暂不明确，可能与遗传、免疫、心理、医源性因素和环境感染等有关。目前，POI的主要治疗方法为激素替代治疗（HRT），其他辅助方法有免疫治疗、干细胞治疗、促生育治疗、基因治疗等[1]，虽然在短期治疗中有一定的临床疗效和优点，但在技术方法和相关伦理道德的标准上具有一定的局限所在。
中医学无此病名，但根据早发性卵巢功能不全的主要特征，可以将其归于“月经过少”“闭经”“不孕”“经断前后诸症”等病的范畴。《黄帝内经》载：“女子七岁，肾气盛……七七，任脉虚，太冲脉衰，天癸竭，地道不通，故形坏而无子也。”《傅青主女科》曰：“经水出诸肾。”中医认为，肾为先天之本，主司人体生长发育与生殖，调控着女子月经来潮及养精种子，是故肾气充盛，则天癸盛，肾气衰少，则天癸竭。故历代医家认为早发性卵巢功能不全的发生总归于肾虚，导致肾-天癸-冲任-胞宫轴功能失衡，兼以脾虚、气血两虚、肝郁、血瘀、痰浊等，从而致病。故临床多以补肾为基本法，以治肾为要，辅以疏肝健脾、活血化瘀等，从扶正补虚这一角度治疗POI。
寿胎丸是治疗胎漏、胎动不安的经典方剂，由菟丝子、续断、桑寄生、阿胶组成，源于清代名医张锡纯《医学衷中参西录》，具有补肾、固冲、安胎之效。方中菟丝子为补肾安胎之要药，故重用为君;臣以续断、桑寄生补益肝肾，调理冲任;佐使血肉有情之品阿胶以滋养阴血，使冲任血旺，共奏补肾固冲安胎之效。临床常使用寿胎丸治疗相关妇科疾病，并具有一定疗效[2]，但其作用机制尚不明确，缺乏现代药理学依据，此外中药及其复方成分的复杂性也是制约系统研究其具体活性成分及相关信号通路、靶点的关键因素。网络药理学是网络数据挖掘及分析的一种方法，基于现代生物信息技术，通过对药物、活性成分、作用靶点、疾病间的相互关系，发掘及阐述中药治疗相关疾病的潜在作用机制，在中医证候、方剂配伍规律及不良反应等方面的研究中发挥积极作用，其能从客观角度帮助我们进行中医药的研究[3]。故本研究将通过网络药理学方法探讨寿胎丸治疗POI的作用机制，为其提供基础生物学信息依据，对临床治疗POI提供新的思路。
1 资料与方法
1.1 寿胎丸活性成分及靶点蛋白的筛选 利用TCMSP（http：//tcmspw.com/tcmsp.php），搜索菟丝子、续断、桑寄生的主要化学成分，对比药物动力学参数（ADME），将其标准设定为口服生物利用度（OB）≥30%、类药性（DL）≥0.18，初步挑选寿胎丸的潜在药物活性化合物，依托BATMAN-TCM数据库（http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）检索与阿胶相关的有效化学成分，以相关阈值Score cutoff≥20，P值≤0.001作为限定条件初步筛选阿胶活性化合物。选取具有明确作用靶点的活性成分作为寿胎丸候选活性化合物，同时，提取它们的蛋白质靶点，并通过UniProt数据库（https：//www.uniprot.org/）规范靶点蛋白名称。
1.2 POI相关靶点的筛选 在GeneCards数据库（https：//www.genecards.org/）中检索与早发性卵巢功能不全疾病相关的靶点基因，并记录靶点基因的Score值，将Score值大于中位值的目标靶点作为早发性卵巢功能不全的候选靶点。
1.3 构建寿胎丸主要活性成分-疾病靶点网络图 为明确寿胎丸活性成分靶点与早发性卵巢功能不全疾病靶点间的关系，将已获得的寿胎丸活性成分靶点与POI疾病靶点，利用Venn在线工具（http：//bioinformatics.psb.u-gent.be/webtools/Venn/）繪制韦恩图，获得交集基因。将其通过Cytoscape 3.7.0软件可视化展示寿胎丸主要活性成分-疾病靶点网络图。
1.4 构建寿胎丸与POI交集基因的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络 将交集基因导入STRING数据库（https：//string-db.org），将生物种类设定为“Homo Sapiens”，最小相互作用阈值设定为“medium confidence>0.4”，同时隐藏游离点，其余设置均为默认，构建PPI网络图，并通过Cytoscape3.7.0软件进行可视化展示。
1.5 交集基因的富集分析 为阐明寿胎丸治疗早发性卵巢功能不全靶点在信号通路中的作用，利用DAVID数据库（https：//david.ncifcrf.gov/），对所提取的交集基因进行基因本体（Gene Ontology，GO）富集分析和京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析，设定P<0.001，P值越小，则富集结果显著性越高，将GO及KEGG分析结果的P值由小到大排序，并将分析结果通过微生信在线作图平台（http：//www.bioinformatics.com.cn/）进行可视化展示。 1.6 构建活性成分-靶点-关键通路网络图 将KEGG通路富集分析中前15条关键通路与寿胎丸的活性成分、作用靶点相对应，通过Cytoscape3.7.0软件构建相关网络图，直观地展现寿胎丸治疗早发性卵巢功能不全的复杂网络关系，阐述寿胎丸对治疗早发性卵巢功能不全的潜在作用机制。
2 结果
2.1 寿胎丸有效活性成分及作用靶点蛋白的筛选结果 通过TCMSP及BATMAN-TCM数据库检索获得菟丝子活性成分11个，桑寄生活性成分2个，续断活性成分8个，阿胶活性成分3个，合并去重后获得寿胎丸活性成分21个。见表1。并通过TCMSP查询这21个活性成分作用的靶点信息，合并去重后得到寿胎丸的靶点数目为591个，将其通过UniProt数据库经行规范化命名，最终得到寿胎丸的相关基因靶点。
2.2 POI靶点的收集结果 通過GeneCards数据库获取“POI”及“Primary Ovarian Insufficiency”的相关靶点基因，共得到POI靶点基因5 092个，Primary Ovarian Insufficiency靶点基因227个，将靶点基因Score值从小到大排列，取其中位数4.57，将其大于4.57的靶点基因选取，合并去重后得到POI相关靶点基因2 438个。
2.3 寿胎丸主要活性成分-疾病靶点图的构建结果 利用Venn在线工具绘制韦恩图，可以得到其交集基因67个，将其交集基因对比寿胎丸活性成分作用靶点，可以得到寿胎丸的有效活性成分数目为6个。见图1。通过Cytoscape3.7.0软件，导入寿胎丸、活性成分、交集基因、POI的相关信息，制作活性成分-疾病靶点网络图。见图2。以节点表示药物、活性成分、疾病和交集基因，节点之间的以边相连;活性成分-疾病靶点网络包含节点75个，其中药物节点1个，疾病节点1个，活性成分节点6个，靶点基因节点67个，寿胎丸有效活性成分与靶点基因的边106条，活性物质节点连接度平均值为17.7，节点度值越大，表示该节点在网络中的地位越重要。故选取节点连接度大于平均值的活性成分作为候选，其中最高的是槲皮素（Quercetin，节点连接度为56），其次是赖氨酸（Lysine，节点连接度为36）。这表明它们在活性成分-疾病靶点网络图占有核心地位，故此可预测槲皮素和赖氨酸是寿胎丸治疗POI的主要活性成分。
2.4 PPI网络的构建及分析结果 寿胎丸活性成分与早发性卵巢功能不全交集基因的PPI网络图。见图3。该网络图含节点67个，节点度值越高，颜色越深。经软件分析可得平均节点度值为7.82，选取节点度值最多的前20个靶点基因作为其核心基因。见图4。寿胎丸可能通过过氧化氢酶（CAT）、表皮生长因子（EGF）、内皮型一氧化氮合酶（NOS3）、激活蛋白1（JUN）等关键靶点发挥治疗POI的作用。
2.5 交集基因的富集分析
2.5.1 GO功能富集 将交集基因导入DAVID数据库进行GO分析，共得到相关条目258个，其中生物过程（BP）199个，细胞组分（CC）22个，分子功能（MF）37个，主要涉及药物反应、血红素结合反应等，其主要集中在线粒体基质。见表2、图5。
2.5.2 KEGG通路富集分析 将寿胎丸和早发性卵巢功能不全的交集基因通过DAVID数据库进行富集分析，导出分析结果，共得到63条KEGG信号通路，将其中P值最小的前15条信号通路作为寿胎丸治疗POI的主要信号通路。见表3。并通过微生信在线作图平台进行可视化展示。见图6。图中P值代表该信号通路的富集程度，P值越小，则富集程度越大，颜色越红，反之P值越大则富集程度越小，颜色越绿。气泡的大小代表所富集的基因个数。参与寿胎丸治疗作用的信号通路主要有HIF-1信号通路、精氨酸生物合成（Arginine biosynthesis）信号通路、PI3K-AKT信号通路、炎症性肠病（Inflammatory Bowel Disease）信号通路、非受体酪氨酸激酶家族（JAK-STAT）信号通路等。由此可见，寿胎丸是通过多靶点，多通路来干预POI从而达到治疗目的。
2.6 活性成分-靶点-信号通路网络图构建结果 将前面得到的寿胎丸活性成分、潜在作用靶点及KEGG筛选出来的前15条信号通路一一对应，经Cytoscape3.7.0软件制作活性成分-靶点-关键通路图。见图7。寿胎丸治疗POI涉及多个活性成分、靶点及信号通路。主要活性成分包含槲皮素、赖氨酸等，主要靶点为CAT、JUN、EGF、NOS3等，涉及的主要信号通路有HIF-1、PI3K-AKT、炎症性肠病、精氨酸生物合成、JAK-STAT信号通路等。见图7。
3 讨论
近年来早发性卵巢功能不全的发病率逐渐上升，增加了如骨质疏松、糖尿病、高血压及心脑血管等疾病的发生风险，严重影响了育龄期妇女的身心健康及生命质量。ESHRE将“原发性”改为“早发性”[1]，为的是及时对POI作出早期诊断及早期治疗。现国内外治疗POI的主要方法为HRT，通过补充体内所缺乏的性激素，调节下丘脑-垂体-卵巢（HPO）轴的功能起到一定作用，但停药后常易反复，并增加乳腺癌、子宫内膜癌、中风等相关疾病的发病危险，在POI的长期治疗及管理中存在一定缺陷，且具有一定的禁忌证[4]。其他辅助治疗方法虽具有一定优势，但其治疗方法较为复杂，所需费用也较多，且存在一定的伦理问题，临床上对此类方法的应用较为有限。中药对调节女性内分泌功能颇有疗效，有研究发现中药可以通过其拟雌激素作用及调节内分泌功能促进卵巢功能的恢复[5]，维持肾-天癸-冲任-胞宫轴功能的平衡，这与现代医学HRT治疗早发性卵巢功能不全有着一定的趋同性，且较之不良反应低，花费少，故在临床上更易被患者所接受。对于治疗POI的长期管理更具优势。寿胎丸是治疗妇科疾病的常用基础方之一，具有补肾固冲助孕安胎之功，现代药理学研究显示，菟丝子的主要药理学作用包括抗氧化、抗衰老、抑制细胞凋亡、调节内分泌、改善生殖功能等[6]，桑寄生的主要药理作用有抗氧化、降血糖、降血脂等[7]，续断的主要药理学作用包括抗衰老、保护神经等[8]，阿胶的主要药理作用有抗氧化、增强免疫、抗疲劳等作用[9]。由于生育力降低贯穿POI的全过程，故对四者合方的寿胎丸治疗POI的研究具有一定的现实意义。相关研究发现寿胎丸在临床上治疗流产、不孕、月经病等妇科相关疾病疗效较好[2]，但其相关配伍和药理学研究较少，因此本研究通过网络药理学的相关技术及方法，基于现代生物信息数据，对寿胎丸治疗早发性卵巢功能不全的潜在作用机制进行一定的深入研究。 3.1 寿胎丸活性成分与相关靶点的分析 本研究共筛选出寿胎丸潜在活性成分21种，其中部分化合物已通过研究证实具有调节卵巢功能、延缓其衰老的作用。寿胎丸的核心化学物质槲皮素具有抗氧化、抗炎等药理作用[10]，黄长盛等[11]发现，槲皮素具有拟雌激素活性，对卵巢功能衰退的小鼠有一定的治疗效果，同时也可以改善卵泡质量，促进各级卵泡的发育及卵巢颗粒细胞的增殖，增加体内雌二醇（E2）的分泌，升高AMH数值，减少FSH、黄体生成素（LH）的含量，进而恢复卵巢功能。雌激素缺乏会导致钙的流失，故POI患者都或多或少伴随着骨密度的降低。闵珺[12]发现槲皮素可以有效改善去卵巢小鼠的骨代谢，通过抑制破骨细胞对骨基质的吸收，增强成骨细胞分化活性，从而提高骨密度，从根本上改善因雌激素缺乏导致的骨质疏松的症状。有研究发现，在一定條件下可以通过补充槲皮素来减少卵巢颗粒细胞凋亡，增高CAT等抗氧化物质的含量，提高机体抗氧化能力，减轻卵巢组织氧化损伤，进而维持原始卵泡正常形态，保护卵巢功能[13]。寿胎丸的另一个核心化合物质——赖氨酸，是维持正常生命功能的人体必需氨基酸之一，具有增强免疫、促进发育、营养神经等功能。阿孜古丽·要力瓦斯[14]通过实验发现赖氨酸可以通过增强卵巢早衰小鼠的免疫力来改善卵巢功能，缓解卵巢功能衰退的进程。Yang等[15]发现赖氨酸可以促进卵泡的发育，提高E2含量，增强卵泡支持卵母细胞成熟的能力。本研究发现，槲皮素及赖氨酸在其网络图中具有重要地位，这表明这2种化合物在寿胎丸维持卵巢功能，延缓其衰老的治疗过程中起着主要作用，其他化合物如精氨酸（Arginine）、芝麻素（Sesamin）等起到辅助作用。这几种物质可能是寿胎丸治疗POI的主要有效成分，但目前对于这几种活性成分的研究较少，缺少对其具体的相关作用机制、作用途径的研究，故有待我们进一步的研究探讨。本研究发现，寿胎丸可能通过CAT、EGF、JUN、NOS3等关键靶点发挥治疗作用，早发性卵巢功能不全的发生有多靶点、多生物过程及多信号通路的参与。目前相关研究发现，CAT是细胞叉形头转录因子1（FoxO1）信号通路的下游靶点，参与细胞的氧化应激（OS）、细胞凋亡过程，当卵巢发生再灌注损伤导致OS发生时，CAT含量的增加会增强卵巢抗氧化能力，减轻OS对卵巢的破坏，抑制细胞凋亡，并提高成骨细胞的增殖，延缓骨质疏松，当CAT含量异常时，则会导致卵泡的凋亡，造成卵巢功能衰竭，并导致骨密度的下降[16-18]。EGF是一种小分子多肽，其正常表达可以激活细胞外信号调节蛋白激酶（ERK1/2）、PI3K等下游信号通路，并协同FSH，有效降低卵巢颗粒细胞的凋亡，减轻卵巢颗粒细胞的损伤，并增强机体抗氧化能力，为卵母细胞的生长、成熟及发育提供一个适当的环境，有保护卵巢颗粒细胞及卵母细胞的作用[19-21]，从而促进E2的分泌，维持卵巢功能[22]。目前研究发现JUN在细胞生长发育、细胞凋亡、免疫调节等方面发挥重要作用，但相关研究较少，其作用机制尚未明确[23]。由于POI的发病可能与自身免疫类疾病有关，如甲减患者中抗甲状腺抗体会引起卵巢功能受损[24]，原发性慢性肾上腺皮质功能减退症患者抗肾上腺皮质抗体阳性会导致卵巢功能的衰退[25]，故猜测JUN可能是通过促进卵巢颗粒细胞的生长发育、抑制细胞凋亡、调节自身相关免疫系统疾病的相关过程，起到间接治疗POI的作用。Taguchi等[26]发现NOS3的正常表达可以在一定程度上改善子宫内膜容受性，提高子宫内膜局部组织的血供，利于胚胎着床，增加妊娠概率，从而改善早发性卵巢功能不全患者的生育功能。由此可见，寿胎丸可能通过以上核心靶点，通过增强细胞抗氧化能力、减轻细胞凋亡，调节免疫、促进生育等方面来发挥治疗POI的作用。
3.2 寿胎丸GO功能富集分析 寿胎丸治疗POI涉及多种生物过程、细胞组分及分子功能。生物过程主要涉及药物反应、脂多糖反应、过氧化氢生物合成、过氧化氢反应等。其中，过氧化氢反应与POI的发生有着密切关系。相关研究发现，FSH具有调节窦卵泡抗氧化应激的能力，其含量与总氧化剂状态、OS指数正相关，当FSH上调的抗氧化防御机制失衡而撤退，或暴露于活性氧（ROS）时，ROS会进一步通过OS过程激活下游信息分子，引起卵泡闭锁，降低卵泡质量及数量，同时，体内过多的过氧化氢会严重抑制LH的敏感性及类固醇的产生，通过影响体内类固醇代谢导致机体甾体合成途径受阻，导致颗粒细胞分泌E2减少，从上游进一步导致卵巢功能的破坏[27-30]。当机体处于OS状态时，通过添加抗氧化物质可以显著提高CAT、超氧化物歧化酶（SOD）活性，降低卵巢ROS水平，从而保护卵巢的正常功能，减少POI的发生[31-32]。细胞组分主要与血红素结合反应相关，该反应通过血红素结合蛋白（Hpx）的表达来起到抗氧化、调节免疫反应、调控信号通路的作用[33]。由于卵巢中含有丰富的血供，Hpx在血液中可以诱导相关酶的基因表达，钝化ROS，并通过其降解产物如胆绿素等来调节OS[34]，另一方面，在血红素促脂质过氧化反应过程，Hpx复合物可以阻断其反应发生，从而有效减少血红素带来的细胞氧化损伤[35]。邓玉洁等[36]发现多芳香烃暴露对卵巢颗粒细胞基因表达、生长发育和细胞间的信号转导等有影响，可损伤卵母细胞并使生长卵泡发生闭锁，导致组织发生损伤效应，而Hpx的表达会随多环芳烃暴露程度的加重而增加，故可以检测Hpx指标来作为机体化学暴露的指标之一，对预测POI的发生提供了相关指标[37]。分子功能的发生主要集中在线粒体基质，线粒体功能的异常常伴随着人类疾病及衰老的发生，同时也是细胞氧化应激发生的主要场所。相关研究发现线粒体功能异常与卵巢衰老密切相关，当卵巢衰老过程发生时，常伴随着卵母细胞线粒体功能及结构的异常[38]。王博[39]通过实验发现线粒体受外来化学物质干扰时，其膜电势会降低，同时抑制线粒体复合物I的活性，诱导线粒体发生氧化应激，破坏卵巢功能，而补肾中药可以有效改善POI小鼠卵母细胞线粒体形态、数量、分布及其活力水平，调节激素水平和氧化应激反应，进而恢复卵巢功能[40]，所以可以通过改善线粒体功能，增加线粒体数量来维持卵母细胞的正常功能，延缓POI的发生。以上均表明，寿胎丸治疗POI可能涉及多种生物过程、细胞组分及相应分子功能。 3.3 关键信号通路的相关机制分析 HIF-1信号通路是POI的核心通路之一。HIF-1是组织细胞缺氧状态下广泛存在的一种转录因子，在机体氧化应激过程中起着关键作用。HIF-1信号通路可以由HIF-1的异常表达而被激活，从而诱导卵巢中HIF-1αmRNA和蛋白表达的增加，并特异性表达于卵巢颗粒细胞，且与雌激素受体的表达正相关，而雌激素受体主要存在于卵囊泡膜细胞，这表明HIF-1信号通路可能直接作用于卵巢[41-42]。相关研究表明，温经汤可以参与OS过程，纠正局部组织缺氧状态，调控HIF-1信号通路的表达，防止卵巢早衰[43]。PI3K-AKT信号通路是广泛表达于机体各处的基础信号通路之一，同时也是细胞增殖、凋亡最主要的传导通路之一。有研究发现，卵母细胞中存在大量的PI3K和AKT，PI3K-AKT信号通路参与调节卵母细胞生长、原始卵泡发育以及颗粒细胞的增殖、分化[44]。当其正常表达时，可以促进颗粒细胞的增殖，维持卵巢的正常功能，同时也能与分布在卵巢颗粒细胞的特异性受体结合，增加雌孕激素的分泌，延缓其衰老。当PI3K受到缺氧、细胞因子等细胞外信号刺激时可被过度激活，进而诱导AKT，通过调控其下游哺乳动物雷帕霉素（mTOR）来诱导卵母细胞的闭锁，而如果PI3K的信号终止，也可引起原始卵泡的提前发育，使其过快凋亡，从而导致POI的发生[45-46]。
本研究基于网络药理学相关方法，将现代生物学信息技术与传统中医药理论相结合，对寿胎丸组成药物的化合物、有效活性成分、靶点、疾病靶点及信号通路进行分析，运用相关数据库及信息软件构建活性成分-疾病靶点网络图，直观体现了寿胎丸治疗POI是通过多成分、多靶点的方式发挥其功效，同时PPI网络图也反映了该药治疗POI相关各靶点间的联系程度，并结合GO富集分析与KEGG信号通路分析，初步探讨了寿胎丸治疗POI复杂的作用机制[47]。本研究发现，POI的发病涉及多种反应机制，如氧化应激、细胞凋亡、免疫反应等，寿胎丸对POI的作用主要通过提高机体抗氧化能力，抑制细胞凋亡等发挥治疗作用，并激发与卵巢发育有关的mRNA及相关蛋白的表达，发挥拟雌激素样作用，刺激原始卵泡和卵母细胞的生长发育，从而延缓卵巢衰老，维持其正常生理功能。虽然通过活性成分-疾病靶点-信号通路网络图可以清楚表明寿胎丸复杂的作用机制，但缺乏相关研究，对于各靶点、信号通路之间关系的阐述不够充分，且由于中药复方之间化学成分的复杂作用机制尚不明确，故本研究具有一定的局限性。同时，除现有已经明确的对POI有治疗效果的活性成分及信号通路外，本研究还发现了其他潜在成分（精氨酸、芝麻素等）、靶点（EGF、JUN等）及信号通路（Jak-STAT、IBD等），为POI后续研究、临床药物的使用及相关治疗药物的研发提供了一定参考。
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（2021-01-20收稿 责任编辑：魏庆双）